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方法文章

通过与正在经历凋亡性细胞死亡的邻近细胞相互作用，在活细胞中诱导的细胞内信号事件的鉴定

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⸱

DOI：

10.3791/54980

⸱

2016年12月27日

 ,  ,  ,  , 
1Section of Nephrology, Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Section of Nephrology, Department of Medicine, Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Biology, Kutztown University of Pennsylvania, 4Division of Rheumatology, Department of Medicine, Research Institute of the McGill University Health Centre, 5Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois at Chicago

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于检测活细胞与邻近死亡或濒死细胞发生物理相互作用后所诱导的细胞内信号转导事件的实验方案。该方案侧重于由受体介导的对死亡细胞识别所引发的信号事件，而非对死亡细胞的吞噬摄取或可溶性介质的释放。

摘要

通过凋亡死亡的细胞，也被称为程序性细胞死亡，会获得多种新功能，使其能够影响邻近活细胞的功能。生存、增殖、生长和分化等重要生物学活动，均属于凋亡细胞所调控的众多细胞功能之列。识别并响应凋亡细胞的能力似乎是所有细胞共有的普遍特征，无论其谱系或来源器官如何。然而，细胞对凋亡细胞的反应具有高度多样性和复杂性，因此在解析导致特定生物学效应的信号事件和通路时必须格外谨慎。尤其需要区分凋亡细胞影响活细胞内信号通路的多种机制，包括：对凋亡细胞的受体介导识别、凋亡细胞释放可溶性介质，以及/或者吞噬机制的激活。本文提供了一种用于鉴定活细胞在接触凋亡细胞后所诱导的细胞内信号事件的实验方案。该方案的主要优势在于其对凋亡细胞调控应答细胞内信号事件机制的细致解析。尽管本方案针对一种条件性永生化的小鼠肾近端小管上皮细胞系（BU.MPT细胞），但其可轻松适用于非上皮来源和/或来源于肾脏以外器官的其他细胞系。使用死亡细胞作为刺激物会引入若干独特因素，可能干扰细胞内信号事件的检测。本方案中讨论了这些问题以及最小化或规避这些问题的策略。应用此方案将有助于进一步拓展我们对死亡或濒死细胞在健康和疾病状态下对邻近活细胞广泛影响的认识。

引言

细胞凋亡，或称程序性细胞死亡1，对组织的维持和发育具有至关重要的作用。最简单的理解是，细胞凋亡能够清除衰老、受损或多余的细胞，同时不对周围组织造成损害2,3。然而，细胞凋亡在组织稳态中的作用远比这更为动态和多样。发生凋亡的细胞会获得多种新的功能，包括分泌性因子和细胞相关活性，从而影响邻近活细胞的功能4-10。早期研究主要关注凋亡细胞抑制炎症反应的能力11-16，但现已发现凋亡细胞还能调节广泛的细胞功能，包括存活4,9,10、增殖4,9,10、分化17、迁移18和生长19等关键生物学过程。此外，这些效应不仅限于巨噬细胞等专职吞噬细胞，而是几乎存在于所有细胞类型和谱系中，包括传统上被认为不具备吞噬能力的上皮细胞和内皮细胞7,9,10,18-21。

凋亡细胞暴露后邻近活细胞的特异性反应取决于多种因素，这些因素与存活的反应细胞以及凋亡细胞本身均相关。例如，尽管暴露于凋亡细胞会抑制小鼠巨噬细胞和肾近端小管上皮细胞（PTECs）的增殖，但这两类细胞在对凋亡细胞的存活反应上表现出显著差异4,6,9,10凋亡细胞可促进巨噬细胞的存活，但会诱导近端肾小管上皮细胞（PTECs）发生凋亡性死亡4,6,9,10值得注意的是，即使在同一谱系的反应细胞中，其对凋亡细胞的反应也可能因其来源器官的不同而存在差异10 (例如，肾近端小管上皮细胞 与 乳腺上皮细胞）或活化状态22 (例如，中性粒细胞）。相反，凋亡细胞可能因凋亡刺激的性质不同，而在同一种细胞中引发不同的反应10,23 或凋亡阶段10,14.

