利用环境颗粒物诱导染色体畸变的分析方法 体外 系统

摘要

本方案描述了染色体畸变的定量与表征技术 体外 在经大气颗粒物处理后的 RAW264.7 小鼠巨噬细胞中。

摘要

暴露于颗粒物（PM）是全球主要的健康问题之一，可能损害包括细胞核遗传物质在内的多种细胞组分。为评估PM对细胞核遗传完整性的影响，通过分析小鼠RAW264.7巨噬细胞有丝分裂中期 spreads 中的染色体结构畸变来进行评价。PM样品采用大流量总悬浮颗粒物采样器从环境空气中采集获得。采集后的样品经溶解和过滤处理，保留水溶性细颗粒部分。采用核磁共振（NMR）波谱法对颗粒物的化学组成进行表征。将不同浓度的颗粒物悬液加入到 体外 将RAW264.7小鼠巨噬细胞培养72小时，并设置未处理对照组。暴露结束后，用秋水仙胺处理培养物以使细胞停滞于中期。随后收集细胞，经低渗溶液处理后，用乙酸甲醇固定，滴片至载玻片上，最后用吉姆萨染液染色。使用明场显微镜在1000倍放大倍数下观察中期分裂相，评估结构染色体畸变（CAs）。每组处理至少分析50至100个中期分裂相。该技术适用于检测结构染色体畸变（CAs），包括染色单体型断裂、染色单体型交换、无着丝粒片段、双着丝粒染色体和环状染色体、双微体、内复制以及罗伯逊易位 体外 暴露于PM后。该方法可有效将明确的细胞遗传学终点与表观遗传学改变相关联。

引言

据估计，暴露于颗粒物（PM）每年导致超过300万人过早死亡，主要死因为心肺疾病和肺癌¹。事实上，国际癌症研究机构已将PM列为对人类致癌的物质（1类致癌物），因为已有研究证实，随着PM暴露水平的升高，患肺癌的风险也随之增加²。有趣的是，几乎所有的癌细胞都携带数目和/或结构上的染色体异常。颗粒态有机碳是一种成分复杂且异质的混合物，其组成和粒径分布取决于排放源以及物理和化学转化过程。在城市PM_2.5（粒径小于或等于2.5 µm的颗粒物）中，颗粒态有机碳占其质量的35–55%，而在农村及大陆背景区域的PM_2.5中则超过60%^3,4。其中水溶性组分占有机气溶胶的30–90%。已通过色谱法结合质谱技术鉴定出大量有机化合物，包括脂肪烃、多环芳烃及其含氧、含氮衍生物、脂肪醛和醇类、游离脂肪酸及其盐类、二元羧酸、多功能化合物、蛋白质以及类腐殖质大分子（HULIS）^5–8。然而这些已识别的化合物仅占颗粒态有机碳总量的10–20%以下，因此大部分有机碳成分仍未知⁹。

实验证据表明，细胞毒性、氧化应激和炎症反应参与了颗粒物相关病理状态的发生发展。然而最近研究表明，暴露于颗粒物还会导致多种表观遗传学改变，包括实验条件下重复元件DNA甲基化水平的改变 体外 系统及人体受试者^10-12特别值得关注的是颗粒物（PM）....

方案

1. 颗粒物的收集与制备

1. 大流量总悬浮颗粒物采样器的校准
   1. 将采样器电机与质量流量控制器断开，并将电机连接至稳定的交流电源（图1）。
      注意：本步骤中不使用滤膜。
   2. 将校准用孔口和顶部加载适配板安装到采样器上。牢固拧紧顶部加载适配器的固定螺母，确保无空气泄漏。让采样器电机预热至其正常工作温度（约10–15分钟）。
   3. 用手覆盖孔口顶部的孔洞及孔口上的压力接口，进行漏气测试。仔细听是否有空气逸出产生的高频尖锐啸叫声。若听到该声音，说明存在泄漏，需重新拧紧顶部加载适配器的固定螺母。若声音较低，则泄漏可能位于系统中其他垫圈附近。
   4. 使用橡胶真空管将水压计的一端连接至孔口侧面的压力接口，另一端保持向大气开放。将压差计垂直放置以确保读数准确。轻敲连续流量记录仪背面有助于使记录笔归中，从而获得准确读数。
   5. 重复步骤1.1.2，采用五个代表30至60 ft/min（约每5–6 ft³/min）操作流量的流速。调节可变孔口上的旋钮至五个不同位置，并记录五个不同的读数。
   6. 在校准表上记录环境空气温度、环境大气压、采样器序列号、孔口序列号、孔口斜率与截距及其上次认证日期、校准日期、采样地点以及操作人员姓名首字母。
2. 总悬浮颗粒物样品采集与重量分析....

