方法文章

工程人为因素来特异性地操纵人细胞中的选择性剪接

DOI：

10.3791/54967

⸱

2017年4月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Computational Biology, CAS-MPG Partner Institute for Computational Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences (SIBS), 2Institute of Cancer Stem Cell, Second Affiliated Hospital, Cancer Center, Dalian Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该报告介绍了一种生物工程方法来设计和构建特异性调节在哺乳动物细胞中靶基因的剪接新颖人工剪接因子（ASFS）。该方法可以进一步扩展来设计各种人为因素来操纵RNA代谢的其它方面。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

大多数真核RNA的处理是由RNA介导的结合的模块化配置，包括一个RNA识别模块，其特异性地结合前mRNA靶和效应结构域的蛋白质（限制性商业惯例）。以前，我们已经利用所述PUF结构域的独特RNA结合模式在人类Pumilio 1，以产生一个可编程的RNA结合的支架，将其用于设计各种人造限制性商业惯例来操纵RNA代谢。这里，详细的协议描述来构建专门设计用于调节靶基因的可变剪接工程剪接因子（ESFS）。该协议包括如何设计和构建定制的PUF支架用于特定RNA靶，如何通过融合设计者PUF结构域和效应子结构域，以及如何使用ESFS来操纵目标基因的剪接以构建ESF表达质粒。在该方法的代表性结果，我们还描述了常见的测定法的使用拼接记者，ESF的培养的人细胞中的应用，和剪接改变后续效应ESF活动。按照本报告中的详细协议，它可以设计并为不同类型的选择性剪接（AS）的规ESFS，提供了一个新的战略研究剪接调节和不同的剪接异构体的功能。此外，通过用设计PUF域融合不同的功能结构域，研究人员可以设计靶向特定RNA操纵RNA加工的各种步骤人为因素。

引言

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大多数的人类基因经历选择性剪接（AS），以产生多种同种型具有不同的活动，这大大增加了基因组1,2的编码的复杂性。 AS提供的主要机制来调节基因的功能，并且在不同的细胞和发育阶段3,4通过各种途径紧密调节。因为拼接错误调节是人类疾病5，6，7，8的常见原因，靶向剪接调节正在成为一种有吸引力的治疗路线。

根据剪接调节的简化模型，如由剪接调节顺 -elements（SRES）中前mRNA剪接增强子或替代外显子沉默发挥功能的主要控制。钍ESE的SRE具体招募各种反式作用蛋白因子促进或抑制剪接反应3,9（ 即剪接因子）。大多数反式作用剪接因子有单独的序列特异性RNA结合域认识到自己的目标和效应域控制剪接。最熟知的例....

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方案

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通过重叠PCR 1. PUF支架与定制的构建RNA结合特异性

  1. 设计一系列的包含在每个位置12（参照表1的引物序列和参见图1， 一种用于在RNA:PUF识别码）特异性识别不同的RNA核苷酸序列PUF的PCR引物。对于每个PUF重复，设计四个不同的引物识别每个位置的不同基地。
    注意:这些引物将在一系列的四个回合的PCR反应中使用，以生成连接在一起的（ 图1B）PUF片段。
  2. 选择替代剪接位点附近的靶基因的识别位点。
    注意:这个网站可以由用户来决定，通常选择在10 - 50 NT从选择性剪接位点。
  3. 轮1:生成编码序列4 PUF重复，通用桥接片段和帽片段。
    1. 使用目标站点定义定制的PUF的每次重复的识别码。选择该组的PCR引物用于PUF重复1 - 8.行为四个连续轮PCR，以产生定制的PUF结构域，如下所述（ 图1 的B）。
    2. 在第一轮PCR中，设置了标准的PCR反应混合物（含有2.5微升10X缓冲液，0.5微升10毫摩尔dNTP，0.5μ....

