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方法文章

通过离心重力诱导脂肪源性干细胞的软骨分化

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DOI：

10.3791/54934

⸱

2017年2月24日

 ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary’s Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

本文内容

摘要

机械应力可诱导干细胞的软骨向分化，为受损软骨的修复提供了一种潜在的治疗策略。本文介绍了一种利用离心重力（CG）诱导脂肪来源干细胞（ASCs）向软骨细胞分化的实验方案。由离心重力诱导的SOX9表达上调可促进软骨向表型的形成。

摘要

受损的软骨无法自然愈合。目前，治疗软骨缺损最先进的疗法是利用细胞因子诱导干细胞分化为软骨细胞，再进行软骨细胞移植。然而，细胞因子诱导的软骨向分化成本高、耗时长，且在分化过程中存在较高的污染风险 体外 分化。然而，生物力学刺激也是软骨生成的关键调控因素。例如，机械应力可诱导干细胞向软骨细胞分化，提示其在受损软骨修复中具有潜在治疗价值。本研究中，我们证明离心重力（CG，2,400 × g）——一种通过离心易于施加的机械应力——可上调脂肪源性干细胞（ASCs）中性别决定区Y框蛋白9（SRY-box 9, SOX9）的表达，从而促使这些细胞呈现软骨细胞表型。经离心处理的ASCs表现出更高的软骨分化标志物表达水平，如聚集蛋白聚糖（aggrecan, ACAN）、II型胶原α1链（collagen type 2 alpha 1, COL2A1）和I型胶原（collagen type 1, COL1），而X型胶原（collagen type 10, COL10）——肥大软骨细胞的标志物——的表达水平则较低。此外，在经离心处理的ASCs中观察到软骨细胞聚集体的形成，这是软骨生成的前提条件。

引言

关节软骨缺损无法自然愈合。因此，干细胞移植被认为是一种具有前景的修复受损软骨的方法。然而，该方法需要获取足够数量的干细胞，并诱导这些细胞进行软骨形成分化。骨髓（BM）已被广泛用作干细胞来源，但从骨髓中分离细胞存在两个主要缺点：侵入性强且产量不足。由于脂肪组织易于获取，因此是更理想的干细胞来源。先前的研究已证明，可以从脂肪组织中分离干细胞，并使用细胞因子（如TGF-β11,2）诱导这些细胞发生软骨形成分化。这些方法虽然有效，但成本较高。

与细胞因子相比，机械应力是一种成本较低的诱导软骨分化的方法。机械负荷在维持关节软骨健康方面起着关键作用3，并可在多种细胞中诱导软骨细胞表型。例如，静水压可通过MAP激酶/JNK通路诱导滑膜来源祖细胞产生软骨细胞表型4，而机械压缩可通过上调软骨细胞基因在人源间充质干细胞（MSCs）中诱导软骨形成5。此外，剪切应力有助于促进人源间充质干细胞中与软骨形成相关的细胞外基质（ECM）的表达6。离心重力（CG）是一种通过离心产生的易于施加和控制的机械应力，可诱导细胞中差异性基因表达7。例如，在肺上皮癌细胞中，离心可上调白细胞介素（IL）-1b的表达8。因此，作为一种可实验性施加的机械刺激，CG可用于诱导干细胞中软骨细胞相关基因的表达。然而，目前尚不清楚CG是否能够诱导干细胞的软骨向分化。

本研究中，我们发现CG可诱导人脂肪源性干细胞（ASCs）中软骨形成的主要调控因子SOX9的上调，从而导致软骨细胞基因的过表达。此外，我们将CG对软骨形成的影响与最常用于诱导软骨分化的生长因子TGF-β1的作用进行了比较 体外 干细胞中的软骨形成

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方案

本研究方案经韩国天主教大学机构审查委员会批准（KC16EAME0162），并依照美国国立卫生研究院（NIH）指南进行。所有组织均在获得书面知情同意后获取。

1. 离心重力加载与团块培养

  1. 细胞培养与收获
    1. 将ASCs（P2-P3；参见材料列表）在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的低糖杜氏改良伊格尔培养基（DMEM-LG）中，于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中进行培养。
    2. 当细胞达到80%融合度时，弃去培养基，并用5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
    3. 加入1 mL含1 mM EDTA的PBS，于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中孵育2分钟。
    4. 轻轻敲击培养板，加入4 mL新鲜培养基，将细胞转移至15 mL锥形管中，并在室温（RT）下以250 × g离心2分钟。
  2. 离心重力加载
    1. 离心后（步骤1.1.4），小心弃去上清液，避免扰动沉淀，将沉淀重悬于10 mL含10% FBS的DMEM-LG中，使用血细胞计数板对细胞进行计数。
    2. 进行CG加载时，将2.5 × 105个细胞转移至新的15 mL锥形管中，并在2,400 × g下离心15分钟。
  3. 细胞团培养
    1. 离心后立即吸除上清液，加入500 µL特定的软骨诱导分化培养基（CDM，即高糖DMEM，添加1% FBS、1% ITS+预混液、100 nM地塞米松、1× MEM非必需氨基酸溶液、50 µg/mL L-脯氨酸和1%青霉素/链霉素）。每次更换培养基时均加入50 µg/mL新配制的L-抗坏血酸-2-磷酸。作为阳性对照，通过加入含10 ng/mL TGF-β1的CDM诱导未离心细胞的软骨分化。
    2. 将装有细胞团且管盖松开的锥形管直立放置，在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中孵育。
    3. 每隔一天更换一次培养基，持续3周。
  4. 微团培养
    1. 离心后（步骤1.2.2；2,400 × g离心15分钟），立即吸除上清液，将沉淀重悬于10 µL CDM中。
    2. 为形成微团，将重悬的细胞置于24孔板每孔中央。
    3. 2小时后，小心向孔中加入1 mL CDM，沿孔壁吹加以避免破坏微团。作为阳性对照，使用未离心的细胞进行微团培养，并加入含10 ng/mL TGF-β1的CDM。
    4. 将微团在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中孵育。
    5. 每隔一天更换一次培养基，持续3周。