结果

在选择总悬浮颗粒物（TSP）采样器的位置以及采样时间时应格外谨慎。颗粒物的化学组成及其粒径可能显著影响实验结果。所收集的物质应在白色滤膜上清晰可见。正常的小鼠中期分裂相含有40条无着丝粒染色体。该技术的目的是展示经处理细胞与对照细胞之间异常染色体比例的变化（或无变化）。该变化可进一步进行定量（异常染色体数量）和定性（异常类型）分析。

正常的小鼠中期染色体铺展含有40条无着丝粒染色体（图3A）。颗粒物处理可诱导多种染色体畸变（CAs），如图3所示，包括染色单体断裂（3B）、无着丝粒片段（3C）、环状染色体（3D）、双着丝粒染色体（3E）、双微小体（3F）、罗伯逊易位（3G）以及内复制（<.......

讨论

染色体的细胞遗传学研究或显微分析，主要针对中期分裂相中的染色体数目或结构，可为多种疾病的预后评估、风险判断和治疗方案提供关键信息。目前已有充分证据表明，细胞遗传学异常与多种疾病（包括癌症）的发生和发展密切相关。迄今为止，在所有主要肿瘤类型中均已发现染色体异常（CAs）。这些异常可自发产生，也可由外部或内部刺激引发，例如电离辐射（IR）——这是可诱导多种类型细胞遗传学改变的主要外部风险因素之一¹⁶。对染色体异常的分析有助于评估机体吸收的辐射剂量（称为细胞遗传学辐射生物剂量测定）。此外，特定类型染色体畸变的发生频率和类型分析，还能提供有关吸收辐射质量的重要信息^{17, 18}。细胞遗传学研究能够直接呈现损伤因子对DNA的影响，这与彗星实验等间接检测技术形成对比。然而，由于该技术涉及大量手动操作步骤，细胞遗传学研究在辐射以外领域的应用仍显不足。

尽管已知颗粒物（PM）中有机碳的暴露会对人体健康产生不利影响，但报告其生物学效应的研究中很少包含对有机碳组成成分的分析⁹。这主要是由于常用的色谱分析方法成本高昂且操作繁琐，需要耗费大量.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
总悬浮颗粒物采样器	Tisch Environmental	TE-5170
Bruker Avance III 核磁共振波谱仪	Bruker	NA
TopSpin 3.5/pl2 软件	Bruker	NA
ACD/NMR Processor 学术版	ACD/Labs	NA
RAW264.7 小鼠巨噬细胞	ATCC	ATCC TIB-71
高糖 DMEM GlutaMAX 培养基	ThermoFisher	10569010	使用前在 37 °C 水浴中预热
胎牛血清	ThermoFisher	16000044	使用前在 37 °C 水浴中预热
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	ThermoFisher	15140163	使用前在 37 °C 水浴中预热
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	ThermoFisher	25200056	使用前在 37 °C 水浴中预热
PBS，pH 7.4	ThermoFisher	10010049	使用前在 37 °C 水浴中预热
KaryoMAX Colcemid PBS 溶液	ThermoFisher	15212012	使用前在 37 °C 水浴中预热
KaryoMAX 氯化钾溶液	ThermoFisher	10575090	使用前在 37 °C 水浴中预热
甲醇（HPLC 级）	Fisher Scientific	A452N1-19
冰醋酸	Fisher Scientific	BP1185-500
Decon Contrad 70 液体洗涤剂	Fisher Scientific	04-355-1
Wright 和 Wright-Giemsa 染色液	Fisher Scientific	23-200733
Permount 封片介质	Fisher Scientific	SP15-100
Axio Imager 2	Zeiss	NA