本方案描述了利用磁夹钳在小鼠耳部皮肤上建立缺血-再灌注（IR）模型的方法。通过使用自行构建的活体成像模型，我们开展研究 体内 再灌注后的炎症反应。该技术的开发旨在深入理解白细胞对皮肤缺血-再灌注损伤的响应机制。
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摘要
摘要
缺血-再灌注损伤（IRI）是指由于血流受阻（缺血）导致短暂性缺氧，随后组织重新获得氧气供应（再灌注）而引发的损伤。在皮肤中，缺血-再灌注（IR）是压力性溃疡病理生理过程中的主要促成因素。尽管导致炎症反应的事件级联已被广泛研究，但不同免疫细胞亚群对IR损伤在时空动态上的响应仍不明确。目前使用夹闭技术作用于皮肤侧 flank 区域的IR模型具有高度侵入性，不适合用于研究损伤后的免疫应答；而类似的非侵入性磁夹闭研究在皮肤 flank 区域的应用也不利于活体成像分析。在本方案中，我们描述了一种建立于小鼠耳部皮肤的稳定、非侵入性IR模型，旨在通过多光子活体成像（MP-IVM）实时观察再灌注后免疫细胞的细胞反应。
引言
缺血-再灌注损伤（IRI）是指由于血流受阻（缺血）导致短暂性缺氧，随后组织重新获得氧气供应（再灌注）时所引发的损伤。在皮肤中，缺血-再灌注（IR）被认为是压力性溃疡发病机制中的促成因素之一，长期卧床使住院患者易发生此类损伤。在这些患者中，皮肤及皮下肌肉持续受到骨性突出部位所承受的压力作用，导致局部损伤，若未及时治疗，可能发展为坏死1。
缺血-再灌注损伤（IRI）所涉及的损害包括两个方面。在缺血期间，血管闭塞导致输送到组织的氧气急剧减少，从而引起三磷酸腺苷（ATP）水平下降和pH降低，进而使参与细胞代谢的ATP酶失活。随之，细胞内钙离子水平急剧升高，导致应激或受损细胞发生凋亡或坏死2。细胞内容物或损伤相关分子模式（DAMP）如HMGB1的释放，会促进炎症反应3。第二次损伤发生在再灌注阶段。尽管再灌注过程中氧和pH水平得以恢复，但会产生活性氧（ROS），导致细胞内脂质、DNA和蛋白质的氧化。因此，促炎介质被激活，引发继发性炎症反应，包括免疫细胞向炎症部位的募集2。尽管导致炎症反应的生化事件级联过程已有较充分的描述，但免疫细胞活动在时间和空间上的调控机制仍不明确。
在此，我们描述了一种利用简易磁铁夹固定在小鼠耳部皮肤上建立的稳定缺血-再灌注（IR）模型。结合多光子活体成像技术（MP-IVM），我们建立了一种用于研究缺血-再灌注损伤的模型 体内 再灌注发生后出现的炎症反应。开发和使用该技术的目的是实时研究间质细胞和浸润细胞对缺血-再灌注（IR）的响应方式。
采用夹钳技术作用于皮肤 flank 部位的现有 IR 模型具有高度侵入性，因其需要在外 flank 皮肤区域手术植入钢板，因此不太适用于免疫学研究4。已有研究描述了一种在小鼠皮肤 flank 部位应用的类似非侵入性夹钳技术5,6。然而，由于本方法结合了活体成像组件，我们选择耳部皮肤作为目标 IR 部位，因为该部位可避免呼吸运动带来的干扰，并在成像过程中提供更高的稳定性7,8。此外，耳部皮肤与 flank 皮肤间质中存在的白细胞亚群基本相同，尽管其数量和比例可能存在轻微差异9。因此，耳部皮肤是一个理想的成像部位。
