利用环境颗粒物诱导染色体畸变的分析方法 体外 系统

摘要

本方案描述了染色体畸变的定量与表征技术 体外 在经大气颗粒物处理后的 RAW264.7 小鼠巨噬细胞中。

摘要

暴露于颗粒物（PM）是全球主要的健康问题之一，可能损害包括细胞核遗传物质在内的多种细胞组分。为评估PM对细胞核遗传完整性的影响，通过分析小鼠RAW264.7巨噬细胞有丝分裂中期 spreads 中的染色体结构畸变来进行评价。PM样品采用大流量总悬浮颗粒物采样器从环境空气中采集获得。采集后的样品经溶解和过滤处理，保留水溶性细颗粒部分。采用核磁共振（NMR）波谱法对颗粒物的化学组成进行表征。将不同浓度的颗粒物悬液加入到 体外 将RAW264.7小鼠巨噬细胞培养72小时，并设置未处理对照组。暴露结束后，用秋水仙胺处理培养物以使细胞停滞于中期。随后收集细胞，经低渗溶液处理后，用乙酸甲醇固定，滴片至载玻片上，最后用吉姆萨染液染色。使用明场显微镜在1000倍放大倍数下观察中期分裂相，评估结构染色体畸变（CAs）。每组处理至少分析50至100个中期分裂相。该技术适用于检测结构染色体畸变（CAs），包括染色单体型断裂、染色单体型交换、无着丝粒片段、双着丝粒染色体和环状染色体、双微体、内复制以及罗伯逊易位 体外 暴露于PM后。该方法可有效将明确的细胞遗传学终点与表观遗传学改变相关联。

引言

据估计，暴露于颗粒物（PM）每年导致超过300万人过早死亡，主要死因为心肺疾病和肺癌¹。事实上，国际癌症研究机构已将PM列为对人类致癌的物质（1类致癌物），因为已有研究证实，随着PM暴露水平的升高，患肺癌的风险也随之增加²。有趣的是，几乎所有的癌细胞都携带数目和/或结构上的染色体异常。颗粒态有机碳是一种成分复杂且异质的混合物，其组成和粒径分布取决于排放源以及物理和化学转化过程。在城市PM_2.5（粒径小于或等于2.5 µm的颗粒物）中，颗粒态有机碳占其质量的35–55%，而在农村及大陆背景区域的PM_2.5中则超过60%^3,4。其中水溶性组分占有机气溶胶的30–90%。已通过色谱法结合质谱技术鉴定出大量有机化合物，包括脂肪烃、多环芳烃及其含氧、含氮衍生物、脂肪醛和醇类、游离脂肪酸及其盐类、二元羧酸、多功能化合物、蛋白质以及类腐殖质大分子（HULIS）^5–8。然而这些已识别的化合物仅占颗粒态有机碳总量的10–20%以下，因此大部分有机碳成分仍未知⁹。

实验证据表明，细胞毒性、氧化应激和炎症反应参与了颗粒物相关病理状态的发生发展。然而最近研究表明，暴露于颗粒物还会导致多种表观遗传学改变，包括实验条件下重复元件DNA甲基化水平的改变 体外 系统及人体受试者^10-12特别值得关注的是颗粒物（PM）对卫星DNA（包括主要卫星和次要卫星）的影响，这些卫星DNA位于染色体着丝粒周围的异染色质区域。研究表明，这些影响可能具有持续性，因为在暴露后至少72小时内仍可检测到。¹²DNA甲基化（尤其是着丝粒周围的甲基化）的改变可能导致卫星DNA mRNA转录本的积累，在细胞分裂过程中破坏染色体完整性，并进而引发多种病理状态的发生。¹³.

将细胞遗传学方法应用于分析由颗粒物（PM）引起的表观遗传改变终点——染色体畸变（CAs），具有重要意义。本文报道了环境颗粒物的采集与制备方法， 体外 利用小鼠巨噬细胞RAW264.7模型系统对细胞外囊泡（CAs）进行暴露与分析。巨噬细胞构成抵御吸入性外来物质的第一道防线，因此该细胞系在颗粒物毒理学研究中被广泛用作成熟且最常用的模型。^{11, 12, 14, 15}.

