靶向小鼠内耳给药方法的比较研究：鼓泡术 与 经鼓室注射

摘要

本文描述了两种用于向内耳局部给药的显微外科手术方法，并在听力参数、耳蜗细胞结构以及炎症标志物表达方面对二者进行了比较。

摘要

我们介绍了两种在啮齿类动物中进行特定药物递送至中耳的微创显微外科技术，以使药物能够到达内耳。第一种方法是穿通鼓泡，称为鼓泡造口术；第二种方法是经鼓膜注射。这两种技术均模拟了人类临床中的鼓室内给药操作。

壳聚糖-甘油磷酸酯（CGP）和林格氏乳酸盐缓冲液（RL）被用作局部药物递送的生物相容性载体。CGP 是一种无毒、可生物降解的聚合物，广泛应用于药物制剂领域。在室温下，它呈黏稠液体状态。 但它在体温下会凝结成半固体相。RL 是一种等渗溶液，用于人体静脉给药。通过圆窗（RW）鼓室穿刺术，可将少量该载体精确地置于圆窗龛内。经鼓膜注射则填充中耳，虽控制性较差，但可更广泛地进入内耳。

通过功能性和形态学检测，对两种技术的安全性进行了研究和比较。通过记录显微手术前及术后的多个时间点的听觉脑干反应（ABR），评估听力变化。采用常规组织学技术，对经多聚甲醛固定并脱钙的耳蜗样本进行细胞结构及耳蜗结构保存程度的研究。同时，采集未经固定的耳蜗样本并立即冷冻，以通过定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析炎症标志物的基因表达谱。

两种方法均适合作为将药物递送至小鼠中耳的给药方式，但与鼓泡造口术相比，经鼓膜注射的侵入性更小。

引言

听力障碍是最常见的人类感官缺陷，影响全球5.3%的人口，以及30%年龄超过65岁的个体（http://www.who.int/topics/deafness/en，2016年更新）。听力损失会影响儿童的语言习得，并加速老年人的认知衰退。因此，它是一个重大的医疗健康问题，具有巨大的社会经济影响。听力损失可由遗传缺陷、环境因素或两者共同作用引起¹，最终导致耳蜗内毛细胞和神经元的损伤与死亡。这些细胞在哺乳动物中无法再生，因此细胞丢失及其伴随的听力损失不可逆转。目前的临床治疗手段主要依赖于假体装置，包括助听器以及人工耳蜗、中耳和骨导植入物²。遗憾的是，目前尚无针对听力障碍的特异性医学修复治疗方法，因此多项研究致力于开发预防性和修复性疗法。新兴的治疗策略包括基因治疗、细胞治疗以及用于药物治疗的小分子化合物开发²。

耳蜗药理治疗面临的最重要挑战之一是药物递送。由于血-迷路屏障³的存在，全身性治疗在耳蜗中的疗效有限。该屏障由与耳蜗血管接触的连续性血管内皮构成，作为物理和生化屏障以维持内耳液体稳态，从而限制药物进入内耳。该屏障仅对小分子脂溶性物质具有通透性，尽管在耳蜗发生炎症期间，或使用利尿剂及渗透性药物时，其通透性可有所增加。全身给药后最终到达耳蜗的药物量较少，因此需要使用可能引起器官毒性的高剂量药物。此外，药物的肝脏代谢可能产生有毒或无活性的代谢产物^4,5,6,7。相比之下，局部干预可将已知的有限剂量药物直接递送至中耳或内耳，避免不必要的副作用^4,7,8,9。在目前的临床实践中，鼓室内给药仅限于某些耳蜗疾病，例如梅尼埃病中的庆大霉素¹⁰、突发性耳聋、梅尼埃病、免疫介导性及噪声性听力损失中的皮质类固醇^{11,12,13,14,15}，以及突发性耳聋中的胰岛素样生长因子1（IGF1）^4,16,17。

