用于NOx氮同位素分析的自动化高分辨率移动采集系统

摘要

先前的研究表明，大气氮氧化物的氮同位素组成可能用于区分环境中不同来源的影响。本文报道了一种自动化、可移动、基于野外的高效率收集大气NO_x的方法，可用于每小时时间分辨率下的氮同位素分析。

摘要

氮氧化物（NO_x = NO + NO₂是一类对环境具有重大影响的大气痕量气体。NO_x 浓度通过与臭氧和羟基自由基的相互作用，直接影响大气的氧化能力。NO的主要汇_x 硝酸的形成与沉降，作为酸雨的组分及一种可被生物利用的营养物质。NO_x 由自然源和人为源混合排放，其排放源在空间和时间上存在变化。多种排放源的共存以及NO的短寿命_x 使得定量限制不同排放源及其对环境影响的影响变得具有挑战性。NO的氮同位素_x 在不同来源之间可能存在差异，这为理解NO的来源与传输提供了潜在的有力工具_x然而，以往收集大气中NO的方法_x 在较长时间尺度（数周至数月）上进行整合，且未经过验证可用于高效收集一氧化氮_x 在相关且多样的野外条件下。我们报道了一种新型的高效野外系统，可采集大气中的NO_x 用于在30分钟至2小时的时间分辨率下进行同位素分析。该方法收集气态NO_x 在多种条件下，以硝酸盐形式在溶液中实现100%的吸收效率。本文提供了在城市环境中分别在固定和移动条件下采集空气样品的操作方案。我们详细阐述了该方法的优势与局限性，并展示了其在实地应用中的可行性。通过多次实地部署所获得的数据，用于：1）通过与对照方法比较，评估基于野外采样的收集效率 原位 一氧化氮_x 浓度测定，2）在处理前检测储存溶液的稳定性，3）定量 原位 在多种城市环境中验证可重复性，以及 4) 展示 NO 中氮同位素的范围_x 在城市环境空气和交通繁忙的道路中均被检测到。

引言

大气中的氮氧化物（NO_x = NO + NO₂）是全球活性氮循环中的重要组分^1,2。大气中的NO_x具有高度反应性，可通过与臭氧（O₃）和羟基自由基（OH）的相互作用，直接增强大气的氧化能力。在对流层低层，NO_x通过氧化生成硝酸（HNO₃）或硝酸盐（NO₃^-）而被清除，其清除时间尺度为数小时至数天；这两种产物均具有高溶解度，可通过干沉降以气态或颗粒态气溶胶形式沉积于地表，或通过降水（例如，酸雨）进行湿沉降²。NO_x来源于多种途径，包括化石燃料燃烧、生物质燃烧、土壤中的微生物过程以及闪电。源解析对于理解各排放源的影响至关重要，但由于排放源种类繁多、在时空分布上具有变异性，且NO_x和HNO₃的寿命相对较短，仅依靠浓度分析难以准确评估其来源贡献。稳定同位素可作为一种有效手段，用于更精确地追踪环境中NO_x和NO₃^-的来源空间分布和时间变化趋势，并为大气模型提供新的约束条件³。迄今为止，不同NO_x来源相关的同位素特征仍存在较大不确定性，这在很大程度上是由于以往分析方法本身存在显著误差所致⁴。

以往的研究采用了多种不同的主动和被动采样方法，即使针对同一排放源，所报告的同位素值范围也存在较大差异。Fibiger et al. 指出，先前使用的方法在捕获 NO_x 的效率方面差异显著，环境条件的变化（例如温度、湿度、流速、溶液使用时间）会极大地影响野外采样效果⁴。以往 NO 和 NO₂ 捕获方法的低效可能导致同位素分馏。例如，¹⁴N 相较于 ¹⁵N 氧化速率更高，可能导致测得的 δ¹⁵N-NO_x 值偏低，无法真实反映大气中的同位素组成。除了方法学上的问题^4,17，多种不同类型的空气采样方式也可能导致同一来源相关同位素值报告范围的差异。例如，关于机动车排放 NO_x 的同位素特征，已有研究基于道路附近站点⁵、交通隧道⁶以及直接从车辆尾气管采集的样本^7,8提出。此外，以往方法的时间分辨率最多仅为 24 小时，而环境空气中 NO_x 浓度在小时级甚至更短时间尺度上已表现出显著变化⁹，这可能限制了同位素示踪技术在源识别中的应用。许多 NO_x 采集方法需要使用强氧化性溶液，这些溶液虽能将 NO_x 氧化为硝酸盐，但也会随时间推移将其他共采集的活性氮物种（例如铵盐）氧化为硝酸盐，从而可能干扰同位素测定结果。一些先前的方法仅能采集气态 NO₂ 进入溶液，这限制了对 NO_x 同位素的全面理解，因为未包含主要排放物 NO。因此，亟需采用一种一致且经过验证的方法，从不同排放源捕获 NO_x，以更准确地判断环境中 NO_x（以及 NO₃^-）同位素的变异性是否可用于直接追踪污染来源及其化学过程。

本文报道了一种基于野外的NO_x采集技术，可用于同位素分析，具备在多种野外环境中应用所需的时间分辨率、采集效率（100%）和重现性（≤1.5‰）。该方法最初由Fibiger et al.⁴描述，本文通过在野外变化的NO_x浓度和气象条件下验证其采集效率、测试溶液稳定性及氨干扰情况，并在城市环境中证实其重现性，进一步验证了该方法的可靠性。利用一种经实验室和野外共同验证的方法，高效地将NO_x捕获于溶液中，从而研究同位素值在空间和时间上的差异。本文展示了该方法在道路附近、道路上以及城市环境空气中采集样品的应用，时间分辨率为30至120分钟。

简而言之，NO_x （一氧化氮和一氧化氮₂) 在强氧化性溶液中从大气中收集为 NO₃^-同时，环境中的NO_x，一氧化氮₂，和 CO₂ 浓度及其他相关数据（如 GPS 位置和采样时间）被记录。样品采集后，需在实验室中对溶液进行处理，包括降低溶液以终止反应，随后中和溶液 pH 值，以便后续进行 NO 分析₃^- 浓度和同位素分析。NO₃^- 浓度通过自动分光光度法测定（即， 比色法）过程。氮同位素组成采用反硝化菌法测定，该方法可将NO定量转化为₃^- 在溶液中转化为气态 N₂O，随后在同位素比值质谱仪上进行测定。作为采样过程的一部分，还需采集并测定实验室和野外空白样品，以确保样品的完整性。以下是详细的分步操作方案。