方案

1. 颗粒物的收集与制备

1. 大流量总悬浮颗粒物采样器的校准
   1. 将采样器电机与质量流量控制器断开，并将电机连接至稳定的交流电源（图1）。
      注意：本步骤中不使用滤膜。
   2. 将校准用孔口和顶部加载适配板安装到采样器上。牢固拧紧顶部加载适配器的固定螺母，确保无空气泄漏。让采样器电机预热至其正常工作温度（约10–15分钟）。
   3. 用手覆盖孔口顶部的孔洞及孔口上的压力接口，进行漏气测试。仔细听是否有空气逸出产生的高频尖锐啸叫声。若听到该声音，说明存在泄漏，需重新拧紧顶部加载适配器的固定螺母。若声音较低，则泄漏可能位于系统中其他垫圈附近。
   4. 使用橡胶真空管将水压计的一端连接至孔口侧面的压力接口，另一端保持向大气开放。将压差计垂直放置以确保读数准确。轻敲连续流量记录仪背面有助于使记录笔归中，从而获得准确读数。
   5. 重复步骤1.1.2，采用五个代表30至60 ft/min（约每5–6 ft³/min）操作流量的流速。调节可变孔口上的旋钮至五个不同位置，并记录五个不同的读数。
   6. 在校准表上记录环境空气温度、环境大气压、采样器序列号、孔口序列号、孔口斜率与截距及其上次认证日期、校准日期、采样地点以及操作人员姓名首字母。
2. 总悬浮颗粒物样品采集与重量分析
   1. 将一张8" × 10"石英纤维滤膜用两层铝箔包裹。将包裹好的滤膜放入马弗炉中，设定温度为550 °C，焙烧至少4小时。待炉温冷却后取出滤膜，放入装有CaCO₃的干燥器中。
   2. 使用精度为10 µg的微量天平称量滤膜。在一天内重复测量三次，各次测量值之间的差异应不超过25 µg。若未达到该要求，则将包裹好的滤膜重新放回干燥器，次日再次重复称量过程。
   3. 打开采样罩盖（图2）。松开四个蝶形螺母，取下滤膜夹持框，使黄铜螺栓和垫圈向下摆动让开位置。将滤膜从铝箔中展开，使用洁净镊子小心地将滤膜粗糙面向上、居中放置于支撑筛网上，并正确对齐滤膜位置。
   4. 将滤膜夹持框放回筛网上，用黄铜螺栓和垫圈固定，施加足够压力以防止边缘漏气。用干净布擦拭滤膜夹周围积聚的灰尘。小心关闭并固定采样罩盖。
   5. 确保所有电源线已正确插入相应插座，并连接鼓风机电机压力接口与连续流量记录仪之间的管路。
   6. 准备流量记录仪。按下记录笔抬升杆以抬起笔尖，插入新记录图表。将图表的定位标签对准记录仪驱动轴心，用拇指按压使图表中心卡入轴心。顺时针旋转驱动轴心，使图表上的正确时间与时间指示指针对齐，完成时间设定。
   7. 手动开启采样器并开始采样。监测记录仪，确保其正常出墨，并检查经过时间指示器是否正常工作。
   8. 采样结束后，关闭采样器，记录经过时间并取下记录图表。取下滤膜夹持框以暴露滤膜。用镊子轻轻夹住滤膜两端，从支撑筛网上取下已暴露的滤膜。将滤膜沿长度方向对折两次（使样品面接触样品面），然后用原始铝箔包裹。
   9. 将滤膜在装有CaCO₃的干燥器中至少存放24小时后再进行称重。重复步骤1.2.2，测量采样后滤膜的重量。将滤膜放入密封塑料袋中，于-80 °C保存，直至分析。
3. 采集的总悬浮颗粒物样品分析
   1. 取出保存的滤膜，展开铝箔，将滤膜转移至洁净的聚四氟乙烯（Teflon）表面。使用镊子和手术刀切除滤膜外侧（白色）部分并弃去。
      1. 随后将滤膜切成0.5" × 0.5"的小片，放入100 ml锥形瓶中。加入50 ml超纯水。将锥形瓶置于超声水浴中，在33±3 kHz条件下超声60分钟。
   2. 使用0.45 µm聚丙烯注射式滤器将滤液过滤至100 ml圆底烧瓶中。在50 °C条件下，使用旋转蒸发仪在减压下蒸发水分，直至烧瓶中剩余约5 ml提取液。
      1. 将剩余液体转移至已知重量的15 ml梨形烧瓶中，继续蒸发至干。称量含干燥提取物的烧瓶，记录干燥提取物的质量。
   3. 用400 µl D₂O溶解干燥样品，超声15分钟，然后转移至5 mm标准核磁共振（NMR）管中。在室温下以12,000 × g离心5分钟，去除未溶解物质。
   4. 再用300 µl D₂O重复洗涤一次。向NMR管中加入10 µl 1.4% NaN₃溶液（终浓度：0.02% w/v）。再向NMR管中加入10 µl（32 µg）总悬浮颗粒物-d4（TSP-d4，3.2 mg/ml），使其在D₂O中的终浓度为0.258 mM。
   5. 使用600.17 MHz核磁共振波谱仪采集¹H NMR谱图。
      1. 将NMR管插入三共振低温探头中。按以下顺序校准仪器：锁场、调谐、匀场、90°脉冲长度校准及接收增益调节。
      2. 在25 °C下，采用数字四通道检测模式，使用包含180个水选择性脉冲的一维激发塑形序列采集谱图。扫描次数为8,192次，预扫描4次，谱宽8012.57 Hz，水信号抑制频率偏移设为4.70 ppm，采集时间1.70秒，时域数据点数32,768（TD），梯度持续时间1 msec（p16），梯度后恢复延迟100 µsec（d16）。
   6. 对¹H NMR谱图进行处理：应用1 Hz线宽展宽，零填充至2倍（共65,536个数据点）。手动校正相位和基线，并进行积分。将TSP-d4峰设定在0.0 ppm处。

