需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

在人类细胞中设计人工因子以特异性调控选择性剪接

8.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/54967

⸱

2017年4月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Computational Biology, CAS-MPG Partner Institute for Computational Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences (SIBS), 2Institute of Cancer Stem Cell, Second Affiliated Hospital, Cancer Center, Dalian Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本报告介绍了一种生物工程技术，用于设计和构建新型人工剪接因子（ASFs），以特异性调控哺乳动物细胞中靶基因的剪接过程。该方法可进一步拓展，用于构建多种人工因子，以操控RNA代谢的其他方面。

摘要

大多数真核生物RNA的加工过程由具有模块化结构的RNA结合蛋白（RBPs）介导，这些蛋白包含一个特异性结合前体mRNA靶标的RNA识别模块和一个效应结构域。此前，我们利用人源Pumilio 1蛋白中PUF结构域独特的RNA结合模式，构建了一种可编程的RNA结合支架，并以此开发了多种人工RBPs，用于调控RNA代谢。本文详细描述了一种构建工程化剪接因子（ESFs）的实验方案，该因子专门设计用于调控目标基因的可变剪接。本方案包括如何针对特定RNA靶标设计和构建定制化的PUF支架，如何通过将设计的PUF结构域与效应结构域融合来构建ESF表达质粒，以及如何利用ESFs调控目标基因的剪接过程。在本方法的代表性结果中，我们还介绍了使用剪接报告系统检测ESF活性的常用实验方法、ESF在培养的人源细胞中的应用，以及剪接变化所产生的后续效应。通过遵循本报告中详尽的实验步骤，研究人员可设计并生成用于调控不同类型可变剪接（AS）的ESFs，为研究剪接调控机制及不同剪接异构体的功能提供了一种新策略。此外，通过将不同的功能结构域与设计的PUF结构域融合，研究人员可构建靶向特定RNA的人工因子，以操控RNA加工过程中的多个步骤。

引言

大多数人类基因经历可变剪接（Alternative Splicing, AS），以产生具有不同活性的多种亚型，从而极大地增加了基因组的编码复杂性1,2。AS 是调控基因功能的主要机制之一，并在不同的细胞和发育阶段通过多种途径受到严密调控3,4。由于剪接调控异常是人类疾病的常见原因5,6,7,8，靶向剪接调控正成为一种有吸引力的治疗策略。

根据一个简化的剪接调控模型，可变剪接（AS）主要由前体mRNA中的剪接调控cis-元件（SREs）控制，这些元件作为可变外显子的剪接增强子或沉默子发挥作用。这些SREs特异性招募多种trans-作用蛋白因子（即 剪接因子），以促进或抑制剪接反应3,9。大多数trans-作用剪接因子具有独立的序列特异性RNA结合结构域用于识别其靶标，以及调控剪接的效应结构域。最著名的例子是富含丝氨酸/精氨酸（SR）蛋白家族成员，其包含位于N端的RNA识别基序（RRMs），可结合外显子剪接增强子，以及位于C端的RS结构域，促进外显子的包含10。相反，hnRNP A1通过其RRM结构域结合外显子剪接沉默子，并通过C端的富含甘氨酸结构域抑制外显子的包含11。利用这种模块化结构，研究人员应能够通过将特定的RNA结合结构域（RBD）与不同功能的效应结构域（激活或抑制剪接）组合，设计出人工剪接因子。

此类设计的关键在于使用一种RBD，其能够以可编程的RNA结合特异性识别特定靶标，类似于TALE结构域的DNA结合模式。然而，大多数天然剪接因子含有RRM或K同源（KH）结构域，这些结构域对短RNA元件的识别亲和力较弱，因而缺乏可预测的RNA-蛋白质识别能力。 "代码"12PUF重复蛋白的RBD（RNA结合结构域）即 PUF结构域具有独特的RNA识别模式，可据此重新设计PUF结构域，以特异性识别不同的RNA靶标13,14经典的PUF结构域包含八个由三个α螺旋组成的重复单元，每个重复单元识别一个8个核苷酸长度的RNA靶标中的单个碱基。第二α螺旋特定位置上的氨基酸侧链与RNA碱基的Watson-Crick边缘形成特异性的氢键，从而决定每个重复单元对RNA的结合特异性。图1A）。PUF重复序列对RNA碱基的识别编码出人意料地简单（图1A），从而能够生成可识别任意8碱基组合的PUF结构域（Wei和Wang综述）15).