局部给药的制剂应维持耳蜗液体的精细稳态（pH值和渗透压）。此外，整个操作过程中必须保持无菌，以避免脑脊液受到细菌污染。用于药物递送的辅料应具有生物相容性、无耳毒性，并具备适当的黏稠度。推荐使用液体溶液进行耳内注射，但由于药物会经咽鼓管清除，因此液体不适合经鼓室给药途径。在此情况下，通常采用半固态凝胶作为药物载体，以延长药物在中耳的停留时间^4,18,19。其他用作载体以促进药物进入内耳的递送系统包括纳米颗粒²⁰和腺病毒²¹。本文中我们比较了两种载体：CGP和RL溶液。CGP是一种由壳聚糖和β-甘油磷酸盐组成的温敏性水凝胶。壳聚糖是一种线性多糖，来源于甲壳类动物外壳，由D-葡萄糖胺和N-乙酰-D-葡萄糖胺构成；β-甘油磷酸盐是一种多元醇，可在壳聚糖链周围形成水化层，使其保持液态。CGP具有温敏特性，并可被溶菌酶降解，从而实现药物在中耳的持续释放^22,23,24,25。基于壳聚糖的水凝胶因其无免疫原性且不会引发局部炎症反应，适合用于药物递送等临床应用^23,24。另一方面，RL缓冲液是一种无热原的等渗溶液（273 mOsm/L，pH 6.5），可用于人体静脉输注，作为水和电解质的补充来源，尤其适用于失血、创伤或烧伤等情况，因为乳酸在肝脏中的代谢产物可对抗酸中毒。

本文描述并比较了两种已优化用于小鼠内耳局部给药的外科手术方法。通过功能学、形态学和分子生物学检测评估了这两种技术的安全性。在显微手术前后的不同时间点，采用听觉脑干反应（Auditory Brainstem Response, ABR）^26,27检测听力功能。在实验终点，解剖耳蜗组织，以比较这两种显微外科手术在解剖结构、细胞水平和分子层面造成的影响。

方案

确保动物操作程序符合国际和国家法规。本方案分别遵循欧盟委员会 2010/63/EU 指令和西班牙 RD 53/2013 法规指南。

1. 动物常规操作

1. 喂养小鼠 随意摄取 标准饮食和饮水喂养。依据实验动物科学协会联合会（FELASA）的建议，监测动物的健康状况和福利。

2. 听力评估

注意：通过在手术前及术后多次检测听力来追踪显微外科手术的功能影响（本研究中为术后2、7、14和28天） 术后显微手术）与ABR等非侵入性操作⁹.