此外，从这些缺血-再灌注损伤（IRI）模型中获取的大多数数据仅限于宏观评估（如溃疡分级）以及终点炎症指标的显微分析10。利用该模型，可实现对荧光报告小鼠皮肤在再灌注后中性粒细胞细胞反应的实时可视化观察。本研究采用了一种 previously published 活体耳部成像模型8，并进行了额外改进（图 1、2）。
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方案
所有涉及活体动物的实验均按照所有相关的动物使用和护理指南及法规进行。
1. 荧光报告小鼠的选择
- 使用6至12周龄的LysM-eGFP11 小鼠（对雄性或雌性无偏好）。
注意：使用多种细胞特异性的荧光报告小鼠可实现对不同免疫细胞的可视化观察 体内在此品系中，循环中的中性粒细胞（GFP你好 细胞）、循环单核细胞（GFPlo 细胞）和真皮巨噬细胞（GFPlo 细胞）可被可视化。采用所用的成像参数，仅能检测到GFP阳性中性粒细胞的强信号。
注：适用于此类皮肤成像研究的免疫细胞特异性荧光报告小鼠品系列表见参考文献8。
注意：强烈建议使用白化小鼠进行成像，因为有色小鼠更容易发生光损伤。这是因为有色小鼠的耳部皮肤对激光诱导的散斑现象（提示组织灼伤）更为敏感。因此，即使在稳态条件下，也可能观察到中性粒细胞的募集与聚集。8,12. - 将小鼠饲养于12小时光照-12小时黑暗循环的特定病原体排除（SPF）环境中。
2. 小鼠麻醉
- 通过腹腔注射氯胺酮-赛拉嗪混合物（8 µL g-1 体重）对小鼠进行麻醉，该混合物由15 mg mL-1 氯胺酮和1 mg mL-1 赛拉嗪溶于无菌水中制成。
- 将小鼠置于加热垫上，以在整个制备过程中维持其体温在37 °C。通过检查足趾夹捏反射是否消失来判断麻醉是否充分。
注意：在第一个小时后，需皮下追加四分之一剂量的麻醉剂，每次追加剂量可持续约0.5小时。胡须或尾巴出现抽动也可能提示麻醉效果正在减弱，需要补充麻醉。 - 在麻醉期间使用眼用润滑剂涂抹眼睛，以防止角膜干燥。
3. 脱毛
- 使用棉签将脱毛膏小心涂抹于小鼠耳背面上部的三分之二区域。
- 涂抹后等待 2 - 3 分钟，再用湿润的棉签彻底但轻柔地清除脱毛膏。
注意：脱毛膏在小鼠耳部停留时间不宜过长，以免引起炎症13,14。
4. 缺血与再灌注损伤的诱导
- 使用镀金N42级钕磁铁（直径12 mm，厚度2 mm，高斯值约为3,000）诱导小鼠耳部皮肤缺血。
注：本例中，磁铁的凹面表示其北极。 - 将磁铁插入各自的塑料导槽中。
注意：塑料导板有助于高强磁铁的放置和分离。由于这些磁铁磁力较强但抗断裂能力较弱，切勿将单个磁铁彼此靠近放置或靠近其他金属。若磁铁相互吸引，可能导致断裂或碎裂。 - 将第一个（背侧）磁铁放置到位，使其仅边缘与第二个（腹侧）磁铁接触（图3a)
注意：这可以防止磁铁在未正确放置前突然吸合在一起。 - 将两块磁铁放置到位，使腹侧磁铁平放在耳部图3a).
注意：在诱导缺血前，确保小鼠体温维持在 37 °C，并维持足够的麻醉深度（参见步骤 2.2）。 - 准备就绪后，小心地让磁铁相互靠近（图3a).
