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方法文章

从全血中生成人单核细胞来源的树突状细胞

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DOI：

10.3791/54968

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2016年12月24日

 ,  , 
1Division of Hygiene and Medical Microbiology, Medical University of Innsbruck

本文内容

摘要

本文展示了如何通过密度梯度离心法从人抗凝全血中分离外周血单个核细胞，再利用磁珠分选技术从中分离单核细胞。经过5天的培养后，人单核细胞可分化为未成熟树突状细胞，可用于非临床实验操作。

摘要

树突状细胞（DCs）通过其细胞表面表达的多种模式识别受体（PRRs），识别病毒、细菌和真菌等不同病原体的外来结构，从而激活并调控免疫反应。

树突状细胞（DCs）的主要功能是在淋巴结中通过MHC I类和MHC II类分子向初始T淋巴细胞呈递抗原，从而诱导适应性免疫应答。因此，DCs在感染部位识别病原体后，必须从外周组织迁移至淋巴结。对于 体外 在实验或树突状细胞（DC）疫苗接种策略中，通常使用单核细胞来源的DC。这些细胞在生理、形态和功能上与传统的髓系树突状细胞具有相似性。它们通过从健康供体分离的单核细胞，在白细胞介素4（IL-4）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的刺激下生成。本文展示了如何从经密度梯度离心富集外周血单个核细胞（PBMC）后的抗凝人血中分离单核细胞并进行刺激。人单核细胞经5天培养后可分化为未成熟DC，适用于非临床环境下的实验操作。

引言

树突状细胞（DC）是我们免疫系统中最重要的专职抗原呈递细胞。未成熟DC（iDC）存在于皮肤或黏膜组织中，因此是最早与入侵病原体相互作用的免疫细胞之一。DC在固有免疫和适应性免疫系统之间起桥梁作用1，因为它们在识别病原体后能够激活T细胞和B细胞应答。此外，由于DC可分泌大量细胞因子（如IL-1β、IL-6和IL-12），因而参与促炎性免疫反应。DC还能激活自然杀伤（NK）细胞，并通过趋化作用将其他免疫细胞募集至感染部位。

树突状细胞可分为未成熟树突状细胞（iDCs）和成熟树突状细胞（mDCs）2 根据其形态和功能。在通过多种模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）之一识别外来抗原后例如， Toll样受体、C型凝集素或补体受体）在细胞表面大量表达，iDCs会发生显著变化并开始成熟。在此成熟过程中，负责抗原捕获的受体表达下调，而参与抗原呈递的关键分子表达上调3成熟的树突状细胞会上调主要组织相容性复合体I类和II类（MHC I和II）、共刺激分子（如CD80和CD86），这些分子对抗原呈递和T淋巴细胞的活化至关重要。此外，细胞表面趋化因子受体CCR7的表达被诱导，使树突状细胞能够从外周组织迁移至淋巴结。该迁移过程由 "滚动" 树突状细胞沿趋化因子配体19（CCL19/MIP-3β）和趋化因子配体21（CCL21/SLC）梯度向淋巴结迁移4-6.

迁移后，mDCs 将加工后的抗原呈递给初始型 CD4+ 和 CD8+ T细胞，从而启动针对入侵病原体的适应性免疫反应7这一与淋巴结中T细胞的相互作用还与病毒的传播有关8. 其他 体外 研究发现，树突状细胞（DCs）能有效捕获HIV并将其传递给T细胞，且这种传播会导致强烈的感染。9-12这些实验表明 体内 HIV 利用树突状细胞（DC）作为从外周向淋巴结转运的载体。在抗原呈递过程中，DC 分泌关键的白细胞介素，调控效应辅助性 T 细胞的分化，因此针对病原微生物的整个免疫应答结果即由这一相互作用决定。除 1 型（Th1）和 2 型（Th2）效应 T 细胞外，CD4 的其他亚群+ 辅助性T细胞（例如， 17型（Th17）和22型（Th22）T细胞已被发现，其诱导机制与功能已得到深入研究。树突状细胞（DCs）还参与调节性T细胞（Tregs）的生成13,14这些细胞具有免疫抑制作用，能够抑制或下调效应T细胞的活化或增殖，因此在免疫应答与免疫耐受的建立过程中起着关键作用。