1. 进行ABR测试时，使用短效麻醉方案对小鼠进行麻醉 即 腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg 体重（BW））和赛拉嗪（10 mg/kg） BW）。或者，在吸入麻醉下进行听力测试。
   注意：由于听觉脑干反应（ABR）参数可能受到麻醉方案的影响²⁸在整个实验过程中使用同一个。
2. 通过测试足趾夹捏反射来检查麻醉深度。
   注意：当动物的退缩反射消失时，表明其已达到适合进行听觉测试的麻醉深度。
3. 保护眼睛免受干燥和继发性损伤 干眼性角结膜炎 通过局部使用人工泪液补充剂，例如基于羟丙基甲基纤维素的凝胶。
4. 在整个操作过程中，保持小鼠的生理温度（37.5–38 °C）。为避免电干扰，使用温水泵和加热垫。通过直肠探头监测体温，并始终注意避免动物过热。
   注意：我们建议在每只小鼠使用之间，用表面消毒剂清洁加热垫。  麻醉诱导和恢复期间，可使用电热垫、白炽灯或红外灯。
5. ABR 检测步骤
   注意：进行ABR检测时，应使用配备内置声卡的计算机工作站来生成波形（数字-模拟，D-A输出转换）并数字化电信号波形（模拟-数字，A-D输入转换），同时需配备衰减器、示波器和低阻抗放大器。 现代听觉工作站（即 Tucker Davis Technologies）将所有这些组件集成在一个紧凑的系统中。 
   1. 将麻醉后的小鼠俯卧置于隔音室内的加热垫上，以避免环境噪声干扰和混响（图1).
   2. 将声学刺激信号送入外耳道。使用预设的刺激信号或通过相应软件设计的新信号。将D-A工作站的输出端连接至选定的扬声器。
      注意：可使用插入外耳道的自由场或闭场扬声器。在小鼠实验中更推荐使用自由场扬声器，因为闭场系统中探头插入和声音校准较为困难。自由场扬声器会同时刺激双耳，引发双耳听觉反应。若希望使用自由场扬声器获得以单耳为主的反应，需通过堵塞对侧耳道消除对侧听觉活动。即 使用耳塞或通过噪声掩蔽。
      1. 将自由场扬声器置于固定距离（通常为5–20 cm），正对受试者头部或选定耳侧，使扬声器中心与外耳道口对齐。确保扬声器与耳朵之间无任何障碍物，并完全展开耳廓。
   3. 将不锈钢皮下针电极按以下位置放置：i) 活动（正极）电极置于耳间头皮处（颅骨顶点上方），ii) 参考（负极）电极置于耳廓下方腮腺区域，iii) 接地电极置于背部、尾部或后肢区域图1).
      1. 检查正极和负极的电极阻抗，确保阻抗低于3 kOhm（理想情况下为1 kOhm）。若阻抗过高，请重新放置电极、用酒精清洁或更换电极。
   4. 用于ABR记录时，生成宽带声信号和纯音频率，并以相对于声压级（SPL）90至10 dB的强度递减方式呈现，步长为5–10 dB SPL^27,29,30.
      1. 呈现短暂的点击声或短音刺激（1-5 毫秒），起始强度为高水平（即 80 或 90 dB SPL）并以 5–10 dB SPL 为步长逐步降低强度。记录刺激后前 10 毫秒内的电生理反应（诱发电位 ABR 反应在 6–8 毫秒出现）。
         注意：由于此原因，刺激频率不应高于每秒50次刺激（正常范围为每秒20-50次）。
   5. 放大、记录并平均每个刺激及其强度所诱发的电反应。使用低噪声且信噪比较高的放大器，并将其连接至A-D输入端。
      注意：听性脑干反应（ABRs）的振幅非常低，通常低于1 µV（峰峰值），必须使用低噪声放大器进行记录。在听力正常的 小鼠中，平均叠加100–200次反应后即可清晰观察到ABR波形，但为了获得高质量的记录，或在听力受损的情况下，建议进行更多次重复（750–1,000次）。²⁷.
   6. 在测试过程中通过视觉判断 ABR 阈值。
      注意：ABR 阈值是指能够引出可靠 ABR 记录的最低声刺激强度，此时波 I 至波 IV 清晰可见，且平均峰-峰电压高于背景活动均值 2 个标准差³¹该数据需在离线分析期间与其他参数一同进行确认，包括峰潜伏期、峰间潜伏期以及波幅。
   7. 手动或自动执行数据分析。
      1. 对于手动分析，识别4-5个听觉脑干反应波（I、II、III……）等等.)，并标出每列波的波峰（P1、P2、P3……）和波谷（N1、N2、N3……）。分析完成后，将数据导出为电子表格或文本文件。
         注意：用于记录电生理反应的特定软件通常可自动完成分析。在听觉脑干反应（ABR）记录中，还可根据固定强度刺激获取额外的测量参数。即 70 或 80 dB SPL）或相对于个体点击声阈值的强度即 阈值以上15 dB SPL
6. 使用适当的软件对 ABR 数据进行统计分析。根据实验设计，采用标准的配对 T 检验或方差分析（ANOVA）比较不同组之间的主要 ABR 参数^26,30.
   注意：在纵向研究中，许多功能数据是在不同时间点从同一动物身上采集的即 术前与术后显微外科手术）。在此情况下，采用重复测量的通用线性模型检验可提供详细的方差分析。

3. 载体的制备

1. 在无菌条件下配制和使用载体溶液。
   注：液体溶液通常会通过咽鼓管迅速清除。可采用不同的可注射递送系统以延长药物在中耳的滞留时间，包括水凝胶和纳米颗粒³²。
   1. 配制CGP-水凝胶时，将75%脱乙酰度的壳聚糖溶解于0.2 M乙酸溶液中，制备成1.5–2%（wt/wt）的壳聚糖溶液。向该溶液中加入9%（wt/wt）的甘油磷酸盐⁷。溶液应在使用前新鲜配制，并将水凝胶于4 °C保存至使用。
      注：在此温度下，CGP-水凝胶具有中等黏度，但仍可注射。当温度低于4 °C时，其会转变为固相，从而阻碍使用。给药后，CGP在37 °C下约15分钟内发生相变，形成半固体凝胶。
   2. 将商品化RL缓冲液分装（0.5 mL），并于4 °C保存至使用。