方案

1. 溶液配制

1. 采样前，准备好溶液，校准 NO_x 分析仪（化学发光法或鲁米诺法），并检查系统是否正常运行，确认已安装新的滤膜。
2. 使用 1 M 高锰酸钾（KMnO₄）储备液和 10 M 氢氧化钠（NaOH）¹⁰ 配制采样溶液，然后用超纯水稀释至所需体积。
   注：建议购买预配制的溶液，因其通常比其他形式的溶液含有更低的“空白”硝酸根（NO₃^-）浓度。⁴
   1. 配制 10 M NaOH。
      1. 称取 200 g 固体 NaOH，倒入 500 ml 容量瓶中，加入超纯水（25 °C 时电阻率为 18.2 MΩ·cm）至容量瓶刻度线，使 NaOH 完全溶解。
   2. 由于该过程会放热，需将容量瓶置于室温（约 22 °C）水浴中，使其在溶解过程中冷却，通常需要 1–2 小时。将 10 M NaOH 储存于 500 ml 棕色塑料瓶中，最多可保存 1 个月。
   3. 在 500 ml 量筒中配制含 0.25 M KMnO₄ 和 0.5 M NaOH 的采样溶液（总体积为 450 ml）。
      1. 加入 112.5 ml 的 1 M KMnO₄ 溶液，然后用超纯水稀释至 405 ml。
      2. 加入 22.5 ml 步骤 1.2.1 中配制的 10 M NaOH 溶液，再用超纯水定容至 450 ml 刻度线。
   4. 将溶液储存于 500 ml 棕色玻璃瓶中，并在每瓶上标注配制日期（可用字母区分不同瓶子）。
   5. 溶液配制完成后，取一个实验室空白样。取出 25 ml 溶液，并记录其来源的溶液瓶编号。将空白样储存于 60 ml 棕色玻璃瓶中。
      注：每瓶溶液在取完实验室空白样后，应可提供 8–11 个样品（每个 35–50 ml）和一个现场空白样（25 ml）。

2. 实地设置

1. 选择一个采样地点（例如屋顶）并安装系统（如果使用固定式系统）。对于移动实验室，将所有仪器设备装入一辆普通乘用车中。参见 图1 有关自动化系统的示意图。
2. 更换所有标有标签的滤光片 图1 在采样前确保其工作状态达到最佳效率。
   注意：该系统包含三种类型的滤膜：聚四氟乙烯（PTFE）颗粒物滤膜（1.0 µm；47 mm 或 25 mm，空气污染较严重时使用表面积较大的滤膜），用于去除可能含有 NO 的颗粒物₃^-，用于去除HNO₃的尼龙膜滤器（1.0 µm）₃ 气体以及一个疏水性滤膜（10.0 µm），用于保护真空泵和临界孔口免受溶液液滴的影响。在采样周期开始时使用新的滤膜，颗粒物滤膜和NO₃ 滤膜在几天内无需更换，除非处于高度污染或灰尘较多的环境中。只要持续采样，疏水性滤膜应每4至6小时更换一次。
3. 安装系统时，将系统和仪器连接至聚四氟乙烯（PTFE）管（外径1/4英寸），并将进气口（同样为PTFE管）朝向目标空气采集方向。
   注意：移动实验室用于道路实地测量，而固定实验室用于城市环境空气和近道路测量。
4. 建立“移动实验室”，包括一氧化氮_x 收集系统，一氧化氮_x 盒，一个CO₂ 分析仪、全球定位系统（GPS）装置和船用电池。
   1. 将系统及所有仪器装入汽车中。使用12 V船用深循环电池为系统供电，持续约12小时，相当于一天移动测量的最大持续时间。在采样日结束时对电池进行充电，以备次日使用。
      注意：使用独立的电池，以免需要直接连接汽车电池或让汽车持续运行以进行测量。若采样时间接近或超过12小时，建议使用两块电池，以避免因充电而中断数小时。
   2. 将仪器连接至聚四氟乙烯进样管，该进样管位置应靠近进样口而非收集系统，因为系统的真空泵工作流速为3-5 L/min，远高于NO的流速。_x 箱（约1.5 L/min）或CO₂/₂O 分析仪（<1 L/min
   3. 将聚四氟乙烯进气管固定在车辆顶部前方，朝向车头方向，尽可能远离排气管，以避免采集到车辆自身排气管排放的气体。例如，在使用中型运动型多用途车作为移动实验室时，进气口位于车顶，距驾驶员侧车门2英尺，使其离地面高度为1.6米，距后保险杠2.54米。
      1. 或者，使用电动或其他零排放车辆。
   4. 每秒使用GPS设备记录地理位置和车辆速度数据（如需此类数据）。同步记录NO的笔记本电脑_x 和 CO₂ GPS时间早于测量时间的数据。
   5. 在采样当天开始时开启仪器，并在采样当天结束时关闭仪器，即使采集系统未运行也应如此（仪器需要预热时间，因此应保持全天运行，以避免多次预热）。
   6. 在采样日开始时，按照制造商的指示，向NOx分析仪中加入鲁米诺溶液，然后在当天结束、仪器关闭前，用水冲洗。为避免溶液降解，将鲁米诺及溶液样品存放在移动实验室的冷藏箱中。鲁米诺溶液需在冷藏设备中过夜保存。
   7. 校准 NO_x 基于鲁米诺的NO检测盒₂一氧化氮分析仪¹¹ 以及一个非分散红外（NDIR）CO差分传感器₂/₂O分析仪使用商用气体稀释校准仪，并按照制造商的说明进行校准。NO_x 盒子的响应时间约为5秒，能够更有效地分辨道路环境中的NO_x 排放羽流
5. 建立“固定实验室”，包括一氧化氮_x 收集系统和化学发光一氧化氮_x 浓度分析仪
   1. 将聚四氟乙烯（PTFE）管固定在表面，并使其朝向待采集的空气方向。
   2. 使用三通接头在PTFE管的入口处将其分开，以同时连接NO_x 分析仪和自动收集系统。
   3. 将固定系统连接至电源插座（120 V 交流电）。
   4. 运行 NO_x 在整个采样期间，即使收集系统关闭或切换样品时，也应使氮氧化物浓度分析仪持续运行。利用收集系统内置的阀门在此期间将其隔离开，以确保NO_x 分析仪正在采集环境空气。
   5. 校准化学发光一氧化氮_x 浓度分析仪。该仪器用于静态测量，因其响应时间较慢（>30 秒），更适合环境空气测量。
      1. 根据制造商的说明，使用气体稀释校准仪进行校准。用氮气稀释25 ppmv NO标准气体₂ 使用零空气在0–200 ppbv NO范围内获得约七个校准点。利用臭氧滴定仪对NO进行校准₂ 同一范围内的浓度（0–200 ppbv NO）₂).
   6. 若使用移动实验室，需校准NO_x 基于鲁米诺的NO检测盒₂一氧化氮分析仪¹¹ 以及一个非分散红外（NDIR）CO差分检测器₂/₂使用商用气体稀释校准仪并按照制造商说明对一氧化氮（NO）分析仪进行校准。_x 盒子的响应时间约为5秒，能够更有效地分辨道路环境中的NO_x 排放羽流