这种模块化设计原则可用于构建一种由定制的PUF结构域和剪接调控结构域（即 SR结构域或Gly富集结构域）组成的工程化剪接因子（ESF）。这些ESF可作为剪接激活因子或抑制因子，用于调控多种类型的剪接事件，并已被证明是操控与人类疾病相关的内源性基因剪接的有效工具16,17。例如，我们构建了PUF-Gly型ESF，以特异性改变Bcl-x基因的剪接方式，将抗凋亡的长亚型（Bcl-xL）转化为促凋亡的短亚型（Bcl-xS）。改变Bcl-x亚型的比例足以增强多种癌细胞对多种抗癌化疗药物的敏感性16，表明这些人工因子可能作为潜在的治疗试剂具有应用价值。

除了利用已知的剪接效应结构域（例如，RS 结构域或富含甘氨酸的结构域）来调控剪接外，工程化 PUF 因子还可用于研究新剪接因子的功能活性。例如，通过该方法，我们已证明当多个 SR 蛋白的 C 末端结构域结合到不同的 pre-mRNA 区域时，可激活或抑制剪接过程18，RBM4 的富含丙氨酸基序可抑制剪接19，而 DAZAP1 的富含脯氨酸基序则可增强剪接效率20,21。这些新发现的功能结构域可用于构建更多类型的合成因子，以精确调控剪接过程。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 通过重叠 PCR 构建具有定制 RNA 结合特异性的 PUF 支架

  1. 设计一系列包含PUF序列的PCR引物，使其在每个位置特异性识别不同的RNA核苷酸12（引物序列见表1，RNA:PUF识别编码见图1A）。针对每个PUF重复单元，设计四种不同的引物，以识别每个位置上的不同碱基。
    注意：这些引物将用于四轮连续的PCR反应，以生成可连接在一起的PUF片段（图1B）。
  2. 选择靠近可变剪接位点的靶基因识别位点。
    注意：该位点可由用户自行决定，通常选择在可变剪接位点上下游10–50 nt范围内。
  3. 第一轮：生成4 个PUF重复单元的编码序列、通用连接片段以及两端帽状片段。
    1. 根据靶标位点确定定制PUF各重复单元的识别编码。选取针对PUF重复单元1–8的PCR引物组合。按照以下描述进行四轮连续PCR反应，以生成定制的PUF结构域（图1B）。
    2. 在第一轮PCR中，配置标准PCR反应体系（总体积25 µL，包含2.5 µL 10x缓冲液、0.5 µL 10 mM dNTPs、0.5 µL 10 µM正向和反向引物、50 ng DNA模板（人cDNA或野生型PUF结构域表达载体）以及0.5 U高保真DNA聚合酶）。
      注意：这些反应将产生对应于每个PUF重复单元的DNA序列、通用连接片段以及带有不同限制性酶切位点的两个帽状片段（图1B）。本步骤所用模板、引物及PCR产物的简要列表见表2。
    3. 设定PCR程序如下：95 °C预变性5 min；进行28个循环（95 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸15 s）；最后72 °C延伸5 min。使用高保真DNA聚合酶以最大限度减少PCR过程中的点突变。
  4. 第二轮：生成R1/R2/R3/R4（R1–4）和R5/R6/R7/R8（R5–8）的编码序列。
    1. 通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离步骤1.3.3中获得的PCR产物（恒压120 V，运行25 min）。使用凝胶回收试剂盒对所有预期大小的产物进行凝胶纯化。将这些产物的不同混合物作为后续PCR轮次的模板。
      注意：将三个PCR产物大致按1:1:1比例混合。只要在凝胶中各产物条带强度相近，通常无需精确量化。
    2. 将约5%纯化的PCR产物作为下一轮PCR的模板。或者，使用紫外-可见分光光度计定量纯化的PCR产物，并在模板混合物中每种产物加入15 ng。
    3. 以纯化的PCR产物R1/R2、R3/R4和Bridge 2/3作为混合模板，R1-F和R4-R作为引物，按照步骤1.3所述设置PCR反应，获得重叠PCR产物R1–4。
    4. 以纯化的PCR产物R5/R6、R7/R8和Bridge 6-7作为混合模板，R5-F和R8-R作为引物，获得重叠PCR产物R5-8（图1B）。设定PCR程序如下：95 °C预变性5 min；28个循环（95 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸30 s）；最后72 °C延伸5 min。对R1-4和R5-8进行凝胶纯化。
  5. 第三轮：生成R1/R2/R3/R4/R5/R6/R7/R8（R1–8，不含帽状片段）的编码序列。
    1. 在第三轮PCR中，以纯化的R1-4、R5-8和Bridge 4/5作为混合模板，R1-F和R8-R作为引物，按照步骤1.3所述设置PCR反应，获得不含帽状片段的重叠PCR产物R1-8。
    2. 设定PCR程序如下：95 °C预变性5 min；28个循环（95 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸55 s）；最后72 °C延伸5 min。对不含帽状片段的R1-8进行凝胶纯化。
  6. 第四轮：生成完整PUF结构域的编码序列。
    1. 在最后一轮PCR中，以纯化的不含帽状片段的R1-8以及5'端和3'端帽状片段作为混合模板，Cap-F和Cap-R作为引物，按照步骤1.3所述设置PCR反应，获得最终的突变型PUF结构域。
    2. 设定PCR程序如下：95 °C预变性5 min；28个循环（95 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸1 min）；最后72 °C延伸5 min。
    3. 对最终重编程PUF结构域的PCR产物进行凝胶纯化。将这些产物用于后续步骤中ESF表达质粒的构建。对最终构建体进行测序，以验证PUF结构域的重编程序列。
      注意：Cap-F在BamHI和XbaI位点之间编码NLS（PPKKKRKV），Cap-R编码终止密码子和SalI位点（这些限制性酶切位点的设计用于构建ESF表达载体，图1C）。