4. 显微外科手术操作

1. 使用基于氯胺酮的镇静剂和镇痛剂组合诱导全身麻醉（即 氯胺酮 100 mg/Kg、美托咪定 0.05 mg/Kg 和芬太尼 0.025 mg/Kg）通过腹腔注射给药，随后使用吸入性麻醉剂（即 异氟烷
   1. 注射给药后，将麻醉面罩调整至小鼠鼻部，并连接氧气₂ 维持异氟烷气体供应，显微手术期间持续保持吸入麻醉，并通过脚趾夹捏反射和呼吸模式监测麻醉深度。当夹捏反射完全消失且小鼠呈现规律呼吸时，开始手术准备。
   2. 在整个操作过程中使用加热垫维持体温，并使用羟丙基甲基纤维素凝胶保护眼睛，防止角膜炎。
2. 使用无菌手术巾准备一个清洁的手术区域。术前使用玻璃珠灭菌器对显微外科器械进行灭菌。在整个手术过程中保持无菌条件（无菌手套、手术巾、手术器械）。 等等。).
3. 显微外科手术
   1. 气囊造口术
      注意：鼓室造瘘术为单侧操作。仅对小鼠一侧耳朵进行手术，对侧耳朵作为对照。
      1. 将小鼠置于仰卧位。使用毛发修剪器剪除颈部腹侧手术区域的毛发，准备手术部位。用聚维酮碘消毒液清洁皮肤，并覆盖无菌手术巾。
      2. 使用手术刀，从下颌至锁骨做一条2厘米的纵向切口。
      3. 在手术显微镜放大下，辨认下颌下腺，并用镊子分离两侧下颌下腺。牵开下颌下腺，定位二腹肌起点及面神经。
      4. 用剪刀在二腹肌起点处做一切口，并将其向前侧牵开，暴露其下方的鼓室下内侧区域 鼓泡.
      5. 在...上开一个口 水疱 使用27 G针头钻入图 2A）。定位镫骨动脉及其尾侧的圆窗膜（图2B用可吸收明胶海绵清洁钻孔区域的血液。
      6. 使用34 G导管和玻璃微量注射器，缓慢注射3-5 µL 通过圆窗龛直接将载体溶液（CGP-水凝胶或RL）经圆窗龛注射至圆窗龛区域，使其充满该区域（图2C用1-2滴组织粘合剂封闭气囊切口。
      7. 将下颌下腺复位，并使用5-0丝线外科缝合线缝合皮肤切口。在切口周围涂抹含氯己定的消毒剂，以防止伤口感染。 注意：可使用可吸收和不可吸收缝线。不可吸收缝线必须拆除  2周后。不推荐使用丝线进行皮肤缝合，因为其使用与切口感染和局部组织反应相关。
   2. 双侧经鼓膜注射
      1. 将小鼠置于侧卧位 侧卧位 在耳廓下缘下方定位并准备无菌手术区域，具体步骤如4.3.1.1所述。
      2. 在耳道外侧壁靠近耳屏处做一条长约0.5 cm的纵向切口，并切开耳廓的内侧皮肤皱襞（可选步骤）。
      3. 使用手术显微镜在耳道末端定位鼓膜图2E）并确定上方 松弛部 和下部的 紧张部，由锤骨柄分为前部和后部图 2F).
      4. 在鼓膜的尾侧部分做一个小的鼓膜切开术 松弛部. 在另一位置做一个额外的切口 紧张部 鼓膜穿孔，以便在注射时使空气排出³³轻轻注入10–15 µL CGP水凝胶或RL溶液，使用连接34G导管的玻璃微量注射器注入 松弛部，靠近RW区域，直至中耳明显充满。
      5. 用5-0丝线缝合皮肤切口，并按照4.3.1.7所述方法进行清洁。
      6. 将小鼠置于另一侧，操作对侧耳朵（步骤4.3.2.1至4.3.2.5）。
4. 将小鼠置于加热垫上，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。动物在手术后未完全恢复前，不得放回与其他动物同处的环境中。
5. 监测动物体况、活动情况以及是否存在疼痛或应激的迹象。必要时给予镇痛剂（即 布托啡诺 0.05 mg/kg，卡洛芬 5–10 mg/kg。每日检查手术伤口，确认愈合后于术后 7–14 天拆除皮肤缝合。