3. 样本采集

1. 对系统进行测试，确保流量计、注射泵、计算机软件和真空泵均能正常工作。开启各个组件，并检查其是否运行正常。使用计算机软件完成一次或两次采样程序，以确认所有设备均正常运行。
2. 开启系统，使空气通过溶液产生可见气泡。
   注：计算机程序可自动控制溶液在系统中的流动，但隔膜泵和真空泵需手动操作。用户必须选择合适的采样时间（30 至 120 分钟），以确保收集到足够的 NO_x，使样品浓度高于溶液的空白硝酸盐浓度。在车辆等污染源附近，大气中 NO_x 浓度为 50–100 ppbv 时，仅需 30 分钟采样时间；对于城市环境中的 NO_x 浓度（5–30 ppbv），采样时间应长达 120 分钟。根据步骤 6.5 和 6.5.1 中提供的公式，用户可反向计算出达到目标溶液浓度所需的采样时间。
   1. 使用配备注射泵的采样系统，自动将溶液从储液罐转移至气体洗涤瓶，并将溶液从气体洗涤瓶转移至废液容器。四个电子驱动阀和注射泵由专为该采样系统编写的计算机程序控制，程序包含四种模式：1）注入新溶液，2）清洗管路，3）采集样品，4）清洗气体洗涤瓶，具体如下：
   2. 为自动注入新溶液，从溶液储液罐中用注射泵吸取 35 ml 溶液（V_S），并将其注入气体洗涤瓶中。开启真空泵并引入气体样品后，气体洗涤瓶中的烧结滤板会使溶液产生气泡。
      注：根据所采样的 NO_x 浓度和预期采样时间，选择 25–35 ml 的溶液体积。
   3. 通过自动将管路中残留的溶液抽回注射泵并排入废液容器，清洗注射泵与气体洗涤瓶之间的管路。
   4. 当采样溶液进入气体洗涤瓶后，手动开启泵。当达到预定采样时间后，手动关闭泵。
   5. 采样完成后，打开气体洗涤瓶下方的自动阀门，使溶液依靠重力流入收集小瓶并加盖密封。当样品完成 NO_x 收集后，将溶液收集至 60 ml 棕色玻璃瓶中，并手动取出该瓶。程序会等待约 2 分钟，待溶液完全排空后，自动进入下一步。
   6. 溶液排空后，自动关闭阀门，并通过喷嘴将超纯水吸入注射泵，再注入气体洗涤瓶以清洗瓶壁。随后将清洗废水从气体洗涤瓶中吸入注射泵，并排入废液储液罐。将烧结滤板保存在 25 ml 的纳米纯水中。
   7. 重复步骤 3.2.2 至 3.2.6，以注入下一个溶液样品。
3. 在每次溶液瓶（在采样开始前以字母 A-Z 标记）采样过程中，采集现场空白样：将 25 ml 溶液通过系统，但不开启真空泵采集空气，并在溶液进入系统后立即收集该溶液。
4. 在每次采样过程中，使用流量计每 5 分钟记录一次体积流量，同时记录流量计上的空气温度（T）和压力（P），以计算标准状态下的流量。使用隔膜泵（容量 30 L/min）配合临界孔口，可实现 3–5 L/min 的流量。
   1. 在采样开始时设置流量，以大约每 1 秒测量一次流量。5–10 秒后，将流量测量频率调整为每 5 分钟一次。
   2. 在整个采样期间，每 5 分钟采集一次流量数据。
      注：若流量显著下降，应延长采样时间。初始流量出现小幅波动（<25%）属正常现象。应检查疏水性滤膜是否被覆盖至堵塞程度。
   3. 在停止采样前，恢复为每 1 秒测量一次流量，并在关闭采样前持续采集 5–10 秒的流量数据。
      注：溶液可在执行步骤 4 前最多储存七天。

