方法文章

脂肪干细胞的软骨细胞分化诱导离心重力

DOI：

10.3791/54934

⸱

2017年2月24日

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1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary’s Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

本文内容

摘要

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机械应力可诱导干细胞的软骨形成分化，为修复受损的软骨提供潜在的治疗方法。我们提出了一种使用离心重力 （CG） 诱导脂肪来源干细胞 （ASC） 的软骨形成分化的方案。CG 诱导的 SOX9 上调导致软骨形成表型的发展。

摘要

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受损的软骨不能自然愈合。目前，治疗软骨缺损的最先进疗法是使用细胞因子移植从干细胞分化而来的软骨细胞。不幸的是，细胞因子诱导的软骨形成分化成本高昂、耗时，并且与体外分化过程中的高风险污染相关。然而，生物力学刺激也是软骨形成的关键调节因素。例如，机械应力可以诱导干细胞的软骨形成分化，这表明这是一种修复受损软骨的潜在治疗方法。在这项研究中，我们证明了离心重 （CG， 2,400 × g） 是一种容易通过离心施加的机械应力，诱导脂肪来源干细胞 （ASCs） 中性别决定区 Y （SRY）-box 9 （SOX9） 的上调，导致它们表达软骨形成表型。离心的 ASC 表达较高水平的软骨形成分化标志物，例如聚集蛋白聚糖 （ACAN） 、2 型胶原蛋白 α 1 （COL2A1） 和 1 型胶原蛋白 （COL1），但 10 型胶原蛋白 （COL10） 水平较低，这是肥厚性软骨细胞的标志物。此外，在离心的 ASC 中观察到软骨形成聚集体形成，这是软骨形成的先决条件。

引言

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在关节软骨缺损不自然愈合。因此，干细胞移植已被提出作为削弱的软骨的修复一个有前途的方法。然而，该方法需要有足够数量的干细胞的同时获取和这些细胞的诱导来进行软骨细胞分化。骨髓（BM）已被广泛使用作为干细胞的来源，但是从骨髓细胞分离有两个主要的缺点:侵袭和产量不足。因为它易于获得的，脂肪组织是干细胞的一个优选来源。以往的研究表明，从脂肪组织中分离干细胞和诱导用细胞因子，如TGF-β11,2这些细胞软骨分化的可行性。这些方法是有效的，但价格昂贵。

作为一个成本较低的替代细胞因子，机械应力可以用来诱导软骨细胞分化。机械加载在维持关节软骨3的健康至关重要的作用，并且它可以诱导各种细胞软骨表型。例如，静水压经由MAP激酶/ JNK途径4诱导滑膜衍生的祖细胞的软骨形成的表型，和机械压缩通过上调软骨基因5诱导软骨在人类间质干细胞（MSCs）。此外，剪切应力有助于软骨相关的细胞外基质（ECM）的人MSC 6的表达。离心重力（CG），离心产生很容易地应用和控制的机械应力，可诱导细胞7差异表达基因。例如，在肺上皮癌细胞，白细胞介素（IL）-1b的....

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方案

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该研究方案是根据美国国立卫生研究院的指导方针批准由韩国天主教大学（KC16EAME0162）的机构审查委员会和执行。与书面知情同意书，得到的所有组织。

1.离心重力加载和颗粒文化

  1. 细胞培养和收获
    1. 培养的ASC（P2-P3;见材料的列表）在补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素（P / S）的Dulbecco改良的Eagle氏培养基，低葡萄糖（DMEM-LG）中于37℃下在含有5％CO 2的加湿培养箱。
    2. 当细胞达到80％汇合时，丢弃培养基，用5ml 1×磷酸盐缓冲盐水的（PBS）洗涤细胞。
    3. 添加1毫升的PBS含1mM EDTA的的并在含有5％CO 2的潮湿培养箱中于37℃孵育2分钟。
    4. 轻轻敲击培养板中，添加4毫升新鲜培养基中，将细胞转移到有15毫升锥形管，并离心将细胞在250×g下在室温（RT）下2分钟。
  2. 离心重力加载
    1. 离心（步骤1.1.4）后，除去上清而不会干扰沉淀并用10％的FBS重悬在10mL的DMEM-LG的沉淀。算使用血球细胞。
    2. 对于CG装载，转移2.5×10 5个细胞到一个新的15毫升锥形管和离心机2400×g的15分钟。
  3. 团培养
    1. 立即离心后，吸出上清液，并添加定义软骨分化培养基50....

