从全血中生成人单核细胞来源的树突状细胞

摘要

本文展示了如何通过密度梯度离心法从人抗凝全血中分离外周血单个核细胞，再利用磁珠分选技术从中分离单核细胞。经过5天的培养后，人单核细胞可分化为未成熟树突状细胞，可用于非临床实验操作。

摘要

树突状细胞（DCs）通过其细胞表面表达的多种模式识别受体（PRRs），识别病毒、细菌和真菌等不同病原体的外来结构，从而激活并调控免疫反应。

树突状细胞（DCs）的主要功能是在淋巴结中通过MHC I类和MHC II类分子向初始T淋巴细胞呈递抗原，从而诱导适应性免疫应答。因此，DCs在感染部位识别病原体后，必须从外周组织迁移至淋巴结。对于 体外 在实验或树突状细胞（DC）疫苗接种策略中，通常使用单核细胞来源的DC。这些细胞在生理、形态和功能上与传统的髓系树突状细胞具有相似性。它们通过从健康供体分离的单核细胞，在白细胞介素4（IL-4）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的刺激下生成。本文展示了如何从经密度梯度离心富集外周血单个核细胞（PBMC）后的抗凝人血中分离单核细胞并进行刺激。人单核细胞经5天培养后可分化为未成熟DC，适用于非临床环境下的实验操作。

引言

树突状细胞（DC）是我们免疫系统中最重要的专职抗原呈递细胞。未成熟DC（iDC）存在于皮肤或黏膜组织中，因此是最早与入侵病原体相互作用的免疫细胞之一。DC在固有免疫和适应性免疫系统之间起桥梁作用¹，因为它们在识别病原体后能够激活T细胞和B细胞应答。此外，由于DC可分泌大量细胞因子（如IL-1β、IL-6和IL-12），因而参与促炎性免疫反应。DC还能激活自然杀伤（NK）细胞，并通过趋化作用将其他免疫细胞募集至感染部位。

树突状细胞可分为未成熟树突状细胞（iDCs）和成熟树突状细胞（mDCs）² 根据其形态和功能。在通过多种模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）之一识别外来抗原后例如， Toll样受体、C型凝集素或补体受体）在细胞表面大量表达，iDCs会发生显著变化并开始成熟。在此成熟过程中，负责抗原捕获的受体表达下调，而参与抗原呈递的关键分子表达上调³成熟的树突状细胞会上调主要组织相容性复合体I类和II类（MHC I和II）、共刺激分子（如CD80和CD86），这些分子对抗原呈递和T淋巴细胞的活化至关重要。此外，细胞表面趋化因子受体CCR7的表达被诱导，使树突状细胞能够从外周组织迁移至淋巴结。该迁移过程由 "滚动" 树突状细胞沿趋化因子配体19（CCL19/MIP-3β）和趋化因子配体21（CCL21/SLC）梯度向淋巴结迁移

方案

伦理声明：所有参与献血的献血者均已通过中央输血研究所签署知情同意书。 & 奥地利因斯布鲁克医科大学免疫学系。使用匿名的剩余样本进行科学研究已获得因斯布鲁克医科大学伦理委员会的批准。

1. 外周血单个核细胞（PBMCs）的富集

1. 通过离心浓缩外周血单个核细胞（PBMCs）。
   1. 打开血袋，根据收到的血液量，用无菌的50 ml离心管分装血液。
   2. 如有必要，用无菌的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）将每管体积调整至50 ml。
   3. 将离心管放入离心机，以400 x g在室温（RT）下离心15分钟，不使用刹车。
   4. 使用无菌的10 ml移液管吸走上层含有血浆和血小板的液体，保持界面层不受扰动。
      ​注意：如果使用自体血浆而非胎牛血清（FCS）补充培养基，则必须在此步骤中收集血浆并进行热灭活。
   5. 从两个50 ml离心管中收集单个核细胞（界面层），使用无菌的10 ml移液管转移至一个无菌的50 ml离心管中。
   6. 使用无菌的D-PBS将每管体积调整至50 ml。
   7. 将离心管放入离心机，以400 x g在室温（RT）下离心15分钟，不使用刹车。
   8. 使用无菌的10 ml移液管吸走上层含有血浆和血小板的液体，保持界面层不受扰动。
   9. 从50 ml离心管中收集单个核细胞（界面层），使....