4. 样品还原

注意：应在采集样品后的7天内完成样品处理以去除高锰酸钾（KMnO₄）。原始方法⁴建议必须在采样后24小时内完成此步骤。以下结果表明，样品在还原前可保存长达七天。

1. 溶液中的高锰酸盐是一种强氧化剂。通过还原样品以终止高锰酸盐与环境一氧化氮的氧化反应_x 或其他可能被氧化为硝酸盐从而导致干扰的氮形态⁴.
2. 标记两个400 ml烧杯，分别用于空白溶液和样品。准备两根搅拌棒，每个烧杯各用一根。同时准备一支500至5,000 µl移液器及配套的移液器吸头。
3. 称量装有溶液的样品瓶，记录满瓶的总质量。将溶液倒入烧杯后，再次称量空玻璃瓶的质量。
4. 将一份样品溶液倒入样品杯中，将一份空白溶液倒入空白杯中。
5. 对于样品烧杯，缓慢加入10 ml过氧化氢（H₂O₂）。₂O₂) 分批加入5 ml至样品中，每加入5 ml盐酸时均需剧烈搅拌₂O₂. 此体积适用于35 ml的样品溶液。每25 ml采样溶液（空白或样品）加入5 ml H₂O₂建议加入完整的5 ml，以确保少于25 ml的样品溶液能够完全转化，并可加入更多H₂O₂ 只会导致溶液被稀释。
   1. 加入前5 ml的H₂O₂ 置于烧杯上方，使尖端不接触烧杯、玻璃棒或溶液。
   2. 将第二批加入烧杯侧面及周围，随着加入量的增加，擦拭烧杯内壁，以确保所有样品溶液均被浓缩。若加入的 H 多于 5 ml₂O₂ 加入后，对最后5 ml的H引入执行此步骤₂O₂ 并按照步骤4.5.1进行H的中间导入₂O₂.
   3. 每次更换样本后均需更换移液器吸头，以避免任何交叉污染。
6. 对于空白溶液烧杯，仅加入 5 ml 的 H₂O₂加入约一半上述溶液，然后将另一半沿烧杯壁加入。每次空白试验后更换移液枪头。
7. 检查沉淀物上方的溶液是否澄清或呈淡黄色。如果仍存在紫色或蓝色，需加入更多 H₂O₂ 以验证其是否完全还原。
8. 将烧杯中的全部内容物（包括液体和形成的棕色沉淀）倒入已根据样品或空白编号或字母标记的50 ml离心管中。
9. 当所有溶液被还原后（H₂O₂ 加入后，以每次20个离心管的量分批装入离心机，确保离心机保持平衡。台式离心机通常一次可容纳20个离心管。
   1. 以 3,220 x g 离心力离心每批离心管，持续 15 分钟。
10. 离心机运行期间，称量空玻璃瓶并记录其质量。同时，标记60 ml棕色塑料瓶（此前已用超纯水浸洗清洁），并称量空塑料瓶，记录其质量。
11. 离心结束后，将上清液倒入棕色塑料瓶中（固体保留在离心管中），并妥善处理离心管。
12. 称量已装满样品的瓶子，记录其质量。

5. 样品中和

注意：请对样品和空白对照进行中和处理（此处内容更新并引自 Fibiger et al.⁴）。请注意，此步骤是溶液中硝酸盐浓度比色定量所必需的；但若采用其他浓度测定技术，此步骤可能无需进行。

1. 手动或使用自动滴定仪进行中和。
2. 对于手动中和，使用 12.1 M 盐酸（HCl），并通过移液管将其加入棕色塑料溶液瓶中。务必小心（佩戴护目镜、实验服，在通风橱中操作）， 等。处理盐酸（HCl）时，尤其是在12.1 M浓度下，需格外小心。
   1. 使用以下公式计算将 12.1 M HCl 加入样品溶液中以中和该溶液所需的体积：
      
      其中 V_HCl 是加入的 HCl 体积，质量_{完整的玻璃瓶} 是收集溶液的玻璃瓶与溶液的总质量，以及质量_空玻璃瓶 是收集溶液所用玻璃瓶在未装溶液时的质量。假设各溶液的密度均为1.00 g/cm³³，因为它们是稀释溶液。
      注意：先加入该体积的85%，每次加入0.20 ml。根据所采空气的成分不同，收集到的其他物质可能会降低原溶液的pH值，并改变其对酸添加的响应特性。
   2. 使用移液器和一次性吸头，以0.2 ml为增量，向瓶中加入总体积85%的HCl。每次加入0.2 ml后盖紧瓶盖并摇匀，确保酸液与溶液充分混合。取20 µl溶液，用移液器滴加到石蕊试纸上，检测pH值。
   3. 若 pH 值在 4 至 10 之间，将样品标记为已中和并记录 pH 值。对所有其他待处理样品重复步骤 4.2.1 和 4.2.2。尽管比色浓度分析可适用于 pH 低至 4 或高至 10 的样品，但仍应尽可能接近 7，以获得最佳结果。
   4. 如果在加入85%体积的溶液后pH仍高于10，则每次加入少于0.2 ml的HCl（如0.10或0.05 ml），每加一次HCl后摇动瓶子以混匀，并取20 µl溶液用石蕊试纸检测pH。
   5. 当 pH 值达到所需范围后，以与之前相同的方式将样品标记为已中和，并置于一旁。
   6. 如果pH低于4，使用10 M NaOH将pH调至正确范围。逐步减少NaOH的添加量，每次加入后用石蕊试纸按之前相同的方法检测pH。
   7. 记录 HCl 的用量（V_HCl) 和 NaOH（如需要）加入每个样品瓶中，并记录最终 pH 值。
3. 对于自动滴定仪法，使用自动滴定仪。
   1. 将12.1 M HCl用超纯水稀释至4 M，并根据仪器说明将其加入滴定仪（可加入0–25 ml盐酸）。使用4 M盐酸可在不向样品中添加大量液体的情况下，确保滴定仪具有足够的精确度。
   2. 将自动滴定仪设置为滴定至 pH 7。
   3. 记录最终 pH 值和加入的 HCl 体积。将样品标记为已中和，并记录最终 pH 值。
   4. 每次滴定使用同一个烧杯。每份样品之间，用超纯水将烧杯、pH探针和搅拌子至少清洗3次，并晾干。

6. 样品测量

1. 使用采用比色化学法测定浓度的分光光度营养分析仪，测量各样品（C_B 或 C_S）的浓度。
2. 根据仪器制造商的说明，准备样品并将其放入仪器中。
3. 使用 30 µM 的 KNO₃ 储备液，制备 0–15 µM 硝酸盐的标准校准曲线（共 7 个校准点）。
4. 与样品一同制备并运行 8 和 10 µM 硝酸盐的质量控制样品。计算多次运行中质量控制样品的合并标准偏差，以评估浓度的不确定性。通常观察到的合并标准偏差为 ±0.4 µM（在 7 次运行中，N = 27 个数据点）。
   1. 使用以下混合比公式，将比色浓度分析仪测定的 NO_x 浓度从 μM 转换为 ppbv：
      
      其中 MR_NOx 为 NO_x 的混合比（以 ppbv 报告的值），n_NOx 为收集到的 NO_x 的物质的量（单位为 nmol），R 为理想气体常数，单位为 ，T 为温度（单位为开尔文），P 为大气压（单位为 atm），V 为采集的空气体积（单位为 L）。采样气体的总体积通过流量时间序列的数值积分确定（等同于流量-时间曲线下面积）。
   2. 使用以下公式组计算 NO_x 的物质的量：
      
      用于样品，
      
      用于空白，以及
      
      其中 C_S 为比色浓度分析仪测得的样品浓度，单位为 µmol；V_S 为样品体积，单位为 ml；C_B 为空白样品浓度，单位为 µmol；V_B 为空白样品体积，单位为 ml；V_aliquot 为中和部分的体积，单位为 ml（通常为溶液的总体积）；V_HCl 为中和等分试样所加入的 HCl 体积，单位为 ml。