2. ESF 功能模块的构建

  1. 克隆ESF功能模块（RS结构域或Gly富集结构域）通常采用两种策略：以总人源cDNA为模板，通过PCR扩增这些结构域（步骤2.2），或直接合成编码不同RS结构域或Gly富集结构域的DNA片段（步骤2.3）。
  2. 使用PCR克隆9G8（NP001026854）第123–238位残基、SRP40（NP008856）第180–272位残基或SC35（NP003007）第117–221位残基的RS结构域；克隆hnRNP A1（NP_002127）第195–320位残基、hnRNP A2（NP112533）第203–353位残基或hnRNP A3（NP919223）第211–378位残基的Gly富集结构域。
    1. 使用NCBI引物设计工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）或Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）设计用于克隆RS结构域或Gly富集结构域（ESF的功能模块）的引物。
      注：正向引物在NheI位点后包含一个N端FLAG标签，反向引物包含一个BamHI位点，用于克隆至表达载体（图1C）。
    2. 按照步骤1.3所述设置标准PCR反应，以扩增RS结构域或Gly富集结构域。PCR程序设置如下：95 °C预变性5 min；进行28个循环（95 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸30 s）；最后72 °C延伸5 min。
  3. 通过直接DNA合成克隆RS结构域或Gly富集结构域。无需在步骤2.2中通过PCR生成编码效应结构域的产物，而是通过商业来源的DNA寡核苷酸合成一段编码短片段RS结构域（RSRSRSRSRSRS）或Gly富集结构域（GYGGGGPGYGNQGGGYGGG）的寡核苷酸。