2. 逆转录酶-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测软骨分化标志物的转录水平上调

  1. 第14天，使用移液器将类球体沉淀转移至新的1.5 mL离心管中，并用1×PBS洗涤。
  2. 采用硫氰酸胍-酚-氯仿法从沉淀中提取总RNA9。
  3. 根据制造商说明书，使用逆转录酶将2 µg总RNA反转录为cDNA（在42 °C孵育1小时，随后在70 °C灭活酶5分钟）。
  4. 使用针对软骨分化标志物的特异性引物进行PCR扩增10。

3. 染色检测软骨分化标志蛋白的过表达

  1. 石蜡包埋细胞团块
    1. 第21天，使用移液器收集类球体团块，并用1×PBS洗涤。
    2. 将类球体团块浸入4%多聚甲醛中固定24小时。
      注意：多聚甲醛具有高毒性。避免接触眼睛、皮肤或黏膜。在配制过程中应尽量减少暴露，避免吸入。操作时需佩戴适当的个人防护装备。
    3. 弃去固定液，并用去离子水（DW）冲洗细胞团块。
    4. 在包埋盒上铺一层纱布，用移液器将固定的团块转移至纱布上，折叠纱布覆盖团块后盖上包埋盒盖子。
    5. 脱水处理团块。
      1. 将团块在70%乙醇（EtOH）中浸泡5分钟，室温。
      2. 将团块在80% EtOH中浸泡5分钟，室温。
      3. 将团块在95% EtOH中浸泡5分钟，室温。
      4. 将团块在100% EtOH中浸泡5分钟，室温。重复两次。
      5. 将团块在100%二甲苯中浸泡15分钟，室温。重复两次。
    6. 将固定的细胞团块置于56 °C的模具中进行石蜡包埋；也可使用专用的自动化组织处理系统完成包埋。
    7. 使用旋转式切片机从石蜡包埋的细胞团块上切下厚度为5 µm的切片。
    8. 将切片放入50% EtOH中漂浮，然后用载玻片转移至50 °C的水浴中。
    9. 将漂浮的切片展平并贴附于载玻片上。
  2. 番红O与阿利新蓝染色
    1. 复水石蜡切片。
      1. 将载玻片浸入二甲苯中15分钟。重复两次。
      2. 将载玻片浸入100% EtOH中5分钟。重复两次。
      3. 将载玻片浸入90% EtOH中5分钟。
      4. 将载玻片浸入80% EtOH中5分钟。
      5. 将载玻片浸入70% EtOH中5分钟，然后用1×PBS洗涤。
    2. 用1%番红O溶液和3%阿利新蓝对复水后的切片染色30分钟。
    3. 弃去染色液，并用去离子水冲洗切片。
    4. 用苏木精/伊红溶液（复染剂）对切片染色1分钟。
    5. 弃去染色液，并用去离子水冲洗切片。
    6. 去除盖玻片上残留的水分后，滴加一滴封片剂。小心地将载玻片（细胞面朝下）放置在含有封片剂的盖玻片上。
    7. 在室温下干燥载玻片2–3小时。
    8. 使用明场显微镜（自动直立显微镜，50倍和200倍）采集图像。
  3. 免疫荧光检测
    1. 按照第3.2.1节所述方法对切片进行复水处理。
    2. 将载玻片浸入柠檬酸钠缓冲液（10 mM柠檬酸钠，0.05% Tween 20，pH 6.0）中，使用微波炉加热至接近沸腾并维持10分钟。
    3. 在室温下冷却20分钟，然后用自来水冲洗。
    4. 将载玻片在3% H2O2（溶于1×PBS）中孵育15分钟，随后用自来水冲洗15分钟11。
    5. 用封闭液（含10%正常山羊血清的PBS）封闭载玻片1小时。
    6. 吸除封闭液，然后将用5%正常山羊血清稀释的一抗溶液加至载玻片上。
    7. 在4 °C下孵育过夜。
    8. 用1×PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。
    9. 在避光条件下，室温下用含5%正常山羊血清稀释的荧光素标记二抗溶液孵育载玻片1小时。
    10. 在避光条件下，用1×PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。
    11. 用DAPI（1 µg/mL）孵育载玻片10分钟，然后用1×PBS洗涤两次，每次5分钟。
    12. 去除盖玻片上残留的水分后，滴加一滴封片剂。小心地将载玻片（细胞面朝下）放置在含有封片剂的盖玻片上。
    13. 在室温、避光条件下干燥2–3小时。
    14. 使用荧光显微镜观察（Rhod：594 nm，DAPI：340 nm；60倍和200倍放大倍数）12。