5. 耳蜗细胞结构的形态学评估

1. 在实验结束时（本研究中为显微手术后28天），通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（100 mg/kg）处死小鼠，以研究手术的长期影响。
2. 用冰冷的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.5进行经心灌注，随后灌注4%（wt/v）多聚甲醛（PFA）溶于0.1 M PBS（pH 7.5）中，操作如文献²⁶所述。
   注意：多聚甲醛具有高毒性；避免接触皮肤、眼睛或黏膜。在称量和配制过程中避免吸入粉末。
3. 使用体视显微镜按照文献^34,35所述方法从颞骨中解剖出内耳，保留前庭和耳蜗结构的完整性，不将其分离。
4. 将分离的内耳在4%（wt/v）PFA溶于0.1 M PBS（pH 7.5）中，4 °C条件下轻摇固定12小时，随后用0.1 M PBS（pH 7.5）洗涤3次，每次5分钟。
5. 用0.1 M PBS（pH 6.5）配制的10%乙二胺四乙酸（EDTA）在4 °C条件下对样本脱钙10天 ，持续轻摇，每3天更换一次EDTA溶液。
6. 当耳蜗组织变得柔软时，移除EDTA溶液，并用0.1 M PBS（pH 7.5）在室温下轻摇洗涤3次，每次5分钟。
7. 按照文献³⁴所述方法将样本包埋于石蜡中，并沿蜗轴平行方向切取7 µm厚的耳蜗切片。
8. 为评估耳蜗细胞结构，使用苏木精和伊红（H&E）对切片染色³⁰，并通过连接数字相机的光学显微镜，使用4X和20X物镜采集图像。

6. 耳蜗基因表达

1. 用RNA酶去污染溶液清洁工作台面和手术器械。
2. 按照5.1所述方法处死小鼠，并在显微镜下迅速从颞骨中分离出内耳。将内耳浸入含有RNA保护与稳定试剂的玻璃皿中。
3. 使用珠宝镊子去除残留的岩骨，并用范纳眼科剪轻轻将耳蜗与前庭分离³⁵.
4. 立即将耳蜗转移至2 mL 含80 µL的微量离心管 RNA保护稳定液中保存，并将试管置于干冰中冷冻组织。耳蜗样本于-70 °C保存至使用。
5. 按照所述方法分离耳蜗RNA³⁵ 并使用分光光度法测定其质量和数量。
6. 使用逆转录商业试剂盒，从等量的小鼠总RNA中生成耳蜗cDNA。
7. 进行三复孔qRT-PCR以扩增互补脱氧核糖核酸（cDNA），检测基因转录水平^35,36.
   注意：本研究中促炎和抗炎基因的转录本 Il1b、Il6、Tgfb1、Tnfa、Il10 和 Dusp1 进行了测量。
8. 通过将目标转录本的循环阈值（Ct）归一化至参考基因水平的算术平均值来计算相对表达比值，并通过将待测组转录本水平归一化至校准组算术平均值进行相对定量³⁷.

结果

通过听觉脑干反应（ABR）在显微手术前及术后多个时间点检测听力，以评估对听觉功能的影响（图1A）。ABR记录在麻醉状态下进行，以避免动物移动和电压伪迹，从而提高其可重复性²⁷。通常采用腹腔注射的氯胺酮复合制剂或吸入式异氟烷对动物进行麻醉以完成ABR测试。氯胺酮/赛拉嗪组合可实现短效（2–3分钟）诱导，并在ABR记录过程中提供稳定且安全的维持期。需要注意的是，异氟烷可能影响ABR测量的敏感性³⁸。进行ABR记录时，将皮下电极置于特定位置（图1B），并测量电极的电导阻抗。若阻抗达到或超过3 kOhm，则需检查电极位置，以避免ABR波形振幅发生改变。