3. ESF 表达质粒的构建

  1. 使用任意表达载体构建ESF表达质粒。
    注意：最初使用了一种表达载体pGL-Gly-MS2（由Institute de Biologie-CHR的R. Breathnach博士惠赠11），该载体从N端到C端编码一个FLAG表位、hnRNP A1的富含甘氨酸（Gly-rich）结构域以及MS2外壳蛋白。因此，本方案后续步骤中以此表达载体为例进行说明。
    注意：也可使用其他含有多个克隆位点的表达载体，并采用标准的克隆步骤将片段连接在一起。
  2. 取1.5 µg第3.1步所述的表达质粒（pGL-Gly-MS2），用限制性内切酶BamHI和SalI在37 °C条件下消化1小时，以去除MS2外壳蛋白片段；同时在相同条件下，用BamHI和SalI消化ESF识别模块（编码NLS及重编程的PUF结构域，于步骤1.5中获得）。
  3. 向限制性酶切反应产物中加入5x上样染料，将全部反应液缓慢加入含DNA染料的1.5%琼脂糖凝胶中，在120 V电压下电泳40分钟，随后对酶切产物进行凝胶纯化。
  4. 将纯化的ESF识别模块插入片段与表达载体DNA按3:1的比例混合，加入1 µL DNA连接酶和1 µL 10x连接缓冲液，配制成10 µL连接反应体系。于4 °C过夜孵育；所得构建体质粒可在CMV启动子控制下表达Gly-PUF型ESF（pGL-Gly-PUF）（图1C）。
  5. 使用NheI和BamHI在37 °C条件下消化1小时，切除编码FLAG/Gly-rich结构域的片段；用编码RS结构域的片段（步骤2.2中制备，同样经NheI和BamHI消化）替换之；所得构建体质粒可表达RS-PUF型ESF（图1C）。

4. 剪接报告基因的构建

  1. 合成含有候选序列的寡核苷酸（即 PUF结构域的靶序列）两侧由 Xho我与 ApaI 位点或 Xho我与 EcoRI 位点。将寡核苷酸在 55 °C 下退火 5 分钟，以获得包含 PUF 结构域识别位点并两侧带有黏性末端的双链插入片段 Xho我与 Apa我或 Xho我与 EcoRI 位点。
  2. 从先前描述的模块化剪接报告系统开始22，pGZ3，其包含两个被测试外显子（人类IGF2BP1的第12号外显子，Ensembl ID ENSG00000159217）及其侧翼内含子隔开的GFP外显子。
    注意：测试外显子经过人工设计，包含 Xho我与 ApaI 位点，可用于插入含有候选序列（PUF 结构域的靶序列）的合成寡核苷酸。该模块化剪接报告载体（pGZ3）通过质粒储存库 Addgene 提供。
  3. 用限制性内切酶消化基础报告质粒 pGZ3（步骤 4.2 中制备） Xho我与 ApaI型限制性内切酶在37°C下反应1小时。
  4. 按照步骤 3.3 中所述方法对消化产物进行凝胶纯化。
  5. 按照3:1的摩尔比，将步骤4.1中获得的双链插入片段与步骤4.4中获得的经消化的pGZ3载体混合，配制10 µL连接反应体系，其中包含1 µL DNA连接酶和1 µL 10x连接缓冲液。将连接反应体系在4 °C孵育过夜，以构建剪接报告载体pGZ3。
  6. 将第4.1步中获得的双链插入片段连接至先前发表的报告载体pEZ-1B中（使用 Xho我与 EcoRI 位点）和 pEZ-2F（使用 Xho我与 ApaI 位点23，以获得竞争性5'剪接位点报告子和竞争性3'剪接位点报告子，具体步骤如4.3–4.5所述。
    注意：两种类型的剪接报告基因均可通过 Add-gene 获得。

