三维全心心肌组织分析

摘要

本方案描述了一种将完整心脏心肌组织与磁共振成像（MRI）进行三维比对的新方法。该方法旨在对慢性猪心肌梗死模型中梗死边缘区的心肌内注射进行精确定量评估。

摘要

心脏再生治疗旨在保护和修复缺血性心脏病患者受损的心脏。通过将干细胞或其他促进血管生成或血管形成的生物制剂注射到梗死边缘区（IBZ），可改善组织灌注，从而保护心肌免受进一步损伤。为了达到最佳治疗效果，人们认为将再生物质精准递送至IBZ最为理想。这需要精确的注射技术，也推动了新型注射技术的发展。为了验证这些新技术，我们设计了一种基于心肌组织分析的验证方案。该方案包括全心脏心肌组织处理，能够对心脏解剖结构和心肌内注射进行详细的二维（2D）和三维（3D）分析。在猪模型中，通过阻断左前降支冠状动脉90分钟以诱导心肌梗死。四周后，采用微创经心内膜途径将含有超顺磁性氧化铁颗粒（SPIOs）和荧光微珠的水凝胶混合物注射至IBZ。注射后1小时，处死动物并取出心脏，将其包埋于琼脂糖（agar）中。琼脂凝固后，进行磁共振成像（MRI）、心脏切片及荧光成像。经过图像后处理，开展三维分析以评估注射对IBZ的靶向准确性。本方案为评估心肌内注射至IBZ的靶向准确性提供了一种系统化且可重复的方法。当需要处理瘢痕组织和/或验证全心脏注射准确性时，该方案可被便捷地应用。

引言

过去几十年中，缺血性心脏病一直是全球首要死因¹急性心肌梗死后治疗的目标是恢复心肌的血流灌注 通过 经皮冠状动脉介入治疗或冠状动脉旁路移植术。在严重的心肌梗死中，心肌的大片区域发生瘢痕化，这些病例常导致缺血性心力衰竭（HF）。²目前针对心力衰竭的治疗方案主要侧重于预防以及维持心力衰竭患者的心脏功能，而非心脏再生。

近十年来，心脏再生疗法已被作为心力衰竭（HF）³的一种治疗选择进行研究。该疗法旨在将生物制剂（如干细胞或生长因子）直接递送至受损心肌，以促进血管再生、心肌细胞保护、分化和生长⁴。为了达到最佳治疗效果，人们推测生物制剂必须注射到梗死边缘区（IBZ），以促进靶区域良好的组织灌注，从而提高生物制剂的存活率及其对靶区的治疗效果^5,6。目前已开发出多种技术用于识别和可视化IBZ，以指导心肌内注射^7,8,9,10

方案

的 体内 实验按照由实验动物研究学会编制的《实验动物护理与使用指南》进行。本实验已获得当地动物实验委员会的批准。

1. 注射用溶液和包埋溶液的制备

1. 制备注射用凝胶。
   1. 按照先前描述的方案^12,13制备1 mL脲基-嘧啶酮（UPy）凝胶。
   2. 向溶液中加入超顺磁性氧化铁颗粒（SPIOs），使其终浓度为15 µg/mL，并搅拌5分钟以确保均匀分布。
   3. 向溶液中加入荧光微珠，使其终浓度为10,000个微珠/mL，并搅拌5分钟以确保均匀分布。
   4. 将所得混合物在室温避光条件下储存。注射前短暂加热并涡旋或搅拌溶液。
2. 制备包埋溶液。
   1. 以室温自来水为起始，加入琼脂糖（agar），使其终浓度为4 wt%。
   2. 使用微波炉缓慢加热溶液至沸点，加热过程中频繁搅拌。达到沸点后，将琼脂溶液保持在70 °C以上并静置2小时，以使截留的气泡逸出。
   3. 让琼脂在室温下冷却至50至60 °C，并在此温度范围内保存直至包埋时使用。

2. 注射操作步骤

结果

组织包埋

通过包埋过程，建立了类似舒张末期的几何形态。琼脂成功黏附于心脏组织，使组织能够以理想的倾斜角度进行切片，并获得均匀的切片厚度（图 2A 和 2C）。

瘢痕及注射部位评估

对于每种成像方式，梗死区域和注射部位的评估均成功完成。在二维荧光成像和磁共振成像中，瘢痕组织与注射位点均清晰可辨。图2C, 二维，以及 2E, 分别）。TTC染色组织的照片和LGE-MRI图像为荧光成像中的瘢痕评估提供了对照。图2A.......

讨论

完整心脏三维心肌组织处理按照本方案提供了一种结构化方法，可实现相对于心脏解剖结构对梗死区、梗死周边区（IBZ）以及注射位点进行三维分析。心脏灌注体积取决于所需的分析内容。在本研究中，为评估注射准确性，我们力求将心脏填充至尽可能接近舒张末期几何形态。为实现这一目标，将左心室心尖部固定于容器底部，在夹闭肺静脉的同时向左心室注入琼脂。当左心室充满后，再夹闭主动脉，以防止琼脂流出，从而尽可能模拟舒张末期的心脏几何形态。对包埋后的心脏进行切片，可确保切片厚度均匀，并使各切片保持与原始心脏相同的切面角度 离体 成像。切片后，包埋材料可防止在图像采集过程中因操作切片而导致的组织变形。理想情况下，组织离体后应尽快进行TTC染色，因为该染色依赖于酶活性来区分代谢活跃与非活跃的组织。然而，在本方案中，TTC染色前必须完成多个关键步骤，包括包埋过程，即包埋后的心脏需冷却以使琼脂凝固。由于我们在所有切片中均观察到梗死组织清晰的染色结果，因此认为这一延迟对染色效果的影响极小。

此处使用的成像设备可替换为具有相同功能的其他设备。为了对组织进行有效且准确的处理，必须使用具备可变模式激光扫描仪的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 生理盐水	Braun
琼脂糖	Roche Diagnostics		科学级多用途琼脂
Biomolecular fluorescence scanner Typhoon 9410	GE Healthcare
包埋盒			塑料材质，尺寸为 17 x 14.5 x 14 cm
FluoSpheres 聚苯乙烯微球	Invitrogen	F8834	红色，10 µm
钆	Gadovist		1.0 mmol/mL
dS 32 通道头部线圈	Philips		或类似产品
Matlab	Mathworks		为确保兼容性，需使用 2015a 或更高版本
切肉机	Berkel
Myostar 注射导管	Biosense Webster
超顺磁性氧化铁颗粒	Sinerem
氯化三苯基四氮唑	Merck
UPy-PEG10k
Vicryl 2-0	Ethicon