鼓室内给药在小鼠中通过两种显微外科手术进行（图2）。在进行鼓泡切开术暴露bulla时，需将下颌下腺和二腹肌向后牵拉。该操作需极为谨慎，因为颈动脉和迷走神经距离很近（图2A）。随后，对bulla进行钻孔以定位镫骨动脉和圆窗膜（图2B）。为避免骨裂，钻孔前先用27 G针头制造一个约0.5 mm的小孔。将34 G导管经鼓泡切开处导向圆窗膜，并将少量载体溶液注入圆窗龛内（图2C）。经鼓膜注射则通过鼓膜松弛部（pars flaccida）的切口，使用27 G针头完成；若使用较大针头可能引起鼓膜撕裂。在注射前，建议在鼓膜紧张部（pars tensa）另做一切口，以便注射载体时空气排出（图2F）。操作中必须避免损伤颈内动脉分支的镫骨动脉，否则将导致危及生命的出血。

行鼓室造口术或经鼓膜手术的小鼠在整个实验过程中均保持听力，与未手术对照组相似（图3）。与基线值相比，显微手术后对点击声和短音刺激的听性脑干反应（ABR）阈值未发生显著变化。鼓室造口术与经鼓膜手术两种方法之间亦未观察到显著差异。为确认药物载体成功递送至中耳并评估手术对耳蜗细胞结构可能造成的影响，开展了形态学研究。两种手术方式的动物在耳蜗主要区域均未显示形态学改变，且所有耳蜗结构的形态学表现相似（图4A）。此外，还分析了耳蜗内促炎性和抗炎性细胞因子基因表达谱。尽管两种手术方式在ABR功能数据上无显著差异，鼓室造口术引起的炎症反应仍强于经鼓膜手术（图4B）。

图1. 实验设计与听力评估 (A) 实验流程示意图。在显微手术前后通过听性脑干反应（ABR）评估听力，并在显微手术后28天获取耳蜗样本。B) 麻醉小鼠俯卧于隔音屏蔽室内的加热垫上，皮下电极置于颅顶耳间头皮区域（活性电极，正极），耳廓下方腮腺区域（参考电极，负极）以及背部（接地电极）。自由场扬声器固定于距右耳5 cm处，正对右耳。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图2. 载体给药的显微外科操作。（A）鼓室bulla的腹侧视图。使用27 G针头在面神经尾侧进行鼓泡造口术。（B）可通过穿孔观察到圆窗神经（RWN）和镫骨动脉。（C）将34 G导管经鼓泡造口引导至圆窗龛（RW niche）。（D）鼓泡造口术后一个月，开口处可见少量骨性瘢痕（箭头所示）。（E）耳部的外侧视图，显示外耳道切口及鼓膜位置（方框所示）。（F）鼓膜细节图。使用27 G针头在鼓膜的尾上象限（pars flaccida区域）进行穿刺（黑色星号）；通过此穿孔使用34 G导管进行注射。注射前，在鼓膜的头下象限（pars tensa区域）另打一孔（白色星号），以平衡鼓室内压力。（G）通过鼓膜穿刺处观察34 G导管的位置。（H）显微手术后24小时的耳蜗区域图像。圆窗龛内充满载体溶液（星号所示）。Lat，外侧；Ro，头侧；Do，背侧；Ma，锤骨；Co，耳蜗；OW，卵圆窗；RWN，圆窗龛。比例尺 = A、D、F中为200 µm；B、C、H中为100 µm；E、G中为1,000 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 听力评估。 对8周龄雄性C57BL/6J小鼠在显微手术前及术后7天、14天和28天，使用短声（A）和短纯音（B）刺激所测得的听觉脑干反应（ABR）阈值变化（均值±标准误，单位为dB SPL）。鼓室切开术组（橙色；n = 11）；经鼓膜注射组（蓝色；n = 6）；未手术组（灰色；n = 11）。请点击此处查看该图的放大版本。

图4. 耳蜗形态学与基因表达分析。（A）耳蜗基底部主要结构的形态学表现。对未手术小鼠及显微手术后一个月经鼓泡切开术或经鼓膜注射的小鼠耳组织进行中位石蜡切片（7 µm）的苏木精-伊红染色。图中蜗管腔室（a,b,c）包含所有主要结构成分。各结构的细节（编号框）在后续图像中展示：螺旋神经节（1）、柯蒂氏器（2）、螺旋韧带（3）和血管纹（4）。内毛细胞（星号）；外毛细胞（箭头头部）。比例尺 = a,b,c中为100 µm；a-1,2,3,4中为50 µm。（B）显微手术后28天耳蜗内炎症标志物的表达水平。比较鼓泡切开术（橙色）、经鼓膜注射（蓝色）与未手术小鼠（白色）之间的差异。*：未手术组与手术组比较；^：手术组之间的比较。基因表达水平以2^-ΔΔCt表示，即相对于未手术组的n倍变化量。数据以每组3只小鼠混合样本的三复孔均值±标准误（SEM）表示。统计学显著性：**p ≤0.01；***p ≤0.001；^{^^}p ≤0.01；^^^p ≤0.001。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