2. 颗粒物暴露

1. 培养设置
   1. 在开始培养前至少30分钟，将含有10%胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素溶液（100 U/ml）的完全培养基、0.25%胰蛋白酶溶液以及无钙镁的磷酸盐缓冲液（PBS）置于37 °C水浴中预热。
   2. 从5% CO₂培养箱中取出培养有RAW264.7细胞的T75培养瓶，用2 ml预热的PBS洗涤细胞两次。
   3. 使用1 ml预热的胰蛋白酶溶液处理，随后轻轻刮擦，使贴壁的RAW264.7细胞从培养容器底部脱落。
   4. 收集培养容器中的细胞，通过反复吹打制成单细胞悬液。用台盼蓝计数细胞，并以8,000/cm²的密度（总计500,000个细胞）接种于100 mm培养皿中，加入预热的完全培养基。调整培养基体积至10 ml，使最终细胞浓度为每毫升50,000个细胞。
      注：若同时进行DNA甲基化分析，需将培养皿数量加倍。
   5. 将新接种的RAW264.7细胞放回37 °C、5% CO₂培养箱中，静置培养24小时使其贴壁。
   6. 同时在生物安全柜中重悬过滤后的颗粒物。例如，将颗粒物用无菌PBS稀释至0.5 mg/ml以获得5 µg/ml的处理剂量，或稀释至5 mg/ml以获得50 µg/ml的处理剂量。稀释液可提前一个月配制，储存于-80 °C。
2. 颗粒物处理
   1. 从5% CO₂培养箱中取出细胞，在倒置显微镜下以10倍物镜观察细胞生长状态、形态、培养条件及是否存在污染。此时细胞融合度应至少达到30%。
   2. 在无菌条件下，使用无菌移液管吸除培养基，并用2 ml 37 °C的PBS洗涤培养容器两次，彻底去除残留培养基以及悬浮或死亡的细胞。
   3. 在培养容器中加入预先确定剂量的颗粒物和新鲜培养基，于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育指定时间。本研究中，对RAW264.7细胞进行72小时PM处理，以与同步进行的基因毒性和表观遗传毒性分析暴露时间保持一致。
      注：细胞毒性可能对染色体畸变分析的质量产生负面影响。因此，通常需对处理后的细胞额外开展细胞毒性、DNA甲基化、Western blot或基因表达分析等实验。按照上述方法处理细胞后，进行所需的特定检测。经验不足的操作者还可考虑设置阳性对照（如甲基磺酸甲酯），以验证其检测染色体畸变的能力。