注意：为了成像目的，仅夹住耳部的一半，以便同时观察红外区域和非红外区域。 - 缺血1.5小时后，使用塑料导向装置将磁铁相互扭转分离，移除磁铁，以实现再灌注。
注意：放置磁铁时需小心，避免耳部皮肤褶皱。若肉眼可见的主要血管立即再灌注，则提示缺血不完全（即， 磁铁移除后，血液会立即充满血管。尽管磁铁移除后再灌注并非即刻发生，但血管阻塞仅为暂时性。因此，必须尽快完成小鼠耳部的成像准备工作。
5. 血管标记剂的注射
- 磁铁移除后立即通过静脉注射（经眶后静脉或尾静脉）给予伊文思蓝（10 mg/mL）-1 在 PBS 或生理盐水中；1 µL g-1 体重）或其他选择的血管标记试剂。
注意：注射前，通过轻柔捏压脚趾确认麻醉效果是否仍然充分。
6. 将耳朵放置在成像平台上
- 裁剪两条遮蔽胶带，长度为 1.5 cm，宽度为 1.8 cm。
- 将胶带的粘性面相互贴合，但保留约 1 mm 宽度的粘性边缘。
- 沿长度方向将遮蔽胶带纵向剪成两半，以便其能够放入耳部平台的狭缝中。
- 将此遮蔽胶带插入狭缝约一半深度，使粘性面朝上。
- 将小鼠放置在加热垫上，使其待成像的耳朵靠近遮蔽胶带条。
- 使用两个经 PBS 润湿的棉签，轻轻将耳朵压在粘性胶带上。
- 以胶带为引导，将小鼠耳朵穿过狭缝，同时调整小鼠位置使其更靠近成像平台。
- 去除粘性胶带时，首先滴加一滴 PBS 以降低胶带的粘性。
- 使用细毛笔尽可能轻柔地将小鼠耳朵从遮蔽胶带上分离。
- 用湿润的棉签轻轻在耳朵表面滚动，使其平整贴合于耳部平台上。
- 在盖玻片下方滴加一滴 PBS（盖玻片通过油脂固定在盖玻片支架上；图 2），然后轻轻将其覆盖在耳朵上。如有需要，可补充更多 PBS。
注意：盖玻片支架可提高成像过程中的稳定性。 - 插入直肠温度探头，并根据制造商说明将导线连接至加热系统。
注意：将身体加热垫的温度设置为 37 °C，耳部成像平台的温度设置为 35 °C。
7. 多光子显微镜设置与成像参数
注意：本方案采用单光束多光子显微镜，配备可调谐（680 - 1,080 nm）钛宝石激光器（在800 nm处输出功率为3.3 W，脉冲宽度140 fs，重复频率80 MHz），并使用20倍水浸物镜（NA = 1.0）进行活体成像研究。
- 打开成像软件。
- 根据制造商的说明对准激光。
- 将激发波长调整至 950 nm。
注意：GFP 和伊文思蓝可在 950 nm 处同时激发。 - 进行预览时，使用以下设置：500 µm2 扫描视野、505 × 505 像素分辨率，以及单线扫描模式下 800 Hz 的扫描频率。点击 "预览"。
- 调节衰减器（激光）功率。确保捕获所有关键信号的同时，避免成像区域暴露于过强的激光功率下，以防产生热损伤。
注意：从低衰减器功率开始，若信号较弱则逐步增加。由于再灌注早期中性粒细胞尚未进入间质，而巨噬细胞比中性粒细胞信号更弱，因此可用作判断所需最小功率的参考。
注意：若为首次执行此步骤，建议在非缺血区域调整设置，该区域预期具有完整的血管完整性，有助于确定合适的衰减器功率。在后续实验中，除非激光功率不稳定，否则这些设置通常无需大幅调整。 - 调整 PMT 设置。
注意：请查阅制造商提供的 PMT 最佳增益电压上限。将 PMT 电压设置超过推荐阈值会导致信噪比升高。一般建议将 PMT 增益电压设为推荐阈值，并在信号过弱时适当提高衰减器功率。 - 选择靠近缺血边缘的成像区域，该区域应表现出明显的伊文思蓝渗漏。
- 分别使用 525/50 带通（BP）滤光片和 655/40 BP 滤光片采集 GFP 和伊文思蓝信号。对于真皮层内胶原纤维的二次谐波生成（SHG）信号，使用 475/42 BP 滤光片。
- 创建一个文件夹，用于保存与现有图像分析软件兼容格式的图像。
- 开始采集时，使用以下设置：500 µm2 扫描视野、505 × 505 像素分辨率，以及单线扫描模式下 400 Hz 的扫描频率。
- 可每隔 1 分钟重复采集一次 100 µm 的 z 轴堆栈图像，步长为 4 µm，以监测中性粒细胞的浸润情况。
注意：特别是对于迁移速度较高的白细胞（例如，中性粒细胞），若时间间隔超过 1 分钟，可能在细胞追踪分析中造成困难。此时，用户可减小采集堆栈的厚度或提高扫描频率。
注意：尽管由于组织受压（或表现为 SHG 信号增强），缺血区域所需的采集堆栈看似更薄，但随后的再灌注会引起显著炎症反应，导致耳部肿胀，并在 Z 方向上产生明显漂移。因此，必须采集较大的 z 轴堆栈以适应这种漂移。 - 在整个成像过程中，定期补充 PBS 和水，以保持耳部湿润并确保物镜始终浸没在水中。
注意：典型的实验通常持续 2–4 小时。根据实验设计，并结合良好的麻醉控制方案，可适当延长成像时间。
8. 终止实验
- 根据机构的机构动物护理和使用委员会（IACUC）规程，通过二氧化碳窒息法处死小鼠。
注意：必须始终按照机构规定、法规和指南所批准的方法处死小鼠。如果需要重复成像，请将小鼠保留在加热垫上直至麻醉作用消退。一旦小鼠恢复足够的意识并能够活动，立即将其放回笼中。
9. 图像分析
注意：成像实验产生的数据可通过不同的软件包进行可视化。
- 打开成像分析软件。
- 在超越模式下，导入文件（打开 → 选择目标文件夹中的任意文件 → 单击） "开放").