7. 氮同位素比值样品制备

注意：基于反硝化细菌法测定氮同位素组成。该方法的详细信息已在其他文献中完整发表，使用者应参考这些文献以获取完整的方法说明^12,13。该方法利用反硝化细菌将液态硝酸盐（NO₃^-）样品转化为气态一氧化二氮（N₂O），用于同位素测定。尚未建立反硝化细菌法的使用者，可委托外部机构进行同位素组成分析。使用者应与这些机构沟通，确保所采用的数据校正方法与第8步中的要求一致。

1. 根据每个样品和空白样的浓度，将相应体积的溶液注入预先准备好的、带盖的含菌小瓶中^12,13。通过将目标注入量（例如 20 nmol N）除以样品或空白样的浓度（µmol/L），计算出需用注射器注入每个小瓶的毫升数，以达到特定的注入量。
   1. 每批进行同位素分析的样品中，至少需对硝酸盐标准物质（例如 IAEA-NO-3 和 USGS34）进行三份平行注入。这些标准物质用于校正最终数据，使其符合国际公认的标准值¹⁴。
   2. 准备两个烧杯，装入超纯水，用于在注入样品和标准物质之间冲洗注射器。另准备一个空瓶收集废液。
   3. 将用于注射的注射器尖端浸入第一个盛水烧杯中，随后取出并擦干。用超纯水充满整个注射器体积并排空，将水作为废液弃去。重复此步骤三次。
   4. 参照步骤 3.2.3 的方法，先用少量样品填充注射器以预冲洗内壁，随后将该部分样品作为废液弃去。重新吸取样品，并轻轻敲击注射器以排除任何气泡，确保准确量取所需体积。
   5. 将样品注入样品小瓶。
      1. 若注入样品体积超过 3 ml，应使用第二根“排气”针以释放小瓶内压力。先将装有样品的注射器插入橡胶隔垫并开始注入样品。当已注入 0.5 ml 后，插入第二根“排气”针。保持“排气”针插入状态，直至剩余约 1 ml 样品待注入时，再将其拔出。继续完成剩余样品的注入。
   6. 将小瓶置于温暖环境（约 24 °C）中过夜孵育。次日早晨，向每个样品中注入 0.1 至 0.2 ml 的 10 M NaOH 溶液，以裂解细菌。

8. 同位素比值测定

注意：细菌裂解后，样品即可用于同位素比值质谱仪（IRMS）分析。

1. 每个样品在上机进行质谱分析前，需加入三到四滴消泡剂。
2. 通过离子比质谱法测定同位素组成。使用配备改进系统的质谱仪，该系统可实现自动化提取和纯化（去除CO₂中的CO）₂ 和 H₂O）以及氮的同位素分析₂O at m/z 44、45 和 46^{12, 13}.
3. 每次运行开始时，在样品瓶中仅加入培养基溶液而不加样品，作为空白对照。
4. 使用标准参考物质校准质谱仪测得的原始同位素比值（例如， IAEA-NO-3 和 USGS 34）与样品采用相同方式处理，依据 Kaiser 的校正方案 等人 (2007)¹⁵这使其能够以一种可被氮同位素生物地球化学研究领域的其他实验室用于数据比对的形式呈现。
5. 由于担心质谱仪数值的线性问题，如果进样样品的峰面积超出目标面积的±10%，则需按该百分比调整浓度，并按照上述步骤重新进样。
   1. 为完成样品数据中 δ 的最终处理¹⁵NO 的数量_x （δ符号的定义使用以下方程表示：δ¹⁵N：（“δ15-N”）：δ¹⁵N = [（¹⁵N/¹⁴N_样本/¹⁵N/¹⁴N_标准) - 1] × 1,000‰，氮样品所用标准为大气N₂ 气体），校正 δ¹⁵N 代表在 KMnO₄ 中测得的硝酸盐空白的贡献₄ 溶液
      
      其中 δ¹⁵N_{总量，测量值} 是从质谱运行中为样品测定的值，δ¹⁵N_{空白，已测量} 是空白样品测得的值，样品浓度和空白浓度则是通过比色分析确定的数值。该方程消除了空白对同位素比值的影响，从而使同位素比值能够准确反映NO的特征_x 收集 原位.
      注意：每批所用溶液均需测定空白溶液中硝酸盐的同位素组成和浓度。该空白与仅使用反硝化方法时可能遇到的任何潜在空白不同（后者也在每次运行时进行量化）。与反硝化方法相关的空白对所有样品和参考物质均适用；然而，高锰酸钾溶液空白仅适用于样品，因此必须单独对其进行量化，并通过质量平衡进行校正。

结果

在Fibiger的原始方法开发研究中 等，一氧化氮_x 采集方法在实验室中经过了多种条件下的严格测试⁴. 本文重点介绍该方法在多种环境条件下的更新及其现场应用。报告结果包括：（1）现场采样效率，（2）样品溶液在还原前的时间稳定性以及对高浓度铵根离子（NH₄⁺）的敏感性₄⁺溶液中的浓度，以及（3）在实际环境中的可重复性。该方法的通用性体现在其适用于环境空气、近道路和道路沿线的测量。

溶液中收集的平均浓度与1 min NO的浓度进行了比较_x 化学发光NO的浓度_x 分析仪在罗德岛普罗维登斯市的环境城市空气中进行为期两天的昼夜研究。 图2 详细描述了在浓度变化范围较大的一段时间内（从约2.5–18 ppbv NO）的收集效率_x. 图2A 显示中位数NO的直接比较_x NO 的浓度_x 分析仪测得的浓度与根据溶液和流量测量值计算出的浓度相比，表明溶液浓度平均为中位数的92% 原位 浓度。这处于预期的±10%不确定度范围内，但差异可能反映了采集期间浓度的变化图2B）。根据1分钟NO分布百分位数的分析_x 浓度数据，基于溶液的NO_x 浓度在每个采集时间间隔的分布范围内（图2B).