局部药物递送至内耳可通过耳蜗内注射直接给药，或通过鼓室给药间接实现，后者将药物置于中耳^4,19,39。耳蜗内给药可实现对耳蜗的可控且精确的药物输送，避免药物经圆窗膜扩散、产生从耳蜗基部到顶端的浓度梯度以及经咽鼓管清除。然而，该方法通常具有高度侵入性，需要复杂而精细的显微外科手术^7,39。在此背景下，工业界正在开发新型带涂层的可植入装置，以实现药物的持续释放^40,41。另一方面，鼓室给药是一种微创且易于操作的技术，可将较大体积的药物注入中耳，但其药代动力学较难控制。大部分药物经咽鼓管清除，剩余部分需通过圆窗（RW）膜扩散进入耳蜗¹⁸。圆窗是物质从中耳吸收进入耳蜗内充满外淋巴的鼓阶的主要部位⁷。它是一种半透性的三层结构，其通透性取决于药物的特性（分子大小、浓度、溶解度和电荷）以及跨膜转运系统（扩散、主动转运或吞噬作用）⁴²。前庭窗和耳囊是进入耳蜗的其他途径，但效率较低^43,44。

本文演示并比较了两种将药物靶向递送至小鼠中耳的显微外科方法：鼓泡造口术和经鼓膜注射术。这些手术的共同关键步骤包括：i）在显微手术前后评估听力功能，ii）在无菌条件下制备均一的载体溶液，iii）仔细监控麻醉过程，并监测动物的体温及生命体征，iv）缓慢注入适量的载体溶液以靶向圆窗（RW），以及v）采集耳蜗样本以进行分子和形态学分析。

已描述过耳后和腹侧入路的鼓室造口术^7,45我们采用腹侧入路法，因为根据我们的经验，该方法已取得良好效果 较低的发病率 并提供了对RW更佳的访问途径⁴⁶经鼓膜注射通常通过鼓膜进行 紧张部 鼓膜的锤骨柄前方或后方¹²在此研究中，我们对技术进行了改良，采用通过注射的方式 松弛部 锤骨之外，先前已进行过额外的穿刺 紧张部鼓膜 以便在注射过程中排出空气。

与鼓室切开术相比，经鼓膜注射的侵入性更小，尽管这两种显微手术操作均较为迅速（鼓室切开术和经鼓膜注射每耳分别耗时20分钟和5分钟），术后恢复时间短，且无并发症发生。尤为重要的是，两种手术方式均能保持听力，听觉脑干反应（ABR）参数与显微手术前测定的结果一致。经鼓膜注射所需时间较鼓室切开术更短，且可在同一手术过程中对同一只动物的双耳进行操作。因此，经鼓膜注射的优势在于可双侧实施，并可根据需要重复进行。另一方面，鼓室切开术可直接可视化圆窗（RW）膜，并允许对圆窗凹窝进行填充。相比之下，经鼓膜注射无法控制给药载体在圆窗凹窝内的定位。