5. ESF 慢病毒表达载体的构建

  1. 按照步骤1.3所述设置标准PCR反应，使用含有MluI/SpeI酶切位点的引物，从原始表达载体（pGL-Gly-PUF或pGL-RS-PUF）中扩增全长ESFs。PCR程序设置如下：95 °C预变性5分钟；95 °C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸1.5分钟，共28个循环；最后72 °C延伸5分钟。
  2. 通过酶切反应、凝胶纯化和连接反应，将ESFs插入慢病毒表达载体pWPXLd中MluI/SpeI位点之间，具体操作如步骤3.2–3.4所述。
  3. 采用先前报道的标准磷酸钙沉淀法24，通过共转染包装质粒psPAX2和pMD2.G，以及pWPXLd-Gly-PUF(Bcl-x)、pWPXLd-Gly-PUF(wt)（作为特异性对照）或pWPXLd-GFP（空白对照），在HEK293T细胞中产生慢病毒。
    1. 将5×106个HEK293T细胞接种至10 cm培养皿中，每皿加入10 mL含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中过夜培养。当细胞融合度达到70–90%时进行转染。
    2. 在2 mL离心管中加入三种质粒（7.5 µg包装质粒psPAX2、2.5 µg pMD2.G，以及10 µg的pWPXLd-Gly-PUF(Bcl-x)、pWPXLd-Gly-PUF(wt)或pWPXLd-GFP），配制质粒混合物。
    3. 向该2 mL离心管中加入560 µL 0.25 M CaCl2和560 µL 2× BBS溶液，轻轻混匀数次，室温孵育15分钟，制备转染混合物。
    4. 将全部转染混合物加入10 cm培养皿中，轻轻摇动混匀，于37 °C、3% CO2条件下过夜孵育。
    5. 吸去培养基，每皿加入含2% FBS的新鲜DMEM 10 mL，于37 °C、10% CO2条件下继续过夜培养。
    6. 收集第一次上清液，每皿再加入含2% FBS的新鲜DMEM 10 mL，于37 °C、10% CO2条件下继续过夜培养。将收集的上清液置于4 °C保存。
    7. 收集第二次上清液，合并两次收获的上清液，通过0.4 µm滤器过滤以去除细胞碎片。澄清后的上清液可直接使用，或于-80 °C保存。
  4. 通过将系列稀释的病毒制剂感染HEK293T细胞，测定慢病毒滴度，方法如先前报道25。

6. 利用剪接因子特异性调控外显子包含及剪接位点的可变利用

  1. 将 2 × 105 个 HEK293T 细胞接种至 24 孔板的每个孔中。在 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中，用含 10% 胎牛血清（FBS）的 500 µL DMEM 培养基过夜培养细胞。
  2. 使用前轻轻倒置脂质体转染试剂瓶以混匀。取 2 µL 脂质体转染试剂加入 50 µL 低血清培养基中稀释，轻轻混匀后于室温孵育 5 分钟。
  3. 在无菌离心管中，将 0.04 µg pGL-Gly-PUF 表达载体和 0.2 µg pGZ3 报告质粒溶于 50 µL 低血清培养基中。另取无菌离心管，将 0.4 µg pGL-RS-PUF 表达载体和 0.2 µg pGZ3 报告质粒溶于 50 µL 低血清培养基中。再取无菌离心管，将 0.4 µg pGL-RS-PUF 表达载体和 0.2 µg pEZ-1B 或 pEZ-2F 报告质粒溶于 50 µL 低血清培养基中。
  4. 室温孵育 5 分钟后，将步骤 6.2 中稀释的脂质体转染试剂与步骤 6.3 中稀释的质粒轻轻混合，室温孵育 20 分钟。
  5. 将步骤 6.4 制备的完整转染混合物加入各孔中，在 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中孵育至少 12 小时。
  6. 在 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中孵育 12 小时后，弃去每孔中的培养基，并用 500 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）/孔洗涤细胞。
  7. 弃去 PBS，每孔加入 200 µL 胰蛋白酶。将培养板置于 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中孵育 5 分钟。加入 1 mL 培养基以终止消化反应，并将细胞转移至无菌的 1.5 mL 离心管中。
  8. 以 5,000 × g 离心 3 分钟，弃去上清液。每管加入 0.5 mL RNA 提取缓冲液，通过反复吹打裂解细胞。将匀浆样品孵育 5 分钟。
  9. 对于每份经 RNA 提取缓冲液处理的样品，每 0.5 mL RNA 提取缓冲液中加入 0.1 mL 氯仿。颠倒离心管 15 秒，室温孵育 3 分钟。
  10. 以 12,000 × g 在 4 °C 离心 15 分钟。将水相转移至新的离心管中。每 0.5 mL 初始匀浆所用的 RNA 提取缓冲液中加入 0.25 mL 异丙醇。
  11. 涡旋混匀后室温孵育 10 分钟。在 4 °C 以 12,000 × g 离心 10 分钟。离心后，RNA 沉淀通常可见于管底。
  12. 弃去上清液，用每 0.5 mL RNA 提取缓冲液对应 0.5 mL 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀。
  13. 剧烈涡旋后在 4 °C 以 7,500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液并干燥 RNA 沉淀。将 RNA 溶解于 50 µL 无 RNase 水中。
  14. 向每份 50 µL RNA 溶液中加入 2 µL 5 U/µL DNase I、7 µL 10× 缓冲液和 11 µL H2O。37 °C 孵育 1 小时，随后 70 °C 加热 15 分钟以灭活 DNase。
  15. 向每个样品的 0.2 mL 无核酸酶离心管中依次加入以下组分：1 µL 50 µM oligo dT、5 µL 400 ng/µL RNA（共 2 µg）、1 µL 10 mM dNTP 和 3 µL H2O。进行逆转录 PCR。
    1. 将混合物于 65 °C 加热 5 分钟，随后置于冰上至少 2 分钟以防止二级结构重新形成。向同一离心管中加入以下组分：4 µL 5× 第一链缓冲液、1 µL 0.1 M DTT、1 µL 200 U/µL 逆转录酶和 4 µL H2O。轻轻吹打混匀，50 °C 孵育 60 分钟。70 °C 加热 15 分钟以终止反应。
  16. 为完成全长标记 PCR，向每个样品的 PCR 管中加入以下组分：2.5 µL 10× PCR 缓冲液、0.5 µL 10 mM dNTP 混合物、1 µL 10 µM 正向引物、1 µL 10 µM 反向引物、0.25 µL 5 U/µL Taq DNA 聚合酶、0.5 µL 25 nM Cy5-dCTP 以及 2 µL 步骤 6.15 中制备的 cDNA。
    1. 94 °C 预变性 2 分钟，进行 25 个 PCR 循环（94 °C 30 秒、60 °C 30 秒、72 °C 30 秒），72 °C 延伸 7 分钟，最后 4 °C 保存。
  17. 使用 1× Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液，在 10% 聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分离 PCR 产物。使用荧光扫描仪进行扫描，并利用密度测定软件测量各剪接异构体的含量。