3. 染色体畸变分析实验

1. 使细胞停滞于中期的处理
   1. 将秋水仙胺溶液（10 µg/ml）在37 °C水浴中预热30分钟。在生物安全柜中用70%酒精擦拭瓶盖，以尽量减少污染风险。
   2. 无菌条件下完全移除培养基，并用2 ml预热的PBS洗涤培养容器两次。
   3. 向培养容器中加入含秋水仙胺溶液（5 µl/ml）的预热新鲜培养基（2 ml培养基/10⁶个细胞），孵育2小时。
2. 细胞收获
   1. 将胰蛋白酶溶液和PBS置于37 °C水浴中预热30分钟。从本步骤开始，无需维持无菌条件。
   2. 完全移除培养基，用2 ml 37 °C的PBS洗涤培养容器两次，加入所需体积的预热胰蛋白酶溶液（通常60 mm培养皿或T25培养瓶加2 ml，100 mm培养皿或T75培养瓶加4 ml），将培养容器放回37 °C、5% CO₂培养箱中孵育1分钟。
   3. 取出培养容器，用细胞刮轻轻刮下细胞，并加入10 ml PBS以终止胰蛋白酶作用。
   4. 用移液器反复吹打至少十次以制成单细胞悬液，并将细胞转移至15 ml锥底离心管中。
   5. 在室温下，以400 × g离心5分钟（使用摆动转子离心机）。
   6. 移除上清液，轻敲管壁使细胞沉淀松散，加入10 ml PBS，再次离心5分钟。
3. 低渗处理与固定
   1. 将0.075 M氯化钾溶液在37 °C水浴中预热至少30分钟。
   2. 小心移除上清液，避免扰动细胞沉淀，保留约0.5 ml PBS。
   3. 轻轻吹打使细胞沉淀重悬，使用P200移液器制成单细胞悬液。
   4. 逐滴加入4 ml预热的氯化钾溶液，同时轻轻摇动。
   5. 将细胞在37 °C水浴中于低渗氯化钾溶液中孵育20分钟。
   6. 按3份甲醇与1份冰醋酸的比例新鲜配制甲醇-冰醋酸固定液（acetomethanol溶液），并将新配制的固定液置于室温备用。
   7. 低渗处理后，向管中加入等体积（4 ml）固定液，通过轻轻颠倒混匀。
   8. 在室温下以400 × g离心5分钟，弃去上清液。此时细胞沉淀体积增大，呈白色且更易观察。
   9. 弃去上清液，加入4 ml新鲜固定液，室温放置30分钟。
   10. 以400 × g离心5分钟，弃去上清液，并用4 ml固定液再洗涤两次。
4. 载玻片清洗与中期染色体铺展制备
   1. 将玻璃载玻片完全浸入10%液体洗涤剂中30分钟。
   2. 用流动的冷水彻底冲洗载玻片30分钟。
   3. 用蒸馏水冲洗载玻片三次，以彻底去除洗涤剂残留，然后将其浸入蒸馏水中，并存放于冰箱中以备后续使用。
      注意：使用前清洗载玻片有助于获得均匀的染色体铺展，并提高中期分裂相的质量。
   4. 取10 µl细胞悬液滴加于预冷的湿载玻片上，室温下静置过夜使其自然干燥。
5. 染色与封片
   1. 将一份吉姆萨染液与一份PBS混合，配制50 ml吉姆萨染色液，倒入考普林染缸中。
   2. 将载玻片浸入染色液中染色20分钟。
   3. 用蒸馏水冲洗载玻片以去除多余染料，并立即使用吹风机将载玻片吹干。
   4. 将载玻片在室温下放置过夜。
   5. 在载玻片上滴加一滴封片介质，轻轻将盖玻片覆盖其上，让介质缓慢扩散至整个载玻片区域，用纸巾吸除多余介质。封片后的载玻片需静置至少1小时，方可移动或在显微镜下观察，以防盖玻片移位。
      注意：此步骤中应小心放置盖玻片，避免产生气泡。不建议使用过热方式去除气泡。
6. 显微镜观察与染色体畸变类型分析
   1. 使用高质量的明场显微镜，在100倍放大倍数下观察中期染色体铺展中的结构染色体畸变（CAs）。
   2. 对于诱导大量染色体畸变的处理组，应至少分析50至100个中期分裂相。若效应较小，建议分析多达300个中期分裂相。