本研究中报告的操作步骤描述了如何在中耳进行局部药物载体递送，用于临床前应用，例如耳毒性评估以及听力损失治疗效果的评估。文中介绍了两种显微外科手术方法，它们各自具有特定的优势和局限性。这两种方法均能保留听力功能，且不会引起形态学改变。鼓泡切开术可能引发局部炎症，被描述为一种潜在的并发症。此外，还介绍了一系列术后辅助技术，包括听力评估、形态学分析以及炎症标志物表达水平的检测。这些技术未来的应用包括在动物模型中对听力损失的新疗法进行临床前评价，涵盖基因治疗、细胞治疗和药理学方法。经鼓室给药可确保治疗物质递送至中耳，并与圆窗膜直接接触，从而促进药物进入外淋巴液，且不造成明显的耳蜗损伤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮（Imalgene）	Merial	# 2529	注意：避免药物接触皮肤或眼睛，防止意外自体注射
赛拉嗪（Xilagesic）	Calier	# 6200025225
润滑性眼用凝胶（Artific）	Angelini	# 784710
水泵	Gaymar	# TP472
表面消毒剂	José Collado SA	# CR-36
皮下针电极	Spes Medica	# MN4013D10SM
低阻抗前置放大器 （RA4LI）	Tucker-Davis Technologies
扬声器（MF1 多场磁性扬声器）	Tucker-Davis Technologies
System 3 诱发电位工作站	Tucker-Davis Technologies		该系统由以下部分组成：RP2 处理器、RA16 基站、PA5 衰减器、SA1 放大器、MA3 麦克风放大器、RA4LI 阻抗前置放大器和 RA4A Medusa 前置放大器
SigGenRP 软件	Tucker-Davis Technologies
加热垫（TP 垫）	Gaymar	# TP3E
统计学软件（SPSS）	IBM
壳聚糖（脱乙酰化）	Sigma-Aldrich	# C3646
乙酸（冰醋酸）	VWR	# 20103.295	注意：易燃液体，可致皮肤腐蚀，具有呼吸道和皮肤致敏性
甘油磷酸盐	Sigma	# SLBG3671V
Ringer´s 乳酸盐缓冲液	Braun	# 1520-ESP
美托咪啶（Domtor）	Esteve	# 02400190
芬太尼（Fentanest）	Kern Pharma	# 756650.2	注意：  避免药物接触开放性伤口或发生意外自体注射
异氟烷（IsoVet）	Braun	# 469860	注意：在不超过 1 小时的采样周期内，避免暴露于任何卤化麻醉剂浓度超过 2 ppm 的环境中。
手术显微镜（OPMI pico）	Zeiss
无菌手术单（Foliodrape）	Hartmann	# 277546
灭菌器	Fine Science Tools	# 18000-45
手术刀片	Swann Morton	# 0205	注意
手术刀柄	Fine Science Tools	# 91003-12
聚维酮碘基消毒剂（Betadine）	Meda Pharma SAU	# M-12207
外膜剪刀（SAS18-R8）	S&T	# 12075-12
弯剪	CM Instrumente	# AJ023-18
镊子	CM Instrumente	# BB019-18
明胶海绵（Spongostan）	ProNaMAc	# MS0001
27G 微量注射针头（Microlance）	Becton Dickinson	# 302200
微量注射器（701 RN SYR）	Hamilton	# 80330
导管（Microfil 34 G）	World Precision Instruments	# MF34G-5
组织粘合剂（Vetbond）	3M	# 1469SB
持针器（圆柄持针器）	Fine Science Tools	# 12075-12
丝线外科缝合线（编织丝线 5/0）	Arago	# 990011
氯己定（Cristalmina）	Salvat	# 787341
戊巴比妥 （Dolethal）	Ventoquinol	# VET00040	注意：  避免药物接触开放性伤口或发生意外自体注射
体视显微镜（Leica）	Meyer Instruments	# MZ75
Vannas 微型解剖（眼科）剪刀（弹簧式）	Harvard Apparatus	# 28483
珠宝镊（Dumont）’s	Fine Science Tools	# 11252-00
RNase 去污染溶液 （RNaseZap）	Sigma-Aldrich	# R2020
RNA 稳定溶液 （RNAlater）	Thermo Fisher Scientific	# R0901
RNA 纯化试剂盒（RNeasy）	Qiagen	# 74104
cDNA 反转录试剂盒	Thermo Fisher Scientific	# 4368814
基因表达检测（TaqMan 探针）	Thermo Fisher Scientific	Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1
实时荧光定量 PCR 系统（7900HT）	Applied Biosystems	# 4329001
多聚甲醛（PFA）	Merck	# 1040051000	有毒：PFA 为潜在 致癌物
乙二胺四乙酸（EDTA）	Merck	# 405491	注意： 吸入有害，长期或反复吸入可能造成呼吸道损伤 。
苏木精溶液	Sigma-Aldrich	# HHS16
伊红 Y	Sigma-Aldrich	# E4382	危害：可引起严重眼部刺激