伤口的牙髓评价一个直接盖髓模型的开发和治疗小鼠中修复性牙本质形成

Summary

我们描述了执行直接纸浆对小鼠齿封盖为牙髓创伤愈合和体内修复象牙质形成的所述评估的步骤的分步方法。

Abstract

牙髓是牙齿的重要器官，受到牙釉质和牙本质的全面保护。当牙髓因龋行性或医源性损伤而暴露时，通常用生物相容性材料覆盖，以加速牙髓伤口愈合。最终目标是再生修复牙本质，这是一种物理屏障，起到"生物密封"的作用并保护下面的牙髓组织。尽管这种直接的牙髓覆盖程序长期以来一直用于牙科，但牙髓伤口愈合和修复牙本质形成的潜在分子机制仍然知之甚少。为了诱导修复牙本质，已经在大型动物中进行了牙髓覆盖实验，但在小鼠中进行的实验较少，这可能是由于它们的小尺寸和随之而来的技术困难。在这里，我们介绍了一种在小鼠中执行牙髓覆盖程序的详细分步方法，包括制备 I 类腔、放置牙髓覆盖材料以及使用牙科复合材料的修复程序。我们的牙髓帽小鼠模型将有助于研究在体内修复牙本质背景下牙髓伤口愈合的基本分子机制，从而能够使用研究界广泛使用的转基因或敲除小鼠。

Introduction

龋齿是最普遍的口腔疾病之一，也是几乎所有个体对牙列进行手术干预的主要原因^1,2。手术干预和牙齿修复的预后在很大程度上取决于适当的牙髓反应和伤口的成功愈合。事实上，深入牙釉质和牙本质的龋齿经常导致下面的牙髓组织暴露出来，这些牙髓组织通常被牙科材料"覆盖"，例如氢氧化钙 （Ca（OH）₂） 或液压硅酸钙水泥 （HCSC），包括矿物三氧化物聚集体 （MTA）。这种牙髓覆盖程序的最终目标是通过再生修复牙本质来加速牙髓伤口愈合，修复牙本质是一种物理屏障，起到"生物密封"的作用，以保护下面的牙髓组织并延长牙齿的预期寿命和整体口腔健康。然而，牙髓伤口愈合和修复牙本质形成的潜在机制尚不完全清楚。

为了更好地了解体内牙髓伤口愈合和修复牙本质形成的机制，以前使用了几种动物，包括猴子、狗和猪^3-5。其中，大鼠经常被使用，因为它们的体型与其他动物相比相对较小，但它们的牙齿足够大，可以进行直接牙髓覆盖，无需任何技术困难^6-10。这些动物模型是人类研究的理想替代品，用于检查牙髓反应和修复牙本质形成。然而，它们的利用仅限于细胞水平的观察性研究，并且在分子水平的修复牙本质形成过程中几乎无法提供机制见解。

基因工程的最新技术进展提供了宝贵且不可或缺的研究工具——携带过表达或缺失基因的小鼠——有助于研究体内人类疾病的分子机制。在科学界，以细胞特异性方式战略性诱导的不同转基因或基因敲除小鼠菌株的数量不断增加。因此，检查这些小鼠的牙髓伤口愈合和修复牙本质再生将极大地有助于我们在分子水平上加快对这些过程的理解。然而，小鼠的使用受到显着抑制，因为由于其微型尺寸，对小鼠牙齿进行牙髓加帽手术在技术上具有挑战性。在这里，我们提出了在小鼠中进行直接牙髓覆盖以评估体内牙髓伤口愈合和修复牙本质形成的可重复方法。

Protocol

小鼠从杰克逊实验室购买并保存在实验动物医学UCLA司（DLAM）无病原体动物饲养。实验是按照从校长的动物研究委员会（ARC＃2016-037）批准的机构准则进行的。

1.鼠标麻醉

1. 使用八周龄雌性C57 / BL6小鼠（n = 3）。
2. 麻醉用氯胺酮（80-120毫克/千克小鼠体重）/赛拉嗪（5mg / kg的小鼠体重的）解决方案的小鼠和在剂量为10毫升/千克腹膜内（IP）施用。
3. 制备氯胺酮（80 - 120毫克/千克）/赛拉嗪（5mg / kg的）解决方案，并在剂量为10毫升/千克腹膜内（IP）施用它们。
4. 确认小鼠完全通过执行脚趾捏麻醉。