7. 利用ESF调节内源性Bcl-x的选择性剪接并测量其对细胞凋亡的影响

  1. 将2 × 105个HeLa细胞接种至24孔板的每个孔中。在37 °C、5% CO2的培养箱中，用500 µL含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基培养过夜。
  2. 12小时后，用2 µg pGL-Gly-PUF(WT)或0.2 µg、1 µg和2 µg pGL-Gly-PUF(531)（一种经重编程的PUF结构域，可高亲和力识别Bcl-x前体mRNA，见图2A）转染细胞。
  3. 24小时后收集细胞。其中1/3用于RNA提取及PCR分析（步骤6.8–6.17），其余2/3用于蛋白提取。
  4. 进行Western blot分析时，将全细胞沉淀物在2×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上样缓冲液中煮沸10分钟，随后在12% SDS-PAGE凝胶中分离蛋白，并将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。
  5. 用5%脱脂牛奶在室温下封闭膜1小时，并在4 °C下用Caspase-3（1:1,000）、PARP（1:1,000）或beta-actin（1:5,000）一抗（用5%脱脂牛奶稀释）孵育过夜。
  6. 在含0.1% Tween 20的PBS（PBS-T）中，于室温在摇床上洗涤膜3次，每次5分钟 。然后在室温下用HRP标记的二抗（1:5,000，用5%脱脂牛奶稀释）孵育1小时。
  7. 用PBS-T在室温下洗涤膜3次，随后使用ECL Western blot检测试剂显影。
  8. 向盖玻片上加入250 µL聚-L-赖氨酸（PLL），在室温下孵育15分钟，吸去液体。用PBS洗涤PLL包被的玻璃盖玻片3次，每次5分钟。为进行检测凋亡的免疫荧光实验，将5 × 105个HeLa细胞接种至6孔板中聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片上。使用脂质体转染试剂将pGL-Gly-PUF(WT)或pGL-Gly-PUF(531)质粒转染入HeLa细胞（参见步骤6.1–6.5）。
  9. 转染24小时后，用1 mL含4%多聚甲醛（PFA）的1×PBS在室温下固定盖玻片上的细胞20分钟。注意：PFA有毒性，应在通风橱中小心操作。
  10. 轻轻向盖玻片上的细胞中加入2 mL 1×PBS进行洗涤，孵育5分钟，用移液器吸除PBS，重复洗涤3次。
  11. 用含0.2% Triton X-100的1×PBS对细胞进行通透处理10分钟，然后用1×PBS洗涤3次 。
  12. 用含3%牛血清白蛋白（BSA）的1×PBS在室温下封闭细胞10分钟，再用1×PBS洗涤3次。
  13. 将FLAG抗体用3% BSA/PBS按1:1,000稀释，并将30 µL稀释后的FLAG抗体滴加至Parafilm膜上。
  14. 取出带有细胞的盖玻片，用实验纸巾小心吸去多余缓冲液，将其倒置（细胞面朝下）置于30 µL抗FLAG溶液上，在室温下孵育1小时。
  15. 沿盖玻片边缘加入约500 µL 1×PBS，直至盖玻片浮于液面上。将其放回含有1×PBS的6孔板中。
  16. 用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
  17. 将抗小鼠二抗（1:500）用3% BSA/PBS稀释，每张盖玻片使用30 µL。将盖玻片倒置于二抗溶液上，在室温下孵育15分钟。
  18. 按照步骤7.15所述方法将盖玻片从Parafilm膜上取下，放回6孔板中，并用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
  19. 用含DAPI的封片剂封片，去除多余封片剂，并用指甲油密封边缘。
  20. 使用荧光显微镜（100倍放大）观察细胞，并用数码相机拍照。
    注：ESF的表达通过针对FLAG标签的荧光标记二抗进行可视化，细胞核断裂则通过DAPI染色观察。

