小鼠牙髓直接盖髓模型的建立及其在牙髓创面愈合与修复性牙本质形成评价中的应用

摘要

我们介绍了一种在小鼠牙齿上进行直接盖髓的逐步操作方法，用于评估牙髓伤口愈合及修复性牙本质的形成。 体内.

摘要

牙髓是由釉质和牙本质完全保护的牙齿 vital 器官。当牙髓因龋源性或医源性损伤而暴露时，通常会使用生物相容性材料进行盖髓，以促进牙髓创面愈合。其最终目标是再生修复性牙本质——一种作为“生物封闭”屏障的结构，保护下方的牙髓组织。尽管直接盖髓术已在牙科临床长期应用，但牙髓创面愈合及修复性牙本质形成的分子机制仍不甚清楚。为诱导修复性牙本质形成，已有研究在大型动物中进行实验性盖髓操作，但在小鼠中开展较少，可能与其体型较小及随之而来的技术难度有关。本文介绍了一种在小鼠中实施盖髓术的详细分步方法，包括制备类Ⅰ类洞、放置盖髓材料以及使用牙科复合树脂进行修复的操作流程。本研究所建立的小鼠盖髓模型将有助于深入探究修复性牙本质形成背景下牙髓创面愈合的基本分子机制 关键词：牙髓，盖髓术，修复性牙本质，创面愈合，小鼠模型，牙科材料，牙体修复 体内 通过利用研究领域广泛可得的转基因或基因敲除小鼠。

引言

龋齿是最常见的口腔疾病之一，也是几乎所有个体牙齿接受外科干预的首要原因^1,2。牙齿外科治疗和修复的预后在很大程度上取决于牙髓的正常反应以及创面愈合的成功与否。事实上，深入穿透釉质和牙本质的龋齿常导致下方牙髓组织暴露，通常需使用牙科材料进行“盖髓”，例如氢氧化钙（Ca(OH)₂）或水硬性硅酸钙水泥（HCSCs），后者包括矿物三氧化物凝聚体（MTA）。此类盖髓操作的最终目标是通过再生修复性牙本质——一种作为“生物封闭层”的物理屏障——来加速牙髓创面愈合，从而保护下方的牙髓组织，延长牙齿寿命并改善整体口腔健康。然而，牙髓创面愈合及修复性牙本质形成的潜在机制尚未完全阐明。

为了更好地理解牙髓伤口愈合及修复性牙本质形成的机制 体内曾使用过多种动物，包括猴子、狗和猪^3-5其中，大鼠因体型相较于其他动物较小，但其牙齿足够大，便于进行直接盖髓术，且无技术上的困难，故常被选用。^6-10这些动物模型是研究牙髓反应和修复性牙本质形成的理想替代方案。然而，它们的应用局限于细胞水平的观察性研究，极少能提供修复性牙本质形成过程中分子层面的机制性见解。

近年来，基因工程领域的技术进步提供了宝贵且不可或缺的研究工具——携带基因过表达或基因敲除的小鼠模型，这些工具对于在活体条件下研究人类疾病的分子机制至关重要。in vivo。在科学界，可诱导且具有细胞特异性表达策略的转基因小鼠或基因敲除小鼠品系数量正在持续增加。因此，在这些小鼠模型中研究牙髓伤口愈合及修复性牙本质再生过程，将极大促进我们从分子层面深入理解这些生物学过程。然而，由于小鼠牙齿体积微小，对其进行牙髓盖髓操作在技术上极具挑战性，这在很大程度上限制了小鼠模型的应用。本文中，我们介绍了一种可重复的小鼠直接盖髓操作方法，用于在活体条件下评估牙髓伤口愈合及修复性牙本质的形成。in vivo。

方案

小鼠购自杰克逊实验室，并饲养于加州大学洛杉矶分校实验动物医学部（DLAM）的无病原体动物房。实验操作均依照校长动物研究委员会批准的机构指南进行。 （ARC#2016-037）

1. 小鼠麻醉

1. 使用8周龄雌性C57/BL6小鼠（n = 3）。
2. 使用氯胺酮（80–120 mg/kg小鼠体重）/赛拉嗪（5 mg/kg小鼠体重）溶液对小鼠进行麻醉，并以10 mL/kg剂量腹腔注射（ip）给药。
3. 配制氯胺酮（80–120 mg/kg）/赛拉嗪（5 mg/kg）溶液，并以10 mL/kg剂量腹腔注射（ip）给药。
4. 通过脚趾夹捏实验确认小鼠已完全麻醉。