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结果

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这份报告描述了ESFS和拼接记者的设计和施工的完整的协议。它还概述ESFS的操纵内源基因16的AS的进一步应用。为了说明的ESF介导的拼接变化的典型结果，我们使用的数据来自我们以前的工作作为一个例子。具有不同的功能结构域的ESFS可用于促进或抑制靶盒外显子（ 图1 D＆E）的夹杂物。 ESFS也可影响在报道系统（ 图1 F＆G）替代5'和3'剪接位点的使用。

内源基因的可变剪接也可以与设计师ESFS进行具体调整。我们已经证明了通过规范这个应用程序ifically靶向的Bcl-x，它可以被拼接成具有替代5' 剪接位点的两种拮抗同种型。我们设计了一个ESF，.......

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讨论

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本报告详细描述了可以特异性操纵靶基因选择性剪接的人工剪接因子的设计和构建。该方法利用PUF重复的独特的RNA结合模式产生具有定制特异性的RNA结合支架。它可以用于激活或抑制拼接。

该协议中的关键步骤是生成定义了ESF特异性的重新编程的PUF结构域。已经开发并优化了PCR拼接方案，用于快速生成PUF支架。其成功的关键是将不同重叠模板的比例调整为1:1:1。每次循环后PCR产物的纯化也至关重要，因为未纯化的产品可能会含有上一轮的底漆污染。另一个重要的步骤是使用半定量RT-PCR来测定剪接比率。一般也是男人ý扩增循环应该避免，因为它们可能饱和PCR反应。在我们与剪接记者的共表达的实验中，20 - 25个循环进行了常规使用的，但是这可以根据丰度mRNA的测量内源基因的剪接时变化。当使用新的引物对量化剪接异构体，建议校准每次PCR的实验中，如先前所描述16。

与设计师ESFS的潜在限制在于它们的脱靶效应，因为该特异性是由在PUF支架重复的次数来确定。野生型PUF识别的8个核苷酸位点，这.......

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披露

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作者没有什么可以披露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作是由美国国立卫生研究院资助R01-CA158283和国家自然科学基金委员会授予31400726到ZWYW由青年千人计划和中国国家自然科学基金（赠款31471235和81422038）的资助支持。 XY是由中国博士后科学基金会（2015M571612）资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
含 PCR 缓冲液的高保真 DNA 聚合酶 （Phusion High-Fidelity）New England BiolabsM0530L
DNA 连接酶（T4 DNA 连接酶）New England BiolabsM0202L
脂质体转染试剂 （Lipofectamine 2000）Invitrogen11668-019
还原血清培养基 （Opti-MEM）Gibco31985-062
RNA提取缓冲液（TRIzol 试剂）ambion15596018TRIzol 试剂含有苯酚，可引起灼伤。处理
PBS 时戴手套 （1x）Life Technologies10010-031
SuperScript III 逆转录酶 （RT）Invitrogen18080044
Caspase-3 抗体Cell Signaling Technology9668
PARP 抗体Cell Signaling Technology9542
Bcl-x 抗体BD Bioscience610211
β-肌动蛋白抗体Sigma-AldrichA5441
α-微管蛋白抗体Sigma-AldrichT5168
FLAG 抗体Sigma-AldrichF4042
硝酸纤维素膜Amersham-PharmaciaRPN203D
ECL Western Blotting 检测试剂InvitrogenWP20005
Cy5-dCTPGE HealthcarePA55021
荧光激活细胞分选仪 （FACS）BD BioscienceFACSCalibur 
杜尔贝科s 改良鹰's 培养基 （DMEM）GE HealthcareSH30243.01
胎牛血清 （FBS）Invitrogen26140079
碘化丙啶 （PI）SigmaP4170
牛血清白蛋白 （BSA）SigmaA7638-5G
Triton-X100PromegaH5142
聚-L-赖氨酸 SigmaP-4832过滤灭菌并储存在 4 &°;C
载体 pWPXLdAddgene12258
载体 pMD2.GAddgene12259
载体 psPAX2Addgene12260
DNase I（无 RNase）New England BiolabsM0303S
寡核苷酸（dT）18 引物Thermo ScientificSO131 
抗小鼠二抗（抗小鼠 IgG、HRP 偶联抗体）Cell Signaling Technology7076S

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcri....

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标签

PUF RNA HEK 293T RT PCR RNA

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