建议在野外样品采集完成后1天内完成样品的还原处理即， 完成步骤3的全部操作）。该目标的设定旨在减少收集其他可溶性氮形态（如NH₃，可在强氧化性KMnO₄环境中转化为硝酸盐₄随时间推移，NaOH 溶液中的样品变化情况。为更具体地验证这一点，于 2015 年 5 月和 7 月在美国罗德岛州普罗维登斯市布朗大学校园内的一处装卸码头采集样品，该地点靠近一条经常有柴油运输车通行的地方道路，且柴油车常在此处怠速运行以进行卸货。样品采集后，将部分样品分装，并在采集后的不同时间点（1 天、4–7 天以及 13–15 天）进行还原处理。图3A）。样品在 图3B 5月和7月也采集了样品，但制备时向450 ml溶液中加入5 ml 10 mM氯化铵，最终得到111 µM NH的浓度₄⁺ 在溶液中，相当于收集了220 ppbv 的 NH₃ 在空气中，如果仅有 NH₃ 被采集。这些浓度是在道路附近进行实际道路测量时预期的最大值，靠近车辆NH₃ 来源¹⁶。无论是否添加 NH₄⁺，与首次还原（采集后1天内）相比，在采集后7天内进行还原的样品具有稳定的同位素比值，均落在预期的±1.5%不确定度范围内图3A 和 3B）。需要注意的是，±1.5% 的不确定度代表了对储气罐中 NO 进行多次采集样品后同位素测定的典型变异水平。_x⁴仅对同位素参考物质进行重复测量所关联的不确定性通常为0.3%。然而，两周后，无论是否添加NH₄⁺ 并不一定稳定。尽管在某些情况下同位素值似乎仍然一致（例如， 图3A），样品表现出少量一氧化氮₃^- 浓度增加（<与第一次还原相比，在某些情况下，NO的还原电位正移约1 µM，并且NO的还原电流有所下降₃^- 浓度。加入的 NH₄⁺，原本预期一氧化氮（NO）₃^- 浓度会 增加 随时间推移，浓度测量值超出预期的不确定度范围（约 0.8 µM），表明即使在两周后，NH₄⁺ 并非干扰来源。需要进一步实验以更好地理解这种不稳定性产生的根源。尽管如此，值得注意的是，在相同时间过程中未作处理的空白溶液始终未显示浓度变化或仅呈现轻微上升，因此该不稳定性必然是由环境城市空气中存在的其他组分所引起。在该问题解决之前，建议在样品采集后的7天内完成样品溶液的还原处理。

图4 详细展示了在城市、近道路及道路上的不同野外考察中，使用移动装置进行样品采集的情况。NO_x 浓度范围跨越了三个数量级，同位素比值范围为 -1 至 -13‰。该采样集包括在52小时内采集的51个道路上样品，行驶里程超过4,000公里，涵盖了多种驾驶条件（例如，频繁启停的拥堵交通至高速公路上车流量极少的情况）。采样在罗德岛州普罗维登斯市及宾夕法尼亚州费城和匹兹堡、俄亥俄州克利夫兰、哥伦布和辛辛那提等6个主要城市之间及内部的道路进行。平均车辆速度范围为12.4 km/hr 至 119.7 km/hr。近路边样品（N = 27）采自罗德岛州普罗维登斯市I-95公路的一个监测点。城市环境空气样品（N = 44，采集时长117.5小时）取自中国台湾普罗维登斯市的两个屋顶采样点，一个靠近I-95与I-195公路交汇处，另一个距离该交汇点775米。这些数据代表了在解析NOx来源同位素特征范围方面迈出的初步步骤，本案例中特指机动车排放和城市环境来源。白天道路上及路边δ¹⁵N-NOx的变化（图4）与驾驶条件的变化无相关性，且出现在车辆燃油类型交通流量相对恒定的情况下。关于不同车辆燃料类型导致同位素特征变化的更详细讨论，见另一篇论文（Miller, D.J., et al. 2016. J. Geophys. Atmos. Submitted）。

最后，表1详细列出了同时部署两种采样系统的野外和实验室采样情况，以检验其可重复性。比较结果显示，同位素数据具有极好的一致性，此处以每个采样周期两个数据点之间的绝对偏差来量化。数据来自以下采样：美国罗德岛州普罗维登斯市屋顶处的城市大气采样；美国罗德岛州普罗维登斯市路边附近采样；以及美国马萨诸塞大学阿默斯特分校实验室烟雾箱内的采样。

图1： 采样系统示意图与实物图。（A）自动NO_x采样系统示意图。灰色表示气流，蓝色表示水/溶液流动，绿色表示电子连接，黄色表示砂芯漏斗，紫色表示高锰酸钾溶液。注射泵用于添加和移除冲洗液（超纯水），以及在开始采样时加入新的溶液（该注射泵为市售的步进电机驱动注射泵，配备50 ml注射器、五通分配阀及带有RS-232串行接口的驱动/控制电路板）。样品通过气体洗涤瓶底部的黑色阀门手动取出。（B）移动实验室中NO_x采样系统及NO_x分析箱的实物照片。请点击此处查看该图的放大版本。

图2： 自动采集系统的采集效率 (A一氧化氮（NO）_x 根据一氧化氮计算的浓度₃^- 溶液中测得的浓度与化学发光NO测定的中位浓度进行比较的流动数据_x 位于罗德岛州普罗维登斯市一处屋顶站点的浓度分析仪。误差棒表示基于质量控制（0.4 µM）在比色浓度测量运行中合并的标准偏差以及流速不确定性（±1%）传递误差所推导出的溶液法NOx混合比估计值的标准偏差（±1σ）。NO_x 分析仪浓度的不确定度为 ±5%。BNO的时间序列_x 浓度分布在罗德岛普罗维登斯市某屋顶站点进行的昼夜测量期间的变化。方框代表25^th, 50^th，以及 75^th 百分位数。须线表示不包含离群值的极值。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图3：2015年5月和7月在布朗大学采集的NO_x样品还原时间的比较。（A）结果以首次还原（采样后1天内完成）为基准计算偏差值。5月的样品用三角形表示，7月的样品用圆形表示，不同颜色代表不同的采样时段。（B）样品在空气采集前经氯化铵预处理，用于检测溶液中NH₄⁺随时间推移对测定的干扰。虚线表示同位素采集方法预期的整体精密度，以±1.5%的标准偏差表示。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4： 环境城市空气、道路沿线及近路地点采集样品的δ¹⁵N-NO_x（‰）与 NO_x 浓度。 不同样品类型以不同颜色标示，代表一系列不同条件（见正文）及 NO_x 浓度。 请点击此处查看该图的放大版本。