2. 盖髓术操作步骤

1. 将口撑器放入小鼠口中。
2. 将口撑器固定在桌面上，使小鼠头部朝上。
3. 将显微镜（10倍）置于口腔上方，使上颌第一磨牙完全可见。
4. 使用高速手机上的¼圆钻针，以200,000 rpm转速，从中部去除牙釉质部分，直至通过透明的牙本质可见牙髓，但不得用钻针暴露牙髓。
5. 使用#15根管K锉（直径150 µm），穿透牙本质并暴露牙髓。
   注意：操作时需格外小心，避免牙本质碎屑被推入牙髓腔。可通过每四分之一圈旋转K锉后将其退出的方式避免此问题。
6. 按照制造商说明，将MTA与无菌H₂O混合。用探针尖端将MTA输送并放置于暴露的牙髓上。使用纸尖（细型）的背面，通过轻敲方式将MTA压实至暴露的牙髓中。纸尖较厚的一侧为平面，有助于将MTA适当压实于暴露的牙髓处。
7. 将35%磷酸酸蚀剂涂布于牙齿表面，酸蚀15秒，用量以刚好覆盖牙齿为宜。需特别注意控制酸蚀剂的范围，以免刺激牙龈组织。
   注意：酸蚀剂以注射器形式提供，用于粗糙化牙面，使牙科粘接剂能够渗入并实现与牙齿的微机械结合。由于其具有粘性，可通过直接在牙面施加少量实现局部控制。
8. 使用负压吸引装置清除酸蚀剂。用少量浸湿H₂O的棉球轻轻擦拭残留酸蚀剂。重复此步骤，直至牙齿表面完全清除酸蚀剂。
9. 使用压缩空气吹气器，轻柔吹干牙齿表面。
10. 用纸尖的背面将牙科粘接剂涂布于牙齿表面。
11. 用压缩空气吹3秒，使粘接剂形成薄层。
12. 使用光固化仪照射20秒，固化牙科粘接剂。
13. 将流动性复合树脂少量分次置于已用MTA覆盖的牙齿上。用探针尖端将复合树脂导入牙齿沟隙中。
14. 使用光固化仪照射30秒，使复合树脂聚合固化。用探针确认复合树脂已完全固化且坚硬。

3. 术后护理

1. 在牙髓盖髓手术后立即皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）。
2. 将小鼠置于低功率加热垫上，以保持动物在苏醒前体温。
3. 将小鼠送回动物房进行饲养。

4. 组织获取

1. 5 - 6 周后，在异氟烷完全麻醉条件下，通过颈椎脱位法处死小鼠。
2. 小心地将上颌骨从颅底取出，并放入 50 mL 离心管中。将包含牙髓切断牙及对侧未处理牙的完整上颌骨置于含 4% 多聚甲醛的 PBS（pH 7.4）溶液中，于 4 °C 固定过夜，随后转移至 70% 乙醇溶液中保存。
   注意：多聚甲醛具有毒性和致癌性，其使用应遵循标准操作程序（SOP）中的相关规定。
3. 使用 µCT 扫描仪对小鼠上颌骨进行扫描。为确保扫描过程中样本固定，应用浸有 70% 乙醇的纱布包裹样本，并将其置于 15 mL 细胞培养管中。

5. µCT 扫描

1. 准备样品以进行微计算机断层扫描（µCT）。简而言之，用浸有70%乙醇的纱布包裹样品，并将其固定于标准的15 mL细胞培养锥形管中。根据制造商说明书，将该管安装到µCT扫描仪的样品台上。
2. 将X射线源设置为电流145 µA、电压55 kVp、曝光时间200 ms。
3. 使用µCT扫描仪以20 µm分辨率和0.5 mm铝滤片进行图像采集。
4. 重建图像并进行可视化¹¹。
5. µCT扫描完成后，使用含5% EDTA和4%蔗糖的PBS（pH 7.4）开始脱钙，持续2周。