人类传统树突状细胞（cDCs）包含多种具有髓系来源的细胞亚群（即， 朗格汉斯细胞（LCs）和真皮及间质树突状细胞（DCs）或淋巴样来源即， 浆细胞样树突状细胞（pDCs）。对于 体外 实验或树突状细胞（DC）疫苗策略中，通常将单核细胞来源的树突状细胞用作皮肤树突状细胞的模型。这些细胞在生理特性、形态和功能上与传统的髓系树突状细胞具有相似性。它们通过向来自健康供体的单核细胞中添加白细胞介素4（IL-4）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）而获得12,15-18树突状细胞也可直接从皮肤或黏膜活检组织中分离获得，甚至可由CD34+ 从脐带血样本中分离的造血祖细胞 子宫外在此，我们演示如何从经密度梯度离心法富集外周血单个核细胞（PBMC）后的抗凝人血中分离并刺激单核细胞。在特定条件下培养5天后，人单核细胞可分化为未成熟树突状细胞（iDCs），并可用于非临床环境下的实验操作。

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方案

伦理声明：所有参与献血的献血者均已通过中央输血研究所签署知情同意书。 & 奥地利因斯布鲁克医科大学免疫学系。使用匿名的剩余样本进行科学研究已获得因斯布鲁克医科大学伦理委员会的批准。

1. 外周血单个核细胞（PBMCs）的富集

  1. 通过离心浓缩外周血单个核细胞（PBMCs）。
    1. 打开血袋，根据收到的血液量，用无菌的50 ml离心管分装血液。
    2. 如有必要，用无菌的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）将每管体积调整至50 ml。
    3. 将离心管放入离心机，以400 x g在室温（RT）下离心15分钟，不使用刹车。
    4. 使用无菌的10 ml移液管吸走上层含有血浆和血小板的液体，保持界面层不受扰动。
      ​注意：如果使用自体血浆而非胎牛血清（FCS）补充培养基，则必须在此步骤中收集血浆并进行热灭活。
    5. 从两个50 ml离心管中收集单个核细胞（界面层），使用无菌的10 ml移液管转移至一个无菌的50 ml离心管中。
    6. 使用无菌的D-PBS将每管体积调整至50 ml。
    7. 将离心管放入离心机，以400 x g在室温（RT）下离心15分钟，不使用刹车。
    8. 使用无菌的10 ml移液管吸走上层含有血浆和血小板的液体，保持界面层不受扰动。
    9. 从50 ml离心管中收集单个核细胞（界面层），使用无菌的10 ml移液管转移至两个无菌的50 ml收集管中。
    10. 用无菌的D-PBS将每管体积调整至50 ml。
  2. 通过密度梯度离心法分离PBMCs（图1）。
    1. 准备四个50 ml离心管，每管中加入15 ml密度梯度介质。
    2. 从收集管（步骤1.1.10）中取25 ml混合细胞/血液，小心地叠加在密度梯度介质上方。
    3. 将离心管放入离心机，以700 x g在室温（RT）下离心30分钟，不使用刹车。
  3. PBMCs的收集与纯化。
    1. 使用无菌的10 ml移液管吸走上层含有血浆和血小板的液体，保持PBMC层不受扰动。
    2. 从所有离心管中收集PBMC界面层，使用无菌的25 ml移液管将细胞汇集至两个无菌的50 ml离心管中。
    3. 用无菌的D-PBS将每管体积调整至50 ml。将离心管放入离心机，以400 x g在4 °C下离心15分钟，使用刹车。
    4. 吸去上清液，用无菌的D-PBS重悬细胞。合并两个离心管中的细胞，并用无菌的D-PBS将总体积调整至50 ml。
    5. 将离心管放入离心机，以400 x g在4 °C下离心10分钟，使用刹车。
    6. 吸去上清液，用无菌的D-PBS重悬细胞。用无菌的D-PBS将体积调整至50 ml，并用移液器取50 µl加入含有450 µl D-PBS的1.5 ml离心管中。
    7. 剧烈涡旋混匀1.5 ml离心管，并使用血球计数板或其它细胞计数仪器进行细胞计数。
    8. 将50 ml离心管放入离心机，以400 x g在4 °C下离心10分钟，使用刹车。