 

样品名称	系统编号	采集日期	采集时长（小时）	温度 (ºC)	[NO3-] (µM)	空白/总氮	δ 15N (‰)	δ 15N 偏差 (%)
城市空气 PVD 1	1	2013年10月8日 - 2013年10月9日	6.75	15.8	14.43	0.3	-0.6	0.7
	2				16.78	0.26	-1.3
城市空气 PVD 2	1	2013年11月6日 - 2013年11月7日	2.5*	17.1	30.86	0.2	-7.7	1
	2		5.25		37.05	0.17	-6.7
城市空气 PVD 3	1	2013年11月20日 - 2013年11月21日	8.9	3.28	44.29	0.14	-7.1	0.4
	2				29.66	0.21	-6.7
近路边 1	1	2014年8月14日 - 2014年8月15日	29	19.2	13.3	0.37	-9.47	0.69
	2				16.4	0.3	-10.16
近路边 2	1	2014年8月17日 - 2014年8月18日	30	21.85	9.4	0.68	-8.95	1.56
	2				11.6	0.55	-7.39
近路边 3	1	2015年5月25日	3.5	20	6.86	0.51	-7.67	0.86
	2				9.49	0.42	-8.53
近路边 4	1	2015年5月26日	2.75	25.56	6.07	0.656	-8.7	1.57
	2				6.49	0.61	-7.13
烟雾室 1	1	2014年8月26日 - 2014年8月27日	24.4	21	24.392	0.27	-12.28	0.33
	2				33.2	0.2	-12.61
烟雾室 2	1	2014年8月27日 - 2014年8月28日	19.8	21	10.96	0.54	-10.22	1.25
	1				14.245	0.41	-11.47
烟雾室 3	1	2014年8月28日 - 2014年8月29日	24.2	21	7.476	0.8	-5.86	1.27

表1：使用两个相同的采样系统在同一时间采集样品的重现性。* 由于滤膜堵塞，采样被迫中止。城市空气PVD（PVD = 美国罗德岛州普罗维登斯）1-3此前已有发表⁴。近路边代表在美国罗德岛州普罗维登斯的路边采样；烟雾室代表在美国马萨诸塞大学阿默斯特分校烟雾室内采集的空气样品⁴。

讨论

上述方案详细描述了从野外采集溶液中的空气样品到实验室对这些溶液进行处理，以获得浓度和同位素结果的各个步骤。该方案中的关键步骤包括对NO_x 分析仪测量，尽量缩短溶液还原前的时间，并保持稳定的流速。若直接比较不同溶液， 原位 一氧化氮（NO）的检测_x 浓度，一氧化氮（NO）的准确测定至关重要_x 分析仪已针对所选环境的相关范围进行校准，并且一氧化氮的短期变异性_x 浓度应在溶液较长采集时间的背景下加以理解。溶液中NO的准确定量₃^- 浓度也十分重要，既可用于计算空气中的NO_x 浓度以及确定同位素反硝化方法中精确的进样体积。样品还原前溶液的稳定性时间至关重要，以确保同位素比值的一致性。由于溶液具有氧化性，可能在溶液中氧化其他活性氮物质，尤其是NH₃，因为在某些区域其浓度可能足够高，从而影响NO的浓度₃^- 在溶液中。NH₃的氧化₄⁺ 一氧化氮₃^- 预计比一氧化氮的氧化过程耗时更长_x 一氧化氮₃^-因此，建议在样品采集后1天内对样品进行处理（从而终止反应）。鉴于野外条件可能需要更长的溶液保存时间，通过检测添加与未添加铵盐的溶液，对溶液的稳定性进行了测试。无论是否添加氯化铵，浓度和同位素值在长达一周的时间内均保持稳定，变化范围在1σ不确定度（1.5‰）以内图3). 采样两周后，向溶液中加入或不加入 NH₄⁺ 不稳定，即一氧化氮₃^- 在某些情况下观察到浓度降低，空白校正不再可靠。尽管预计 NO₃^- 可能会随着时间的推移因NH而增加₄⁺ 氧化，某些情况下实际上观察到了浓度下降，表明即使在两周后，NH₄⁺ 干扰并非导致不稳定的原因。因此，溶液应在一周内使用完毕，特别是在高NH环境中采样时₃ 浓度（例如， >200 ppbv）。最后，在野外采样期间记录流速也至关重要。进样口测得的流速可能变化较大，即使系统中装有临界孔径装置也难以控制，因为疏水性滤膜和/或烧结滤片的堵塞均可能影响流速。建议定期记录流速（例如， 在采集期间每隔5分钟记录一次，以便准确定量每个样本在一段时间内所采集的空气体积（见步骤5）。

所介绍的实验方案存在多种替代方法或可能的修改。例如，反硝化细菌法的一个重要优势是所需样品量较少^12,13。然而，也可采用其他同位素方法。同样，我们使用比色法测定浓度，但其他方法亦可获得准确的NO₃^-浓度结果。

现场采集效率，如图2所示，为92 ± 10%。这一效率至关重要，可确保采集过程中不发生分馏。当采集效率低于100%时，采集过程可能发生分馏，从而导致所测得的同位素比值出现偏差。该新型采集方法在受城市影响的大气条件下多种环境中的有效性已得到验证。表1列出了在环境空气、近路边及烟雾室采样条件下开展的多项测试，以评估该方法的可重复性。各系统之间的同位素比值差异均<1.57‰，表明该方法在不同采样条件下均具有良好的可重复性。基于现场的方法其精密度和可重复性显著优于环境中观测到的约~12‰的同位素比值变化（图4）。

该方法最主要的局限性在于一氧化氮₃^- 与KMnO相关的空白或背景₄ 溶液。多种 KMnO₄ 已测试的类型（例如， 晶体、粉末和储备溶液⁴，且均含有 NO₃^- 在暴露于NO之前_x 在空气中。因此，有必要收集足够的NO_x 一氧化氮₃^- 在溶液中使其浓度高于空白对照。目前正在进行进一步研究，以确定样品浓度应超出空白对照浓度的程度，从而获得最准确的结果。在极低环境NO条件下_x 浓度较低时，可能需要调整采集条件以最大化样本浓度。例如，可提高流速，以便在更短时间内采集更多空气，或减少溶液体积，以增大气液体积比，从而浓缩空气采集物。无论何种情况，溶液液面必须保持在采集容器的烧结滤板以上，以确保空气持续通过溶液形成气泡。