鉴于对凋亡细胞反应的多样性和复杂性，在解析导致特定结果的信号事件和通路时必须格外谨慎。首先，必须区分那些需要活细胞与凋亡细胞之间直接物理接触的反应，以及由凋亡细胞释放或产生的可溶性介质所引发的反应3,6-10。如果需要物理接触，则应进一步加以区分：信号事件可能依赖于受体介导的对凋亡细胞的识别，而与后续的吞噬过程无关；也可能依赖于吞噬性摄取，而与结合凋亡细胞的特定受体无关3-7,9,10,19。在后一种情况下，该反应并非凋亡细胞所特有，任何可被吞噬的物质均可触发此类反应4,6。

通过比较巨噬细胞和肾脏近端小管上皮细胞（PTEC）的反应，可以再次理解这些差异的重要性。对于这两种细胞类型，暴露于凋亡细胞均会改变促存活激酶Akt的活性。这种调节依赖于物理接触，因为使用0.4 μm聚碳酸酯膜将反应细胞与凋亡细胞分隔后，该反应即被消除4,9,10,19。然而，PTEC的反应是受体介导的，并且不依赖于吞噬作用，而巨噬细胞的反应则由吞噬作用驱动4,9,10,19。这一结论得到了进一步支持：暴露于乳胶微球（一种中性的吞噬刺激物）对PTEC中的Akt活性无影响，但在巨噬细胞中却能模拟凋亡细胞的作用4,9。

尽管研究较少，但通过坏死或意外性细胞死亡方式死亡的细胞1也能调节邻近存活细胞的功能3-10,19。与凋亡细胞类似，坏死细胞主要通过多种机制发挥作用，尤其是通过破裂的细胞膜泄漏胞内内容物3,5,6,9,24。许多细胞（包括近端肾小管上皮细胞和巨噬细胞）均具有特异且互不竞争的受体，可识别坏死性死亡的细胞5,9。这些受体的激活所诱导的信号事件，通常与凋亡细胞受体激活所引发的信号相反4-10,19。例如，在近端肾小管上皮细胞中，坏死细胞会增加Akt的磷酸化水平，而凋亡细胞则降低其磷酸化水平9,10,19。

本文描述了一种用于检测活体肾近端肾小管上皮细胞（PTEC）在通过受体介导识别相邻凋亡PTEC后所诱导的细胞内信号事件的实验方案9,10,19。尽管该方案专为一种条件性永生化的PTEC细胞系（即BU.MPT细胞）设计9,10,19,25,26，但其可轻松适用于非上皮来源和/或来源于肾脏以外器官的其他细胞系。重要的是，使用凋亡细胞作为细胞刺激物会带来某些固有的实验困难，而这些困难在使用可溶性配体时并不存在。其中最主要的问题是，凋亡细胞必须以悬浮液形式添加，而非溶液形式。本方案中详细讨论了这些难点以及尽量减少或规避这些问题的策略。方案中描述的几乎所有技术均为细胞培养中的常规且标准的操作。本方案的优势在于其全面关注凋亡细胞通过多种机制调控响应细胞内信号转导的过程，这些机制包括通过表面决定簇或桥联分子与响应细胞上的特异性受体结合、释放可溶性介质，和/或激活吞噬机制。所有实验均包含坏死细胞对照，以确保观察到的结果特异性地由细胞死亡方式引起，而非对死亡细胞的普遍性反应。如本方案所建议的严谨方法，对于我们理解凋亡细胞在健康与疾病状态下对邻近活细胞日益广泛的影响至关重要。

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方案

1. 准备工作

注意：在本方案中，两种或两种以上的细胞系或原代细胞培养物需在特定条件下独立制备。这些制备包括凋亡细胞（方案1）、坏死细胞（方案2）以及健康的应答细胞（方案3）。在独立制备后，将凋亡或坏死细胞加入应答细胞中，并监测由此产生的信号转导（方案4、5和6）。