2.盖髓过程

1. 放置在鼠标的嘴的嘴保持器。
2. 固定口保持器上的表，使得他广告朝上。
3. 放置在口的顶部的显微镜（10X），使得第一磨牙完全可见。
4. 使用¼ - 圆钻在高速手机为20万转，除去中间的牙釉质一部分，直到纸浆是通过透明牙本质可见。不要暴露与钻纸浆。
5. 使用＃15牙髓K-文件（150微米直径），通过穿孔牙本质和揭露浆。
   注:特别应注意，使牙本质碎片不会被压入纸浆。这可以通过每季度转动K-文件，然后拉K-鱼贯而出避免。
6. 根据制造商的说明用无菌H _2ö混合MTA。交付和MTA放置到露髓的探险家的一角。使用纸张点（精）的背面侧到MTA包入露髓通过轻轻敲击。纸点的较厚侧是平坦的，因此可以对MTA的正常凝结成露髓。
7. 通过将35％的磷酸刻蚀剂，其中它只是覆盖了牙齿蚀刻15秒的牙齿。要特别小心，以限制蚀刻剂的位置，因为它可能会刺激牙龈组织。
   注:蚀刻剂是在一个注射器中，并用来粗糙化的牙齿表面，使牙科用粘合剂可以流动到调解微机械粘合到牙齿。因为它们是粘性的，它可以是自包含的直接涂布少量到牙齿。
8. 使用负压力抽吸去除腐蚀剂。使用所轻轻用H ₂ O中浸泡以除去蚀刻液的残差一个棉球。重复此步骤，直至蚀刻液完全从牙齿去除。
9. 使用压缩空气除尘器，轻轻擦干牙齿。
10. 申请使用的纸张点的背面的牙科粘合剂。
11. 使用压缩空气3秒的粘合剂层薄。
12. CURE使用固化光用单元20秒的牙科粘合剂。
13. 放入少量的流动树脂到这是与MTA皑皑的牙齿。使用浏览器的尖端复合流入齿槽。
14. 固化复合用于使用光固化单元聚合它30秒。确认复合材料完全固化并用坚硬的探险家。

3.后运护理

1. 管理该盖髓过程后立即卡洛芬（5毫克/千克）皮下（SC）。
2. 放置在一个加热垫的老鼠在低功耗，以保持温暖的动物，他们醒过来了。
3. 返回小鼠动物饲养住房。

4.组织采购

1. 经过5 - 6周，安乐死与异氟醚麻醉完备的条件下通过颈椎脱位的小鼠。
2. 小心取出颌骨出头骨的基地，放入50毫升管。修复entir包含纸浆封端齿与在PBS中的4％多聚甲醛，pH值7.4对侧未加帽的齿都在4℃下过夜，然后将其存储在70％的乙醇溶液E颌骨。
   注:多聚甲醛是有毒和致癌性。作为标准操作程序（SOP）中列出的正确使用多聚甲醛进行监测。
3. 扫描使用扫描μCT鼠标上颌骨。在扫描期间固定上颌骨，用纱布用70％乙醇浸泡包裹样本，将它们放置在15 mL细胞培养管。

5.μCT扫描

1. 准备μCT扫描样本。简言之，将包裹的试样用纱布用70％乙醇浸泡和在通用的15毫升细胞培养物的锥形管固定。安装在管上的μCT扫描阶段，在制造商的说明所述。
2. 的X射线源设定为145微安的电流，55 kVp的的一个电压，和2的曝光时间00毫秒。
3. 用μCT扫描器在20微米分辨率和0.5mm的铝过滤器执行图像采集。
4. 重建图像和可视化是^11。
5. 一旦μCT扫描完成后，2周开始脱钙，用5％EDTA和PBS中4％蔗糖（pH 7.4）中。