8. 检测表达ESF的不同癌细胞的凋亡

  1. 将2 × 106个HeLa细胞、MDA-MB-231细胞和A549细胞分别接种至60 mm培养皿中，每皿加入4 mL含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养，用于后续碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）染色检测细胞凋亡。
  2. 24小时后更换新鲜培养基，并按照先前报道的方法24制备慢病毒。
  3. 将10 × 106个慢病毒pWPXld-Gly-PUF(WT)、pWPXld-Gly-PUF(531)或pWPXld-GFP原液分别稀释于4 mL新鲜培养基中，使病毒与细胞数量的比例为5:1。
  4. 将培养皿中的培养基更换为步骤8.3中制备的含病毒培养基4 mL，置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。感染12小时后更换培养基。
  5. 感染24小时后，收集细胞并用含终浓度为2 µg/mL PI的PBS溶液染色5分钟。
  6. 按照先前所述方法16，使用流式细胞仪分析PI染色的细胞。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本报告详细描述了外显子剪接增强子（ESF）及剪接报告系统的完整设计方案与构建流程，并概述了ESF在调控内源基因可变剪接（AS）中的进一步应用。16为说明ESF介导的剪接变化的典型结果，我们以先前研究中的数据为例。具有不同功能结构域的ESF可用于促进或抑制目标盒式外显子的包含图1D & E）。ESFs 还可影响报告系统中替代性 5' 和 3' 剪接位点的使用。图1F & G).

内源基因的选择性剪接也可通过设计的ESF进行特异性调控。我们通过靶向Bcl-x基因验证了这一应用，该基因可利用不同的5'剪接位点剪接成两种功能拮抗的异构体。我们设计...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本报告详细描述了可特异性调控靶基因选择性剪接的人工剪接因子的设计与构建方法。该方法利用PUF重复序列独特的RNA结合模式，构建具有定制特异性的RNA结合支架，可用于激活或抑制剪接过程。

本方案的关键步骤是生成重编程的PUF结构域，该结构域决定了ESF的特异性。为此已开发并优化了一种PCR拼接方案，用于快速构建PUF骨架。该方法成功的关键在于将不同重叠模板的比例调整为1:1:1。每轮PCR后对产物进行纯化也至关重要，因为未纯化的产物可能含有上一轮反应残留的引物污染。另一个重要步骤是使用半定量RT-PCR检测剪接比例。通常应避免过多的扩增循环次数，以免PCR反应达到饱和。在我们共表达剪接报告基因的实验中，常规使用20至25个循环，但在检测内源基因剪接时，具体循环数可能需根据mRNA丰度进行调整。当使用新的一对引物定量剪接异构体时，建议每次均按照先前所述方法重新校准PCR实验16。