2. 使用抗人CD14磁性颗粒分离单核细胞

  1. 使用磁性颗粒标记PBMCs。
    1. 用分离缓冲液将PBMC的浓度调整至8 x 107 个细胞/ml。
    2. 充分涡旋混匀抗人CD14磁性颗粒，并为每1 x 107个PBMC加入50 µl磁性颗粒。
    3. 充分混匀细胞-颗粒悬液，并在室温下孵育30分钟。
  2. 分离阳性组分和阴性组分。
    1. 用分离缓冲液将体积调至12 ml。
    2. 准备六支无菌圆底管，每管加入2 ml细胞-颗粒悬液。
    3. 立即将管子置于磁铁上，在室温下孵育10分钟。
    4. 保持管子在磁铁上，小心吸去上清液。上清液中含有阴性组分。
    5. 将管子从磁铁上取下，每管加入2 ml分离缓冲液。
    6. 通过上下吹打轻轻重悬细胞。
    7. 将管子重新放回磁铁上，在室温下孵育5分钟。
    8. 保持管子在磁铁上，小心吸去上清液。上清液中含有阴性组分。
    9. 将管子从磁铁上取下，每管加入2 ml分离缓冲液。通过上下吹打轻轻重悬细胞。
    10. 将阳性组分转移至一支无菌50 ml管中，并用无菌D-PBS将体积调至50 ml。

3. 使用 IL-4 和 GM-CSF 刺激分离的单核细胞

  1. 将离心管放入离心机，在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 10 分钟，并启用刹车。
  2. 吸除上清液，并将细胞重悬于 50 ml D-PBS 中。
  3. 用移液器将 50 µl 细胞悬液转移至含有 450 µl D-PBS 的 1.5 ml 离心管中。剧烈涡旋振荡 1.5 ml 管，然后使用血球计数板（Neubauer 计数室）或其他细胞计数仪器进行细胞计数。
  4. 将 50 ml 离心管放入离心机，在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 10 分钟，并启用刹车。
    注意：若还需获取含有外周血淋巴细胞（PBLs）的阴性组分，请对阴性组分执行与阳性组分类似的洗涤和计数步骤（步骤 3.1–3.5）。
  5. 用预热的培养基（RPMI 1640 培养基，添加 10% 热灭活 FBS 和 1% L-谷氨酰胺溶液）将细胞浓度调整至 1 × 106/ml，并向 6 孔板中每孔加入 3 ml 细胞悬液。
    注意：若使用热灭活的自体血浆，请根据实验设计将 10% FCS 替换为 1–5% 自体血浆。
  6. 通过直接将重组人 IL-4（250 U/ml）和重组人 GM-CSF（1,000 U/ml）加入培养基中，刺激单核细胞。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育。
  7. 在 48 小时后，再次通过直接加入 IL-4（250 U/ml）和 GM-CSF（1000 U/ml）对细胞进行再刺激。
    注意：若培养基中的 pH 指示剂显示有酸化迹象，应将一半培养基更换为预热的培养基。
  8. 在第 5 天收获未成熟树突状细胞用于后续实验：先将培养基反复吹打数次，再将培养的细胞从 6 孔板中移出，转移至 50 ml 离心管中。
  9. 对细胞进行计数，并取部分分离的单核细胞样本，使用抗人 CD11b、CD11c 和 DC-SIGN/CD209 抗体联合细胞活性染料进行染色。为避免抗体在表面染色过程中发生非特异性结合，强烈建议使用 Fc 受体阻断试剂或牛血清白蛋白（BSA）缓冲液。
  10. 按照制造商说明书，通过流式细胞术分析细胞活性染料信号，评估所获得的未成熟树突状细胞（iDCs）的纯度和活性。

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结果

使用蔗糖垫层离心抗凝血液后，外周血单个核细胞（PBMCs）富集于密度梯度介质的界面层（图1）。收集PBMCs后，通过流式细胞术（FACS）分析，利用谱系标记物（例如，T淋巴细胞标记CD3、单核细胞标记CD14和B淋巴细胞标记CD19）对PBMCs中的不同细胞群进行表征。图2A展示了经密度梯度离心后收集并染色的PBMCs的代表性FACS分析结果。在设门的细胞群中（图2A，上图），检测到4.03%的B淋巴细胞、28.20%的单核细胞和67.62%的其他细胞（图2A，中图），其中43.62%为T淋巴细胞（图2A，下图）。

然后将PBMCs与CD14磁性颗粒孵育，孵育后置于磁铁上，收集负向组分，即外周血淋巴细胞（PBLs），并使用上述谱系标记物通过FACS进行分析。与PBMC...