6.组织处理和染色

1. 嵌入在石蜡脱钙组织。之前嵌入，通过矢状精确剪裁上颌骨前壁立即向第一磨牙。而嵌入，向下定位该表面，使得第一磨牙的纵向截面是切割表面。
2. 使用切片机，准备5微米厚的幻灯片。纸浆封区域通常与distopalatal（DP）的根，它可被用作一个划时代重合。通过检查在光学显微镜下组织学和比较μCT图像确定感兴趣的精确区域。
3. 对于H＆E染色，deparaffinize并用二甲苯（2×）和连续稀释的乙醇（100％EtOH中2倍，95％的EtOH 2x，以及70％乙醇1×）再水合的幻灯片。
4. 冲洗用流动的自来水的幻灯片。
5. 与2.5分钟苏木素液染色，用自来水冲洗。
6. 浸在95％乙醇的幻灯片1分钟。
7. 用1分钟伊红染色解决方案，并与自来水冲洗。
8. 用连续稀释的乙醇（70％EtOH中1个，95％的EtOH 2x，以及100％乙醇3×）和二甲苯（3×）脱水。
9. 安装与安装解决方案的幻灯片。

Results

在这里，我们展示了一步一步的过程来执行盖髓对老鼠牙齿。其中纸浆小鼠封盖的关键方面是有相应的设备。在这方面，具有与10倍放大的显微镜是必要的（ 图1A）。要创建在齿类-I样的准备，我们为20万转（ 图1B）使用1/4轮毛刺在电动高速手机。备选地，任何其他的发动机，包括那些使用压缩空气，可用于制备牙齿。

在图2A-2E，用于进行盖髓代表步骤被示出。进行（ 图2B）的Class-Ⅰ类制剂。因为喷水可能在手术过程中淹没的小鼠，不推荐使用它。出于这个原因，它与温柔intermi制备牙齿是必不可少ttent招，以防止经济过热。还建议利用压缩空气以提供冷却效果。而纸浆与根管锉曝光，采取小心不要牙本质碎片推入纸浆，因为这可能在修复性象牙质的形成（ 图2C）中的数据解释干扰。这可以通过使用压缩空气来避免...

Discussion

目前，有可用来验证牙科材料，支架，或生长因子对牙髓干细胞（牙髓干^）13的牙源性分化的体内作用几个不同的实验模型。这些模型包括牙髓干细胞的异位自体移植到器官，如肾包膜，或牙髓干细胞的皮下移植入与支架^14,15免疫功能低下的小鼠。然而，这些方法是有限的，不是在原位纸浆环境中执行对牙髓干细胞的牙源性作用。另一方面，原位移植到牙齿上的纸浆或纸浆封盖程序在较大的动物^16,17被使用。虽然这些模型都是在原位环境评估牙源性潜在价值，使用这些模式在本质上是主要的观测，提供有关纸浆伤口的愈合和修复性牙本质形成机械有限见解。

在本文中，我们呈现给小鼠进行盖髓的详细方法。这一步一步的过程包括麻醉的小鼠，制备类我状腔，放置盖髓材料，收获的上颌骨，用μCT分析扫描，并评估组织样品用于修复性象牙质的形成。我们的盖髓小鼠模型将在通过使利用转基因或基因敲除小鼠，这是在研究界广泛使用的调查体内牙髓创伤愈合修复性牙本质的上下文中的基本分子机制的工具。

最...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BM-LED 体视显微镜	明治 Techno		显微镜
Optima MCX-LED	Bien Air Dental	1700588-001	电动发动机
异氟烷	Henry schein 动物保健	NDC 11695-0500-2
1/4 圆针	Brasseler	001092T0
牙髓病 K 文件	Roydent	98947
ProRoot MTA	Dentsply	PROROOT5W	MTA
纸点	Henry schein	100-3941
Ultra-Etch	Ultradent product Inc. （超蚀刻 Ultradent 产品有限公司）		磷酸蚀刻剂
OptiBond SoloPlus	Kerr	29669	胶粘剂
Coltolux LED	Coltene/whaledent Inc.	C7970100115	固化光装置
特性 色调	Bisco	T-14012	可流动复合材料
Skyscan	Breuker	1275	uCT 扫描仪
Microm	Thermo	HM355S	切片机
苏木精-1	Thermo Scientific	7221
曙红-Y	Thermo Scientific	7111
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-16	封片剂