该NO_x采集方法用于同位素分析，在现有方法（例如，被动采样器^6,17以及硫酸和过氧化氢溶液⁸）中具有独特性，因其已在实验室和野外条件下针对现场适用性、可重复性、样品溶液稳定性以及在多种野外条件下的采集效率进行了验证 。该新方法的独特之处在于，能够在环境浓度下主动采集野外环境中NO_x，时间分辨率为30–120分钟。该方法对NO_x的采集效率接近100%，且已多次证明其在方法不确定度范围内具有良好的可重复性。野外采集的样品溶液在需要还原前可保持稳定长达1周。该方法适用于不同浓度和同位素比值范围的样品采集，并已证明在多次采样之间具有可重复性。该技术可用于多种不同条件下的采样，包括采用本方案中所述的移动实验室方法进行道路现场采样。关于机动车排放NO_x时空变异性的解释，将另文报道（正在准备中） （Miller, D.J., et al. 2016.  J. Geophys. Atmos. Submitted）。

未来取样包括将该方法应用于其他类型的NO_x 排放（例如， 土壤和生物质燃烧中微生物产生的排放物。 同位素是追踪一氧化氮的潜在方法_x 来源，但前提是不同来源的特征信号能够被量化并理解。我们的新方法使得量化NO的同位素组成成为可能_x 来自多种一氧化氮（NO）_x 排放源，并直接检验环境中排放物的影响是否能够被直接且定量地追踪。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
气体洗涤瓶			定制设计，多家公司出售其他类型的气体洗涤瓶。瓶内需带有烧结过滤板。
注射泵	Kloehn	Kloehn Versa Pump 6, 55 系列
PTFE 隔离阀	Parker	002-00170-900	两个三通和两个两位双通常闭式电子驱动阀
气体处理特氟龙管	McMaster Carr	5033K31	外径1/4英寸、内径1/8英寸的聚四氟乙烯管
液体处理用Tygon管	McMaster Carr	5103K32	外径1/4英寸、内径1/8英寸的聚四氟乙烯管
压缩气体接头和球阀（ assorted）	Swagelok	各种	不锈钢
流量校准器	MesaLabs	Defender 520
压缩式PFA接头	Cole Parmer	各种	气体与液体处理
数据采集板	国家仪器公司	NI USB-6001	用于阀门切换
固态继电器	Crydom	DC60S5	用于阀门切换
单级滤器组装	Savillex	401-21-25-50-21-2	使用直径为25 mm和47 mm的样品托
尼龙膜滤器	Pall Corporation	66509	1 μm 滤膜，包括 25 mm 和 47 mm 直径的滤膜
疏水性膜过滤器	Millipore	LCWP04700	10.0 μm，25 mm 和 47 mm 直径滤膜
颗粒膜过滤器	Millipore	FALP04700	1 μm 滤膜，包括 25 mm 和 47 mm 直径的滤膜
微型隔膜泵	KNF	联合国 816.1.2 KTP	用于固定式实验室
微型隔膜泵	KNF	PJ 26078-811	用于移动实验室
铝	Onlinemetals.com	6061-T6	按尺寸切割以构建系统
深循环动力蓄电池	EverStart	24DC
MilliQ 水	Millipore	ZMQSP0DE1
高锰酸钾 1 N 溶液	Fischer Scientific	SP282-1
氢氧化钠颗粒	Fischer Scientific	S318-1
Ohaus 台式天平	先驱者	EX224N
4盎司琥珀色玻璃瓶	Qorpak 瓶子	GLC-01926	（60 毫升和 WM 125 毫升瓶）
琥珀色高密度聚乙烯瓶	菲舍尔布兰德	300751	125 ml 细口瓶的部件编号，两种规格（125 ml 广口瓶和相同体积的细口瓶）
预清洗的美国环保署琥珀色广口瓶，500 ml	Cole Parmer	EW-99540-55
30% 过氧化氢	Fischer Chemical	H325-500	腐蚀性
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	5821020010
50 ml 聚丙烯圆锥形离心管	Falcon	14-432-22
12 N 盐酸	Fischer Scientific	A114SI212	腐蚀性
比色法营养分析仪	Westco Scientific Instruments	SmartChem 170	购买比色营养分析仪时，会附带缓冲液、清洗液、冲洗液以及仪器运行所需的溶液，包括用于激活仪器中镉柱以进行硝酸盐分析的溶液。
自动滴定仪	Hanna Instruments	HI 901
20 ml Clr 顶空瓶	Microleter，一家WHEATON公司	W225283	所列信息  适用于20 ml小瓶。也可从所列供应商处购买50 ml小瓶。
隔垫，20 mm 灰色丁基橡胶塞	Microleter，一家WHEATON公司	20-0025
密封盖，20 mm 标准铝制	Microleter，一家WHEATON公司	20-0000AS
25 G × 1 1/2 BD PrecisionGlide 针头	BD	305127
26 G × 1/2 英寸 BD PrecisionGlide 针头	BD	305111
氦		05078-536	可从多个不同来源订购
压接钳/退针器	WHEATON	61010-1
异丙醇	Fischer Chemical	A459-1
用于质谱进样的不同规格注射器	BD	根据大小而异
Antifoam B 乳液	Sigma-Aldrich	A5757-500ML
IRMS	ThermoFischer Scientific	IQLAAMGAATFADEMBHW	此处列出的是实际使用的同位素比值质谱仪。我们的配置还包括一个气相接口和一个自动进样器。
Gass Bench II	ThermoFischer Scientific	IQLAAEGAATFAETMAGD
TriPlus RSH™ 自动进样器	ThermoFischer Scientific	1R77010-0200	选择用于顶空进样的产品
42i 型 NOx 浓度分析仪	赛默飞世尔科技	101350-00
NOx 盒	Drummond Technologies	LMA-3D/LNC-3D
CO2 分析仪	Licor 7000	7000
全球定位系统	Garmin	010-00321-31
Model 146i 动态气体校准仪	ThermoFischer Scientific	102482-00
Model 111 零空气供应装置	ThermoFischer Scientific	7734
50.2 ppm NO in N2 气体标准	普拉克西斯空气	将随每次购买的标准空气钢瓶而变化