  1. 准备培养基和试剂
    1. 配制500 mL培养基A（用于允许条件下培养细胞，见第1.2节）：将以下成分混合，制备含4.5 g/L葡萄糖、584 mg/L L-谷氨酰胺、110 mg/L丙酮酸钠的1倍浓度DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基），添加终浓度为100单位/mL的青霉素-链霉素、10%（v/v）胎牛血清（FBS）以及10单位/mL的γ-干扰素（IFN-γ）。
    2. 配制500 mL培养基B（用于非许可条件下血清饥饿处理细胞，见第1.2节），在培养基A的配方中省略FBS和IFN-γ。在非许可条件下培养细胞（血清饥饿前），向培养基B中加入10%（v/v）FBS。
    3. 将4%储备液的多聚甲醛用1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释，配制0.4%（v/v）、pH 7.2的多聚甲醛溶液，用于固定死细胞。
      注意：多聚甲醛具有毒性，使用时应采取适当的预防措施。
  2. 培养 BU.MPT 细胞
    1. 从液氮中取出一管BU.MPT细胞进行解冻。
      注意：BU.MPT 是一种小鼠肾近端小管上皮细胞（PTEC）系，源自携带温度敏感性（ts）突变（tsA58）的转基因小鼠，该突变位于SV40大肿瘤抗原（TAg）基因，受小鼠主要组织相容性复合体（MHC）H-2K启动子调控。b I类启动子25,26.
    2. 将细胞接种于无菌的聚苯乙烯真空-气体等离子体处理的组织培养皿中（约 5 x 106 每100 mm直径培养皿中的细胞数。
    3. 在加湿的5%（v/v）CO₂、允许性条件下培养细胞2 大气
      注意：容许性条件定义为在存在 IFN-γ 的情况下于 33–37 °C 培养，可实现 tsA58 突变型 TAg 转基因的稳定表达。与小鼠肾脏近端肾小管上皮细胞的原代培养物不同（后者通常无法存活超过一至两次传代），在容许性条件下培养的 BU.MPT 细胞可无限传代。
      1. 复苏后，实验使用前至少传代培养三次。
        1. 传代细胞时，每100 mm培养皿加入1 mL 0.05%胰蛋白酶，于含5%（v/v）CO₂的湿润培养箱中孵育2 在37 ºC条件下孵育5分钟。加入10 mL培养基A以中和胰蛋白酶。吸出脱落的细胞，按1:3至1:5比例传代至新的100 mm无菌聚苯乙烯真空-气体等离子体处理的组织培养皿中。加入培养基A，使每100 mm培养皿的总体积达到10 mL。
    4. 为用作反应细胞进行实验前准备，将细胞在含5%（v/v）CO₂的湿润环境中培养至汇合2 非许可条件下的大气环境（即 在39 ºC、无IFN-γ的条件下（含10% v/v FBS的B培养基）。
      注意：在非许可条件下，tsA58突变型TAg转基因的表达受到抑制 >95%，且BU.MPT细胞的行为类似于小鼠肾脏近端肾小管上皮细胞的原代培养。

2. 凋亡 BU.MPT 细胞的制备（方案 1）

注意：本方案专门针对以 BU.MPT 细胞作为凋亡细胞来源，并以星形孢菌素作为诱导细胞凋亡的方法。 alternatively，也可选用其他细胞系或原代细胞培养物作为凋亡细胞来源，通过针对特定细胞类型和凋亡诱导方法的标准化方案来诱导细胞凋亡。