6. 组织处理与染色

1. 将脱钙组织包埋于石蜡中。包埋前，于第一磨牙前方立即进行矢状切面切割，修整上颌骨。包埋时，将此切面朝下放置，使第一磨牙的纵切面成为切片表面。
2. 使用切片机制备厚度为 5 µm 的切片。牙髓盖髓区域通常与远中腭侧（DP）根一致，可作为解剖标志。通过光学显微镜观察组织学切片并结合 µCT 图像，确定确切的兴趣区域。
3. 进行 H&E 染色时，使用二甲苯（2 次）及梯度稀释的乙醇（100% 乙醇 2 次、95% 乙醇 2 次、70% 乙醇 1 次）对切片进行脱蜡和水化处理。
4. 用流动的自来水冲洗切片。
5. 用苏木精溶液染色 2.5 分钟，随后用自来水冲洗。
6. 将切片浸入 95% 乙醇中 1 分钟。
7. 用伊红溶液染色 1 分钟，随后用自来水冲洗。
8. 使用梯度稀释的乙醇（70% 乙醇 1 次、95% 乙醇 2 次、100% 乙醇 3 次）和二甲苯（3 次）进行脱水处理。
9. 用封片剂封片。

结果

本文展示了在小鼠牙齿上进行活髓保存治疗的逐步操作流程。小鼠活髓保存的关键之一是具备合适的设备。为此，使用放大倍数为10倍的显微镜至关重要（图1A）。为了在牙齿上制备类似I类洞的结构，我们采用电动高速手机配合¼号圆锥形车针，转速为200,000 rpm（图1B）。此外，也可使用其他类型的手机，包括气动手机，来进行牙体预备。

在图2A-2E中，展示了进行牙髓盖髓的代表性步骤。首先进行类I类洞型预备（图2B）。由于使用水喷雾可能在操作过程中使小鼠窒息，因此不建议使用。基于此，必须采用轻柔且间断的手法预备牙齿，以防止过热。同时建议使用压缩空气以达到冷却效果。在使用根管锉暴露牙髓时，应注意避免将牙本质碎屑推入牙髓腔内，因为这可能干扰修复性牙本质形成的数据解读（图2C）。此问题可通过使用压缩空气加...

讨论

目前，已有多种不同的实验模型可用于验证牙科材料、支架或生长因子对牙髓干细胞（DPSCs）成牙本质向分化in vivo 效应¹³。这些模型包括将DPSCs异位自体移植至器官（如肾包膜）中，或将DPSCs与支架材料一起皮下移植至免疫缺陷小鼠体内^14,15。然而，这些方法的局限性在于，其对DPSCs的成牙本质作用并非发生在原位牙髓环境中。另一方面，原位牙髓内移植或牙齿的活髓保存术则常用于较大的动物模型^16,17。尽管这些模型在评估原位环境中的成牙本质潜能方面具有重要价值，但其应用主要局限于观察性研究，对于牙髓伤口愈合及修复性牙本质形成的机制性认识仍十分有限。

本文介绍了一种在小鼠中进行牙髓盖髓的详细方法。该逐步操作流程包括对小鼠进行麻醉、制备类Ⅰ型窝洞、放置盖髓材料、采集上颌骨、进行µCT扫描分析，以及评估组织样本中的修复性牙本质形成情况。我们的小鼠盖髓模型将有助于在修复性牙本质形成的背景下，利用转基因或基因敲除小鼠（在科研领域广泛可得）研究牙髓伤口愈合的基本分子机制体内过程。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BM-LED 体视显微镜	MEIJI Techno		显微镜
Optima MCX-LED	Bien Air Dental	1700588-001	电动马达引擎
异氟烷	Henry Schein 动物健康公司	NDC 11695-0500-2
1/4 圆形车针	Brasseler	001092T0
根管K锉	Roydent	98947
ProRoot MTA	Dentsply	PROROOT5W	MTA
吸纸尖	Henry Schein	100-3941
Ultra-Etch	Ultradent 产品公司		磷酸酸蚀剂
OptiBond SoloPlus	Kerr	29669	粘接剂
Coltolux LED	Coltene/Whaledent 公司	C7970100115	光固化灯装置
显色染料	Bisco	T-14012	可流动复合树脂
Skyscan	Breuker	1275	微计算机断层扫描仪（uCT scanner）
Microm	Thermo	HM355S	切片机
苏木精-1	Thermo Scientific	7221
伊红-Y	Thermo Scientific	7111
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-16	封片液