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结果

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离心重力诱导的脂肪来源的干细胞的软骨形成分化标记物的表达。

以确定的离心力重力是适于诱导软骨细胞分化的程度，携带者用15分钟不同程度的CG（0，300，600，1200，2400 XG）刺激。刺激之后，将携带者进行了重新接种到培养板和培养24小时。如在图1A中所示，SOX9 mRNA表达显著2400 xg离心增加;它是约2400 XG比（携带者未装载有CG）的控制1.5倍。要确认是否CG诱导软骨分化中，我们通过CG装载或TGF-β1处理刺激携带者。作为阴性对照，携带者是无任何刺激培养。样品收集在第14天，并进行定量RT-PCR检测。如图F中igure 1，COL2A1基因，具有代表性的软骨细胞分化的标记，在由CG相对刺激来控制细胞（未刺激的ASC）携带者上调。由CG刺激COL2A1 mRNA的上调水平相似，由TGF-β1处理诱导。另一方面，C.......

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讨论

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细胞的干性状态为SOX9的CG诱导过表达非常重要的。在我们的研究中，SOX9的表达可以通过CG在早期传代的ASC（2-3）引起的，而不是在后面通道的ASC。已经报道的是，在培养过程中，携带者包含CD34 +细胞，直至3代16。的ASCs往往失去的CD34的表达作为将细胞传代，从而产生至CG低响应。

离心重力，静水压力可以刺激CG过程中加载到细胞。因此，介质的体积可能是影响SOX9的诱导的因素之一。维护每个实验偶数静水压力的环境中，在每1×10 5个细胞用在一个15毫升管1毫升培养基。此外，摆动斗转子被用来均匀涂抹CG到细胞中（通过形成直角）。

相比，TGF-β1，CG呈现低能力诱导携带者SOX9和软骨细胞标志物的表达。这可能是这种技术的限制。对于临床应用，应当进一步研究的CG刺激的ASC是否再生软骨受损到正常功能的在体内模型中的水平。

在用生长因子，尤其是TGF-β.......

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披露

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我们声明，我们没有与这项工作相关的利益冲突。

致谢

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这项研究得到了韩国健康技术研发项目的资助，该项目通过韩国健康产业发展研究所（KHIDI）获得韩国卫生福利部（资助（资助HI14C2116）和韩国天主教大学首尔圣玛丽医院研究基金。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
塑料器皿
100 mm 培养皿TPP93100
60 mm 培养TPP93060
50 mL 角质管SPL50050
15 mL 角质管SPL50015
10 mL 一次性移液器Falcon7551
5 mL 一次性移液器Falcon7543
ASC 培养基材料
DPBSLife Technologies14190-144
DMEM 低葡萄糖Life Technologies11885-084生长基础培养基
青霉素 链霉素Sigma AldrichP43331%
胎牛血清Life Technologies16000-04410%
PBS/1 mM EDTALife Technologies12604-039
软骨形成分化培养基材料
DMEM High glucoseLife Technologies11995软骨形成分化基础培养基
MEM 非必需氨基酸溶液 （100x）Life Technologies11140-050
地塞米松Sigma AldrichD2915100 nM
青霉素 链霉素Life TechnologiesP43331%
胎牛血清Life Technologies16000-0441%
抗坏血酸-2-磷酸Sigma AldrichA896050 μg/mL
L-脯氨酸Sigma AldrichP560750 μg/mL
其BD1%
人 TGF&β;1Peprotech100-2110 ng/mL
材料
18 mm 盖玻片SuperiorHSU-0111580
4% 多聚甲醛技术和创新BPP-9004
Tween 20BIOSESANGT1027
牛血清白蛋白载体实验室SP-5050
抗胶原 II 抗体abcam ab347121：100
山羊抗兔 IgG （H+L） 二抗，Alexa Fluor 594 偶联物探针A-110371：200
DAPI分子探针D1306
延长金抗淬灭试剂InvitrogenP36934
玻片，涂层Hyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
氯仿Sigma Aldrich366919
丙醇109634
乙醇Duksan64-17-5
RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒Thermo ScientficK1622
i-Taq DNA 聚合酶iNtRON BIOTECH25021
超纯 10xTBE 缓冲液Life Technologies15581-044
加载星Dyne BioA750
琼脂糖Sigma-Aldrich9012-36-6
1 kb （+） DNA 分子量标准物酶学DM003
人脂肪来源干细胞 （ASCs）天主教 MASTER 细胞
皿 354352 分子 异

参考文献

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  1. Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
  2. Erickson, G. R., et al.

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标签

SOX9 2 O

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