  1. 接种于100 mm直径无菌聚苯乙烯真空-气体等离子处理的组织培养皿后，在湿度为5%（v/v）CO₂的湿润环境中培养BU.MPT细胞至汇合2 在允许条件下进行的大气环境（即 在37 ºC、培养基A中，每100 mm培养皿加入10 mL，具体操作如第1.2.3节所述。
  2. 用10 mL培养基B将贴壁细胞单层冲洗三次。
  3. 通过在含1 µg/mL星形孢菌素（staurosporine，一种非特异性蛋白激酶抑制剂）的培养基B中，于湿润、5% (v/v) CO₂条件下孵育细胞3 h，以诱导细胞凋亡。2 37 ºC 恒温环境
  4. 吸除含有星形孢菌素的培养基 "漂浮" 已从单层中脱落的凋亡细胞。将此培养基在500 × g下离心10分钟，弃去上清液，用培养基B将沉淀洗涤三次，并将沉淀加入下一步（2.5）收集的细胞中。
  5. 通过加入含有5 mM EDTA（乙二胺四乙酸）的1x Ca，使步骤2.3和2.4中剩余的贴壁细胞脱落。2+- 和 Mg2+每皿加入1 mL无钙镁DPBS，孵育5分钟。吸除含有脱落凋亡细胞的EDTA溶液，并将脱落细胞与后续收集的细胞合并 "漂浮" 来自步骤 2.4 的凋亡细胞置于无菌的 15 mL 聚苯乙烯离心管中。
  6. 将凋亡细胞以500 × g离心10分钟，并用10 mL 1× Ca缓冲液重悬，洗涤三次+2- 和 Mg+2每次洗涤使用无菌 DPBS。
  7. 最后一次洗涤后，将凋亡细胞重悬于新鲜培养基B中，浓度约为 5 x 106 使用前将细胞调整至每毫升一定数量以刺激应答细胞。或者，将洗涤后的凋亡细胞在1×DPBS中用0.4%（v/v）多聚甲醛固定30分钟，然后用培养基B洗涤三次，再重悬于培养基B中。
  8. 必要时，使用另行制备的凋亡细胞（或预留部分细胞用于此目的）通过流式细胞术检测凋亡诱导情况，具体操作如前所述。6,9,10,15.
    注意：早期凋亡细胞的细胞膜保持完整，表现为碘化丙啶（PI）阴性、annexin V阳性，且细胞体积减小（相对于活细胞）。晚期凋亡细胞的细胞膜不完整，表现为PI阳性、annexin V阳性，且细胞体积减小。采用本实验方案，典型的细胞样本中约含85%的早期凋亡细胞和约15%的晚期凋亡细胞。
  9. 将凋亡细胞以1:1的凋亡细胞与应答细胞比例加入BU.MPT应答细胞（方案3）中，可直接加入，或先用含0.4% (v/v) 甲醛的1×DPBS固定凋亡细胞30分钟后再加入。
    注意：在刺激应答细胞之前对凋亡细胞进行固定通常不会影响实验结果，除非所观察到的信号事件是由可溶性介质的释放所引起的表1).

3. 坏死性 BU.MPT 细胞的制备（方案 2）

注意：本方案专门针对以 BU.MPT 细胞作为坏死细胞来源，并以加热作为诱导坏死的方法。也可选用其他细胞系或原代细胞培养物作为坏死细胞来源，采用针对特定细胞类型及坏死诱导方法的标准化方案来诱导坏死。

  1. 接种于100 mm直径无菌聚苯乙烯真空-气体等离子处理的组织培养皿后，在湿度恒定、含5%（v/v）CO₂的培养箱中培养BU.MPT细胞至汇合2 许可条件下大气环境（即 在37 ºC、每皿10 mL培养基A中培养，具体操作见第1.2.3节。
  2. 用10 mL培养基B冲洗贴壁细胞单层3次。
  3. 通过加入含有5 mM EDTA的1x Ca+2- 和 Mg+2加入1 mL无菌DPBS，每皿孵育5分钟。吸除含EDTA的培养基及悬浮细胞，将细胞悬液转移至无菌的15 mL聚苯乙烯离心管中。
  4. 通过离心（500 × g，10 分钟）用 10 mL Ca 洗涤细胞三次，并重新悬浮+2- 和 Mg+2每次洗涤使用无钙镁 DPBS。
  5. 最后一次洗涤后，将细胞重悬于新鲜的培养基B中，浓度约为 5 x 106 每毫升细胞数
  6. 通过将细胞置于70 ºC水浴中加热45分钟诱导坏死，每10分钟轻轻涡旋混匀细胞悬液一次。
  7. 在湿润的5%（v/v）CO₂环境中孵育细胞2 h2 37 °C 气氛中孵育。每 15 分钟轻轻涡旋混匀细胞悬液一次。
  8. 必要时，可使用另一份坏死细胞样品（或预留部分细胞用于此目的）通过流式细胞术确认坏死的诱导，具体方法如前所述。6,9,10,15.
    注意：坏死细胞的细胞膜破裂，表现为PI染色阳性且细胞体积增大（相对于活细胞）。采用本方案时，典型的制备样本中坏死细胞比例通常≥95%。 alternatively，也可通过台盼蓝染色确认坏死的诱导及细胞膜完整性的丧失。