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结果

离心重力诱导脂肪源性干细胞中软骨细胞分化标志物的过表达。

为了确定适合诱导软骨分化作用的离心重力大小，将ASCs分别在不同强度的离心重力（0、300、600、1,200 和 2,400 × g）条件下刺激15分钟。刺激后，将ASCs重新接种至培养板中，并继续培养24小时。如图1A所示，在2,400 × g条件下，SOX9 mRNA的表达显著升高，约为未施加离心重力（对照组，即未受离心重力加载的ASCs）的1.5倍。为验证离心重力是否可诱导软骨分化，我们分别采用离心重力加载或TGF-β1处理对ASCs进行刺激；作为阴性对照，ASCs在无任何刺激条件下培养。在培养第14天收集样本，并进行qRT-PCR分析。如图1所示，COL2A1 mRNA（一种典型的软骨分化标志物）在经离心重力刺激的ASCs中表达上调，高于对照细胞（未受刺激的ASCs）。离心重力刺激引起的COL...

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讨论

细胞的干性状态对于CG诱导SOX9过表达至关重要。在本研究中，CG可在早期传代的ASCs（第2-3代）中诱导SOX9表达，但在后期传代的ASCs中则不能。已有报道指出，在培养过程中，ASCs中的CD34+细胞可维持至第3代16。随着传代次数增加，ASCs倾向于失去CD34的表达，从而导致对CG的反应性降低。

利用离心重力，可在离心重力（CG）刺激期间将流体静压力施加于细胞。因此，培养基的体积可能是影响 SOX9 诱导的因素之一。为了在每次实验中保持均匀的流体静压力环境，每 1 × 105 个细胞在 15 mL 离心管中使用 1 mL 培养基。此外，使用摆桶式转子以对细胞均匀施加 CG（通过形成直角）。

与TGF-β1相比，CG在诱导ASCs中SOX9及软骨形成标志物表达方面能力较弱。这可能是该技术的一项局限性。在临床应用方面，尚需进一步研究CG刺激的ASCs是否能够将受损软骨修复至正常功能水平 体内 模型

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披露

我们声明，本研究工作不存在任何利益冲突。

致谢

本研究由韩国卫生科技研发计划资助&通过韩国保健产业振兴院（KHIDI）由保健福祉部资助的D项目 & 韩国福祉部（资助编号：HI14C2116）以及韩国天主教大学首尔圣玛丽医院研究基金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
塑料器皿
100 mm 培养皿TPP93100
60 mm 培养皿TPP93060
50 mL 离心管SPL50050
15 mL 离心管SPL50015
10 mL 一次性移液管Falcon7551
5 mL 一次性移液管Falcon7543
ASC 培养基材料
DPBSLife Technologies14190-144
DMEM 低糖Life Technologies11885-084生长基础培养基
青霉素-链霉素Sigma AldrichP43331%
胎牛血清Life Technologies16000-04410%
PBS/1 mM EDTALife Technologies12604-039
软骨分化培养基材料
DMEM 高糖Life Technologies11995软骨分化基础培养基
MEM 非必需氨基酸溶液 (100x)Life Technologies11140-050
地塞米松Sigma AldrichD2915100 nM
青霉素-链霉素Life TechnologiesP43331%
胎牛血清Life Technologies16000-0441%
抗坏血酸-2-磷酸Sigma AldrichA896050 μg/mL
L-脯氨酸Sigma AldrichP560750 μg/mL
ITSBD3543521%
人 TGFβ1Peprotech100-2110 ng/mL
材料
18 mm 盖玻片SuperiorHSU-0111580
4% 多聚甲醛Tech & InnovationBPP-9004
吐温 20BIOSESANGT1027
牛血清白蛋白Vector LabSP-5050
抗胶原 II 抗体abcam ab347121:100
山羊抗兔 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 594 标记Molecular ProbeA-110371:200
DAPIMolecular ProbeD1306
Prolong gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36934
载玻片，涂层Hyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
氯仿Sigma Aldrich366919
异丙醇Millipore109634
乙醇Duksan64-17-5
RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒Thermo ScientificK1622
i-Taq DNA 聚合酶iNtRON BIOTECH25021
UltraPure 10x TBE 缓冲液Life Technologies15581-044
loading starDyne BioA750
琼脂糖Sigma-Aldrich9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder 标记物EnzynomicsDM003
人脂肪来源干细胞 (ASCs)Catholic MASTER Cells

参考文献

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