- 如果默认颜色不适用，请编辑伪色（编辑 → 显示调整 → 在通道选项卡下，从调色板中选择所需颜色）。
- 调整亮度、对比度和背景（编辑 → 显示调节 → 切换最大值和最小值）。
- 确保文件尺寸正确（编辑 → 图像属性 → 在几何选项卡下，检查体素大小。本实验方案中，X = 0.99，Y = 0.99，Z = 4）。
注意：通过将扫描视野尺寸除以像素分辨率来确定 X 和 Y。Z 为每层切片之间的厚度。
注意：这些数据集的输出可呈现为最大投影视频。
注意：为了理解细胞的功能，需要进行追踪分析，以全面表征细胞的活动和相互作用 体内使用软件中可用的斑点（spot）功能进行细胞追踪的详细说明，可参见参考文献15中的实验方案。
注意：白细胞迁移的定量方法有多种，具体细节可参见参考文献16中的综述文章。
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结果
本方案使用一种自行搭建的耳部皮肤成像平台，如图1所示。该平台的多个设计特点专门用于在维持生理状态的同时便于成像。将耳朵置于加热的黄铜平台上，不仅可以使耳部保持在35 °C的生理温度，还能将耳朵与因呼吸引起的不可避免的运动隔离开来。在黄铜平台上增加一个金属夹，可形成一个间隙，防止盖玻片夹对耳朵施加压力，从而维持 uninterrupted 的血流。该载物台平台还设计有空间，可容纳加热垫，以在整个成像过程中维持小鼠体温在37 °C。
盖玻片夹持器（图2）设计用于在真空润滑脂的辅助下将盖玻片固定到金属夹持器上。盖玻片夹持器连接在一个支架上，通过适配器可在垂直和水平轴向上进行灵活调节。这样，用户可先精确调整盖玻片在耳部上方的位置，然后通过拧紧适配器上的螺丝来固定该位置。
在...
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讨论
意义
缺血再灌注（IR）是导致皮肤压力性溃疡的主要原因之一。压力性溃疡的早期阶段（I期和II期）描述的是人体皮肤的状态（相对于皮下组织和肌肉而言）。然而，目前对这一过程的免疫学病因仍缺乏深入理解。本文介绍了一种简单且可靠的在小鼠耳部皮肤上建立IR模型的方法，以弥补这一研究空白。我们通过在小鼠耳部两侧夹持两块磁铁来模拟缺血状态，随后在移除磁铁（即再灌注）后研究其下游的免疫应答反应。利用磁铁在固定时间内对双耳施加恒定压力以诱导缺血，从而确保实验间具有良好的可重复性和一致性。
该非侵入性红外模型的优势还在于其能够实时展示 体内 通过利用一种成熟的耳部皮肤活体成像模型来研究免疫反应，该模型在成像过程中比皮肤侧 flank 模型具有更高的稳定性。目前一些皮肤侧 flank 模型涉及手术操作，可能改变皮肤的免疫微环境4此外，对皮肤侧 flank 部位本身进行成像也存在技术挑战，因为呼吸运动可能在成像过程中引起与运动相关的伪影5,6我们的当前模型规避了这些问题。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Thomas Graf 提供 LysM-eGFP 小鼠。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小鼠品系 | |||
| 溶菌酶-GFP C57BL/6 | Thomas Graf，基因组调控中心 | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | 需与溶菌酶-GFP小鼠杂交以生成用于皮肤成像的白化型溶菌酶-GFP小鼠 |
| 试剂 | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) 生理盐水 | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| 氯胺酮（100 mg mL−1 盐酸氯胺酮） | Parnell | 氯胺酮为管制药品，应遵守所有相关当地法规 | |
| Ilium Xylazil-20（20 mg mL−1 盐酸赛拉嗪） | Troy Laboratories | Xylazil-20为管制药品，应遵守所有相关当地法规。 | |
| 伊文思蓝（10 mg mL−1，溶于PBS或生理盐水） | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| 超纯水 | |||
| 设备 | |||
| 带针头的胰岛素注射器 | BD | 328838 | |
| 移液管 | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3M 纸质遮蔽胶带 | 3M | 2214 | |
| Deckglaser 显微镜盖玻片（22 mm × 32 mm） | Paul Marienfeld | 101112 | |