4. BU.MPT 效应细胞的制备（方案 3）

注意：本方案专门针对以 BU.MPT 细胞作为反应细胞的来源。也可选用其他细胞系或原代细胞培养物作为反应细胞。在实验使用前，可通过实验室内的标准化方案诱导细胞进入静息状态，通常需过夜处理。

  1. 在无菌的100 mm组织培养皿中，将BU.MPT细胞置于培养基A中，每皿10 mL，在允许性条件下培养，直至细胞融合度达到约85%。
  2. 吸弃培养基A，用10 mL培养基B洗涤细胞3次。在湿润、5%（v/v）CO₂条件下，用无血清培养基饥饿处理细胞过夜，时间为18至24小时。2 非许可条件下的大气环境（即 在39 ºC下，将细胞置于每皿10 mL的培养基B中培养，以诱导细胞进入静息状态，具体操作见第1.2.4节。或者，在39 ºC下，先将细胞在含10%（v/v）FBS的培养基B中培养一天，随后在不含FBS的培养基B中饥饿培养过夜。
  3. 为每种实验条件分别标记一个含有融合细胞的 BU.MPT 细胞培养皿。
  4. 包括以下六种条件：将存活的 BU.MPT 应答细胞暴露于无细胞、凋亡细胞或坏死细胞中 30 分钟后，再用溶剂或表皮生长因子（EGF）刺激 15 分钟。
    注意：暴露于死细胞可能刺激或抑制特定信号分子的活性水平。刺激效应在低基线水平之上最易被检测到例如，无 EGF），而抑制效应最好从高基线水平检测例如，EGF 的存在。由于死细胞刺激的作用是 先验的 未知情况下，建议在无表皮生长因子（EGF）和有表皮生长因子（EGF）的条件下均开展所有研究。