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讨论

本方案描述了通过使用磁性纳米颗粒检测法从抗凝血液中分离人单核细胞，进而生成单核细胞来源的树突状细胞（MDDCs）的方法。在本方案中，离心步骤位于细胞分离程序之前，从而富集外周血单个核细胞（PBMC）组分。尽管在离心过程中会损失部分细胞，但若将整袋全血直接叠加于密度梯度介质上，则需要200–300 ml的密度梯度介质，因此在成本上并不可行。此外，通过离心富集PBMC可获得更纯净的细胞群体，这有利于在分离过程中提高抗人CD14磁性颗粒与细胞的结合效率。利用磁性纳米颗粒法分离得到的单核细胞具有良好的活性，可用于体外（in vitro）进一步分化为多种树突状细胞亚群或巨噬细胞。

与过去使用的其他方案（如通过组织培养皿或明胶包被的塑料培养皿进行黏附介导的纯化）相比，该技术的优势在于所分离细胞群体的高纯度和均一性，以及操作的便捷性和快速性。通常情况下，在细胞操作过程中，重要的是要快速而彻底地完成操作，以避免细胞长时间暴露于非生理条件。本方案中使用的抗人CD14磁性颗粒专为CD14阳性白细胞的阳性筛选或去除而优化；因此，这些磁性纳米颗粒会直接结合到目标细胞上，并且在操作结束后不...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢卫生与医学微生物学系技术员 Karolin Thurnes，以及输血中心与免疫学部的 Annelies Mühlbacher 博士和 Paul Hörtnagl 博士在本手稿撰写过程中提供的宝贵帮助与支持。感谢奥地利科学基金对本研究的资助（项目编号：P24598 资助 DW，P25389 资助 WP）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
APC 小鼠抗人 CD19 单克隆抗体 HIB19BD Biosciences555415
APC 小鼠抗人 CD83 单克隆抗体 HB15eBD Biosciences551073
BD Imag 抗人 CD14 磁性颗粒BD Biosciences557769
BD ImagnetBD Biosciences552311
BSA（白蛋白 V 组分）Carl RothEG-Nr 2923225
Costar 6 孔透明 TC 处理多孔板Costar3506
密度梯度介质：Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare Bio-Sciences17-5442-03
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（D-PBS）Sigma-AldrichD8537
Falcon 10 ml 血清移液管Corning357551
Falcon 25 ml 血清移液管Corning357525
Falcon 50 ml 高透明度聚丙烯离心管Corning352070
Falcon 圆底管Corning352054
荧光素（FITC）标记小鼠抗人 CD3 单克隆抗体 HIT3aBD Biosciences555339
Ghost Dye Violet 510（细胞活力检测试剂）Tonbo Biosciences13-0870
GM-CSFMACS Miltenyi Biotec130-093-862
热灭活胎牛血清（FBS），欧盟批准来源（南美洲）Gibco10500-064
Hettich Rotanta 460RHettich---
IL-4 CCPromoKineC-61401
分离缓冲液：BD IMag 缓冲液（10 倍浓缩）BD Biosciences552362
L-谷氨酰胺溶液Sigma-AldrichG7513
微量离心管，1.5 ml，SuperSpinVWR211-0015
藻红蛋白（PE）标记小鼠抗人 CD14 单克隆抗体 M5E2BD Biosciences555398
藻红蛋白（PE）标记小鼠抗人 CD209 单克隆抗体 DCN46BD Biosciences551265
RPMI-1640 培养基Sigma-AldrichR0883
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0Invitrogen15575020

参考文献

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  2. Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
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