| 弯头镊子 | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet 脱毛膏 | Reckitt Benckiser | ||
| 医用棉签 | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C型折叠毛巾 | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes 精细擦拭纸 | Kimtech Science | 34155 | |
| 镀金N42级钕磁铁，直径12 mm，厚度2 mm | first4magnets | F656S | |
| 塑料导板，10 cm × 1.5 cm（聚氯乙烯材料） | 沿长度方向对折，用遮蔽胶带固定，并嵌入磁铁 | ||
| 高真空润滑脂 | Dow Corning | ||
| 显微镜 | |||
| TriM Scope II 单光束双光子显微镜 | LaVision BioTec | ||
| 可调谐（680–1,080 nm）Coherent Chameleon Ultra II One Box 钛宝石激光器（≥3.3 W @ 800 nm；脉冲宽度140 fs，重复频率80 MHz） | Coherent | ||
| 水浸物镜（20×，NA = 1.0） | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| 显微镜滤光片与反射镜组（用于GFP、SHG、伊文思蓝成像） | |||
| 495 长通滤光片 | Chroma | T495LPXR | |
| 560 长通滤光片 | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 带通滤光片 | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 带通滤光片 | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 带通滤光片 | Chroma | NC028647 | |
| 皮肤成像用载物台平台（参见装配示意图） | |||
| 金属底板（126 mm × 126 mm × 1 mm） | |||
| 耳部用黄铜平台（79 mm × 19 mm；边缘厚度1 mm，中部厚度0.5 mm；图1），带狭缝（1.7 mm × 1 mm；距长边1.5 mm） | |||
| 两个塑料块（高10 mm）—用于隔热 | |||
| 弯曲支架，用于将控温热敏电阻固定在耳部平台上 | |||
| 带DIN连接器的接口电缆CC-28及热敏电阻，分别用于温度控制和温度监测 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | 将接口电缆连接至两个设定为35 °C的电阻加热块 |
| 耳部平台用电阻加热块RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | 电阻加热块可在数分钟内将黄铜耳部平台加热至100 °C以上。确保控温热敏电阻已正确固定在支架中，以防过热。 |
| 耳部平台温度控制器TC-344B | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| 小鼠加热垫温度控制器TR-200 | Fine Science Tools | 21052-00 | 该设备已停产。请向制造商咨询替代产品 |
| TR-200电源 | Fine Science Tools | 21051-00 | 该设备已停产。请向制造商咨询替代产品 |
| 加热垫 | Fine Science Tools | 21060-00 | 该设备已停产。请向制造商咨询替代产品。 |
| 动物直肠探头 | Fine Science Tools | 21060-01 | 该设备已停产。请向制造商咨询替代产品。将直肠探头和加热垫连接至温度控制器TR-200后，将温度设定为37 °C |
| 盖玻片固定装置 | |||
| 2根塑料棒，直径1 cm，长10 cm | |||
| 1个带孔塑料适配器，用于固定塑料棒（参见示意图） | |||
| 3个塑料紧固螺钉，用于固定塑料棒 | |||
| 1块金属板，6 cm × 2.5 cm，一端切出2 cm见方的开口，距短边边缘2 mm | |||
| 1对螺母和螺栓，用于将金属板固定到塑料棒上 | |||
| 1个丙烯酸底座（4 cm × 5 cm × 1.5 cm），带磁铁，用于将盖玻片固定装置固定在皮肤成像载物台平台上。1根塑料棒永久固定在底座上。 | |||
| 成像分析软件 | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane |
参考文献
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