5. 使用凋亡细胞和坏死细胞刺激应答细胞（方案4）

  1. 吸除预标记培养皿中的静止期（血清饥饿）BU.MPT 反应细胞的培养基 B（方案 3）。
    注意：在非许可条件下过夜培养后，BU.MPT 细胞应表现出类似于原代小鼠肾近端肾小管上皮细胞（PTEC）的特性。
  2. 每 100 mm 培养皿中加入 2 mL 以下其中一种液体：培养基 B（无细胞）；在培养基 B 中浓度约为 5 × 106 个细胞/mL 的凋亡细胞悬液（方案 1）；或在培养基 B 中浓度约为 5 × 106 个细胞/mL 的坏死细胞悬液（方案 2）。
    1. 将 2 mL 死细胞悬液均匀地加入 100 mm 培养皿中，并尽量缩短其沉降时间。为实现均匀分布，使用宽口移液枪头将死细胞悬液逐滴加至反应细胞培养皿的整个表面。采用 2 mL 体积是在尽量减少沉降时间与避免死细胞聚集之间的一种折中选择。
      注意：使用死细胞悬液作为刺激物涉及若干特殊考虑因素，详见下文（表 2 及讨论部分）。
    2. 通过向一个汇合的 100 mm 培养皿（含约 10 × 106 个细胞）中加入 2 mL 浓度约为 5 × 106 个细胞/mL 的死细胞悬液，使死细胞与反应细胞的比例达到约 1:1。或者，为确定所观察到的信号事件的剂量依赖性，可通过在培养基 B 中逐步稀释方案 1 和方案 2 制备的死细胞悬液，连续改变死细胞与反应细胞的比例。
  3. 轻轻晃动培养皿，然后在 37 ºC、加湿、5%（v/v）CO2 的环境中孵育。
  4. 孵育 30 分钟后，根据培养皿的预标记，用溶剂对照或 50 nM EGF 刺激反应细胞。
  5. 在 37 °C、加湿、5%（v/v）CO2 的环境中继续孵育 15 分钟。
  6. 加入 5 mL 冰冷的 1× DPBS，轻轻晃动培养皿，然后吸除洗涤液，以洗去死细胞。重复此步骤三次。
  7. 立即将反应细胞培养皿置于冰上，用于后续处理。
  8. 制备细胞裂解液
    1. 配制含有以下成分的细胞裂解缓冲液：1× Tris 缓冲盐水（TBS）、10 mM 焦磷酸钠、0.5% w/v 脱氧胆酸钠、0.1% w/v SDS、10% 甘油和 25 mM 氟化钠。
      1. 在细胞裂解前立即按以下顺序和指定浓度依次加入：mini EDTA-free 蛋白酶抑制剂混合物（每 10 mL 裂解缓冲液加 1 片）、10%（v/v）Triton X-100、1 mM 二硫苏糖醇（DTT）、1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）和 10 mM 原钒酸钠。
    2. 向步骤 5.7 中冰上保存的新鲜刺激反应细胞的每 100 mm 培养皿中加入 700 µL 冰冷的细胞裂解缓冲液。用细胞刮刀刮取细胞，并将裂解液转移至预冷的 1.5 mL 微量离心管中。将管子置于冰上保持 15 分钟。
    3. 在冰上对裂解液进行超声处理，共 10 次脉冲，每次持续时间小于 1 秒，频率为 20 Hz。避免在气液界面产生泡沫，以免样品过热。开启超声仪前应将探头完全浸入含裂解液的微量离心管中，关闭超声仪后再将探头从裂解液中取出。
    4. 在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 10 分钟，将上清液转移至新的预冷微量离心管中，并于 -70 ºC 保存。
    5. 对裂解液的上清液进行凝胶电泳和免疫印迹分析，方法如先前所述6,9,10,15。

6. 使用半透性聚碳酸酯膜防止靶细胞与反应细胞直接接触（方案5）

  1. 按照方案3准备BU.MPT反应细胞，但有一个例外：将细胞培养在无菌的聚苯乙烯组织培养处理过的12孔板中。
  2. 在选定的孔中放置含有0.4 µm聚碳酸酯膜的可渗透支持系统，以防止死亡细胞与反应细胞之间的直接物理接触。同一实验中需包含未加膜的对照孔。
  3. 吸除血清饥饿处理的BU.MPT反应细胞实验孔中的培养基B。
  4. 按照方案4用凋亡或坏死细胞刺激反应细胞，但进行以下修改：
    1. 每12孔板的每个孔中加入0.1 mL以下其中一种液体：培养基B（无细胞）；在培养基B中浓度约为5 × 106 个细胞/mL的凋亡细胞悬液（方案1）；或在培养基B中浓度约为5 × 106 个细胞/mL的坏死细胞悬液（方案2）。
      注意：由于12孔板中一个汇合孔约含有0.5 × 106 个细胞，因此每孔加入0.1 mL浓度约为 5 × 106 个细胞/mL的死亡细胞，可获得约1:1的死亡细胞与反应细胞比例。
    2. 对于含有可渗透支持系统的孔，将死亡细胞加至该系统内0.4 µm聚碳酸酯膜的上方，以确保死亡细胞与反应细胞之间无直接物理接触。

7. 使用细胞松弛素 D 抑制吞噬作用（方案 6）

  1. 根据方案3准备BU.MPT反应细胞。
  2. 将细胞骨架抑制剂细胞松弛素D溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成4 mg/mL的储存液（1,000×）。向预先标记的BU.MPT反应细胞培养皿中，分别加入10 μL溶剂（DMSO）或10 μL细胞松弛素D，使终浓度在10 mL培养基B中达到4 μg/mL。
    注意：在此浓度下，细胞松弛素D对BU.MPT细胞及巨噬细胞系的吞噬作用抑制率≥90%9,10。
  3. 在37 ºC、含5%（v/v）CO2的湿化培养箱中孵育2小时。
  4. 按照方案4，用凋亡或坏死细胞刺激反应细胞。
  5. 根据需要，使用另外制备的死亡细胞与反应细胞（或预留用于此目的的细胞），通过流式细胞术确认死亡细胞吞噬作用的抑制效果，方法如前所述9,10。