结果

使用蔗糖垫层离心抗凝血液后，外周血单个核细胞（PBMCs）富集于密度梯度介质的界面层（图1）。收集PBMCs后，通过流式细胞术（FACS）分析，利用谱系标记物（例如，T淋巴细胞标记CD3、单核细胞标记CD14和B淋巴细胞标记CD19）对PBMCs中的不同细胞群进行表征。图2A展示了经密度梯度离心后收集并染色的PBMCs的代表性FACS分析结果。在设门的细胞群中（图2A，上图），检测到4.03%的B淋巴细胞、28.20%的单核细胞和67.62%的其他细胞（图2A，中图），其中43.62%为T淋巴细胞（图2A，下图）。

然后将PBMCs与CD14磁性颗粒孵育，孵育后置于磁铁上，收集负向组分，即外周血淋巴细胞（PBLs），并使用上述谱系标记物通过FACS进行分析。与PBMC.......

讨论

本方案描述了通过使用磁性纳米颗粒检测法从抗凝血液中分离人单核细胞，进而生成单核细胞来源的树突状细胞（MDDCs）的方法。在本方案中，离心步骤位于细胞分离程序之前，从而富集外周血单个核细胞（PBMC）组分。尽管在离心过程中会损失部分细胞，但若将整袋全血直接叠加于密度梯度介质上，则需要200–300 ml的密度梯度介质，因此在成本上并不可行。此外，通过离心富集PBMC可获得更纯净的细胞群体，这有利于在分离过程中提高抗人CD14磁性颗粒与细胞的结合效率。利用磁性纳米颗粒法分离得到的单核细胞具有良好的活性，可用于体外（in vitro）进一步分化为多种树突状细胞亚群或巨噬细胞。

与过去使用的其他方案（如通过组织培养皿或明胶包被的塑料培养皿进行黏附介导的纯化）相比，该技术的优势在于所分离细胞群体的高纯度和均一性，以及操作的便捷性和快速性。通常情况下，在细胞操作过程中，重要的是要快速而彻底地完成操作，以避免细胞长时间暴露于非生理条件。本方案中使用的抗人CD14磁性颗粒专为CD14阳性白细胞的阳性筛选或去除而优化；因此，这些磁性纳米颗粒会直接结合到目标细胞上，并且在操作结束后不.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC 小鼠抗人 CD19 单克隆抗体 HIB19	BD Biosciences	555415
APC 小鼠抗人 CD83 单克隆抗体 HB15e	BD Biosciences	551073
BD Imag 抗人 CD14 磁性颗粒	BD Biosciences	557769
BD Imagnet	BD Biosciences	552311
BSA（白蛋白 V 组分）	Carl Roth	EG-Nr 2923225
Costar 6 孔透明 TC 处理多孔板	Costar	3506
密度梯度介质：Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Bio-Sciences	17-5442-03
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（D-PBS）	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 10 ml 血清移液管	Corning	357551
Falcon 25 ml 血清移液管	Corning	357525
Falcon 50 ml 高透明度聚丙烯离心管	Corning	352070
Falcon 圆底管	Corning	352054
荧光素（FITC）标记小鼠抗人 CD3 单克隆抗体 HIT3a	BD Biosciences	555339
Ghost Dye Violet 510（细胞活力检测试剂）	Tonbo Biosciences	13-0870
GM-CSF	MACS Miltenyi Biotec	130-093-862
热灭活胎牛血清（FBS），欧盟批准来源（南美洲）	Gibco	10500-064
Hettich Rotanta 460R	Hettich	---
IL-4 CC	PromoKine	C-61401
分离缓冲液：BD IMag 缓冲液（10 倍浓缩）	BD Biosciences	552362
L-谷氨酰胺溶液	Sigma-Aldrich	G7513
微量离心管，1.5 ml，SuperSpin	VWR	211-0015
藻红蛋白（PE）标记小鼠抗人 CD14 单克隆抗体 M5E2	BD Biosciences	555398
藻红蛋白（PE）标记小鼠抗人 CD209 单克隆抗体 DCN46	BD Biosciences	551265
RPMI-1640 培养基	Sigma-Aldrich	R0883
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0	Invitrogen	15575020