结果

在选择总悬浮颗粒物（TSP）采样器的位置以及确定采样季节时应格外谨慎，因为颗粒物的化学组成及其粒径可能显著影响实验结果。所收集的样品应在白色滤膜上清晰可见。正常的小鼠中期分裂相含有40条无着丝粒染色体。该技术的目的是展示经处理细胞与对照细胞之间异常染色体比例的变化（或无变化）。该变化随后可进行定量分析（异常染色体数量）和定性分析（异常类型）。

正常的小鼠中期染色体铺展含有40条无着丝粒染色体（图3A）。颗粒物处理可诱导多种染色体畸变，如图3所示，包括染色单体断裂（3B）、无着丝粒片段（3C）、环状染色体（3D）、双着丝粒染色体（3E）、双微小体（3F）、罗伯逊易位（3G）以及内复制（<...

讨论

染色体的细胞遗传学研究或显微分析，主要针对中期分裂相中的染色体数目或结构，可为多种疾病的预后评估、风险判断和治疗方案提供关键信息。目前已有充分证据表明，细胞遗传学异常与多种疾病（包括癌症）的发生和发展密切相关。迄今为止，在所有主要肿瘤类型中均已发现染色体异常（CAs）。这些异常可自发产生，也可由外部或内部刺激引发，例如电离辐射（IR）——这是可诱导多种类型细胞遗传学改变的主要外部风险因素之一¹⁶。对染色体异常的分析有助于评估机体吸收的辐射剂量（称为细胞遗传学辐射生物剂量测定）。此外，特定类型染色体畸变的发生频率和类型分析，还能提供有关吸收辐射质量的重要信息^{17, 18}。细胞遗传学研究能够直接呈现损伤因子对DNA的影响，这与彗星实验等间接检测技术形成对比。然而，由于该技术涉及大量手动操作步骤，细胞遗传学研究在辐射以外领域的应用仍显不足。

尽管已知颗粒物（PM）中有机碳的暴露会对人体健康产生不利影响，但报告其生物学效应的研究中很少包含对有机碳组成成分的分析⁹。这主要是由于常用的色谱分析方法成本高昂且操作繁琐，需要耗费大量...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
总悬浮颗粒物采样器	Tisch Environmental	TE-5170
Bruker Avance III 核磁共振波谱仪	Bruker	NA
TopSpin 3.5/pl2 软件	Bruker	NA
ACD/NMR Processor 学术版	ACD/Labs	NA
RAW264.7 小鼠巨噬细胞	ATCC	ATCC TIB-71
高糖 DMEM GlutaMAX 培养基	ThermoFisher	10569010	使用前在 37 °C 水浴中预热
胎牛血清	ThermoFisher	16000044	使用前在 37 °C 水浴中预热
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	ThermoFisher	15140163	使用前在 37 °C 水浴中预热
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	ThermoFisher	25200056	使用前在 37 °C 水浴中预热
PBS，pH 7.4	ThermoFisher	10010049	使用前在 37 °C 水浴中预热
KaryoMAX Colcemid PBS 溶液	ThermoFisher	15212012	使用前在 37 °C 水浴中预热
KaryoMAX 氯化钾溶液	ThermoFisher	10575090	使用前在 37 °C 水浴中预热
甲醇（HPLC 级）	Fisher Scientific	A452N1-19
冰醋酸	Fisher Scientific	BP1185-500
Decon Contrad 70 液体洗涤剂	Fisher Scientific	04-355-1
Wright 和 Wright-Giemsa 染色液	Fisher Scientific	23-200733
Permount 封片介质	Fisher Scientific	SP15-100
Axio Imager 2	Zeiss	NA