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结果

在图1中，我们提供了一个示意图，描述了制备凋亡细胞（方案1）和坏死细胞（方案2）的时间安排及关键步骤，以及用凋亡细胞和坏死细胞悬液刺激应答细胞的过程（方案4）。

在图2中，我们展示了凋亡细胞对丝氨酸-苏氨酸激酶糖原合酶激酶-3（GSK-3）两种同工型GSK-3α和GSK-3β磷酸化影响的代表性结果。GSK-3α/β在调控细胞增殖与存活中具有重要作用，同时也参与葡萄糖代谢。GSK-3α在丝氨酸-21位点以及GSK-3β在丝氨酸-9位点的磷酸化会抑制激酶活性，从而导致β-catenin的磷酸化水平降低并增加其稳定性。随后，β-catenin转移至细胞核内，促进一系列已知可刺激细胞增殖并抑制凋亡的基因转录。因此，GSK-3α/β磷酸化水平升高与细胞增殖和存活能力增强相关，而GSK-3α/β磷酸化水平降低则与增殖和存活能力下降相关联。

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讨论

本文提供了一种用于表征活细胞在暴露于发生凋亡或其他形式细胞死亡的细胞后所诱导的细胞内信号事件的实验方案。该方案重点阐述了凋亡细胞通过多种机制调节活体应答细胞内信号通路的过程，这些机制包括：死亡细胞或其脱落的囊泡和微囊泡（常称为凋亡小体）通过桥接分子或表面决定簇与应答细胞上的特异性受体相互作用；可溶性介质的释放（甚至其在细胞外的生成27）；以及吞噬机制的参与。在发生显著吞噬作用的情况下，还需考虑另一种机制，即凋亡细胞或其囊泡中富集的介质（如微小RNA）被递送至应答细胞21。与其它方法相比，本方案的意义在于能够精细区分凋亡细胞调节应答细胞内信号转导的多种机制。其主要优势在于，所需技术大多为常规且标准的细胞培养技术。

尽管本实验方案以永生化的小鼠肾近端肾小管上皮细胞系BU.MPT作为死亡细胞和反应细胞的来源，但该方案可直接并简便地适用于其他细胞系或原代细胞培养。此外，正如我们先前发表的研究中所述，死亡细胞与反应细胞的来源不一定必须相同9,10,19。虽然本文描述了使用星形孢菌素和加热分别作为诱导细胞凋亡和坏死的方法，但细胞...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