设计型ESF的一个潜在局限性是其脱靶效应，因为特异性由PUF骨架中的重复序列数量决定。野生型PUF识别一...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01-CA158283和国家自然科学基金委员会（NSFC）资助项目31400726资助，资助对象为Z.W.。Y.W. 受“青年千人计划”及国家自然科学基金委员会（资助号31471235和81422038）资助。X.Y. 受中国博士后科学基金（资助号2015M571612）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高保真DNA聚合酶（Phusion High-Fidelity）及PCR缓冲液New England BiolabsM0530L
DNA连接酶（T4 DNA连接酶）New England BiolabsM0202L
脂质体转染试剂（Lipofectamine 2000）Invitrogen11668-019
减量血清培养基（Opti-MEM）Gibco31985-062
RNA提取缓冲液（TRIzol试剂）ambion15596018TRIzol 试剂含有苯酚，可导致灼伤。操作时应佩戴手套。
PBS（1×）Life Technologies10010-031
SuperScript III 逆转录酶（RT）Invitrogen18080044
Caspase-3 抗体细胞信号技术公司9668
PARP 抗体细胞信号技术公司9542
Bcl-x 抗体BD生物科学610211
β-actin 抗体Sigma-AldrichA5441
α-微管蛋白抗体Sigma-AldrichT5168
FLAG抗体Sigma-AldrichF4042
硝酸纤维素膜Amersham-PharmaciaRPN203D
ECL Western Blotting 检测试剂InvitrogenWP20005
Cy5-dCTPGE HealthcarePA55021
荧光激活细胞分选仪（FACS）BD生物科学FACSCalibur 
杜尔贝科’s 改良伊格尔’DMEM培养基GE HealthcareSH30243.01
胎牛血清（FBS）Invitrogen26140079
碘化丙啶（PI）SigmaP4170
牛血清白蛋白（BSA）SigmaA7638-5G
Triton-X100PromegaH5142
聚-L-赖氨酸 SigmaP-4832过滤除菌后，4 ℃保存 °C
载体 pWPXLdAddgene12258
质粒 pMD2.GAddgene12259
载体 psPAX2Addgene12260
DNase I（无RNase）New England BiolabsM0303S
Oligo(dT)18 引物赛默飞世尔科技SO131 
小鼠二抗（抗小鼠IgG，HRP标记抗体）细胞信号技术公司7076S

参考文献

  1. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).
  3. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. Rna. 14 (5), 802-813 (2008).
  4. Matera, A. G., Wang, Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).
  5. Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).
  6. Wang, G. -S., Cooper, T. A. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).
  7. Li, Y. I., et al. RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease. Science. 352 (6285), 600-604 (2016).
  8. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).
  9. Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).
  10. Graveley, B. R., Maniatis, T. Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing. Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).
  11. Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -C., Breathnach, R. hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer. Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).
  12. Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition. Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).
  13. Dong, S., et al. Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains. J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).
  14. Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. A universal code for RNA recognition by PUF proteins. Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).
  15. Wei, H., Wang, Z. Engineering RNA-binding proteins with diverse activities. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).
  16. Wang, Y., Cheong, C. -G., Hall, T. M. T., Wang, Z. Engineering splicing factors with designed specificities. Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).
  17. Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities. Nat Commun. 3, 1147(2012).
  18. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).
  19. McCabe, B. C., Gollnick, P. Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).
  20. Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules. Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).
  21. Choudhury, R., et al. The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration. Nat Commun. 5, (2014).
  22. Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).
  23. Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control. Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).
  24. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031(2012).
  25. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
  26. Venables, J. P. Aberrant and alternative splicing in cancer. Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).
  27. Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).
  28. He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis. PloS one. 4 (3), 4732(2009).
  29. Venables, J. P., et al. Identification of alternative splicing markers for breast cancer. Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).
  30. Shapiro, I., et al. An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer. PLoS Genet. 7 (8), 1002218(2011).
  31. David, C. J., Manley, J. L. Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged. Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).
  32. Ladomery, M. Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer. Int J Cell biol. 2013, (2013).
  33. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).
  34. Anczukòw, O., et al. SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer. Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

工程化剪接因子PUF结构域支架RNA结合蛋白剪接报告基因检测HEK-293T转染RT-PCR分析免疫荧光显微镜RNA提取方案富含甘氨酸结构域
在人类细胞中设计人工因子以特异性调控选择性剪接
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。