这项工作部分或全部得到了伊利诺伊大学芝加哥分校肾病科 José A. Arruda 博士提供的机构资金（资助 J. S. L.）；以及麦吉尔大学医学院和麦吉尔大学健康中心研究所的资助（资助 J. R.）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>细胞培养材料
DMEM，1×，含[4.5 g/L]葡萄糖 ʟ-glutamine && 焦磷酸钠Mediatech（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）10-013-CV
HyClone Fetal Clone II，胎牛血清GE Healthcare（美国洛根）SH30066.03加入10%（v/v）  加入培养基A
青霉素-链霉素-谷氨酰胺，100倍浓缩液Life Technologies（美国纽约州格兰岛）10378-016向培养基 A 和 B 中各加入 100 单位/毫升
γ- 干扰素，小鼠重组，来源 大肠杆菌Calbiochem，Millipore（美国马萨诸塞州比勒里卡）407303向培养基A中加入10单位/毫升
Falcon 聚苯乙烯组织培养处理培养皿，无热原康宁公司（美国北卡罗来纳州德罕市）353003无菌，100 mm 直径
Falcon 聚苯乙烯离心管，锥形底康宁公司（美国北卡罗来纳州德罕市）352095无菌，15 mL
0.05% 胰蛋白酶-EDTA，GibcoFisher（Waltham，MA）25300062无菌，100 mL
<强>名称<强>公司<强>目录<强>评论
<强>化学品与抑制剂
Staurosporine，来自 链霉菌属 sp.Sigma（美国密苏里州圣路易斯）S4400使用于 [1 μg/mL] 处理 3 小时以诱导细胞凋亡
表皮生长因子（EGF），[1 mg/mL]默克密理博（美国马萨诸塞州比勒里卡）EA140以50 nM浓度刺激应答细胞
UltraPure，0.5 M EDTA，pH 8.0Life Technologies（美国纽约州格兰岛）15575-038使用 5 mM 的溶液解离贴壁细胞
0.4% 台盼蓝溶液MP Biomedicals（美国加利福尼亚州圣安娜）91691049用于死细胞染色
4% 多聚甲醛溶液，溶于 DPBSAffymetrix（美国加利福尼亚州圣克拉拉）19943使用0.4% (v/v) 的1x DPBS进行细胞固定
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），1×，GibcoLife Technologies（美国纽约州格兰岛）14040133储备液
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），含钙离子2+- 和 Mg2+无血清，1倍，GibcoLife Technologies（美国纽约州格兰岛）14190367储备液
细胞松弛素D，4 mM，溶于二甲基亚砜（DMSO），来源 Zygosporium mansoniiSigma（美国密苏里州圣路易斯）C8273使用于[4 μg/mL] 以抑制吞噬作用
二甲基亚砜（DMSO）Sigma（美国密苏里州圣路易斯）D2650细胞松弛素D的溶剂
[页眉]
<强>细胞裂解缓冲液成分
Tris缓冲盐溶液（TBS），10倍浓度，pH 7.4BioRad（美国加利福尼亚州赫克力士）1706435用于细胞裂解缓冲液
焦磷酸钠Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）221368细胞裂解缓冲液中 10 mM
脱氧胆酸钠Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）D67500.5% w/v 的细胞裂解缓冲液
十二烷基硫酸钠（SDS）Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）L3771 0.1% w/v 的细胞裂解缓冲液
甘油Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）G5516细胞裂解缓冲液的10%
氟化钠Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）450022细胞裂解缓冲液中25 mM
完全型无EDTA蛋白酶抑制剂混合片剂罗氏诊断（美国印第安纳波利斯，IN）4693159001每 10 mL 裂解缓冲液使用 1 片裂解缓冲液片剂
Triton X-100Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）T8787细胞裂解缓冲液，10%
二硫苏糖醇（DTT）MP Biomedicals（美国加利福尼亚州圣安娜）11DTT000051 mM 细胞裂解缓冲液
苯甲基磺酰氟（PMSF）MP Biomedicals（美国加利福尼亚州圣安娜）4800263细胞裂解缓冲液中 1 mM
原钒酸钠MP Biomedicals（美国加利福尼亚州圣安娜）2159664细胞裂解缓冲液中 10 mM
<强>名称<强>公司<强>目录<强>评论
<强>仪器设备
Sorvall T6000B 离心机杜邦（美国特拉华州威尔明顿）T6000B
Fisher Tissuemat，水浴Fisher（Waltham，MA）
Sonic Dismembrator（超声破碎仪），型号 100Fisher（Waltham，MA）
<强>其他
细胞计数板，NeubauerHawksley（英国西萨塞克斯郡兰塞）AC2000
Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒 II默克密理博（Billerica，MA）CBA059用于PI和Annexin V染色以确定细胞凋亡阶段
Eppendorf 微量离心管，1.5 mLSigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）T9661
Transwell 可渗透支持膜，0.4 μm 聚碳酸酯膜康宁公司（美国纽约州康宁市）3413无菌、聚苯乙烯、组织培养处理
<强>名称<强>公司<强>目录<强>评论
<强>抗体
磷酸化糖原合成酶激酶-3α/β (GSK-3α/β)（Ser21/9），多克隆抗体细胞信号技术公司9331兔多克隆抗体
甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体（14C10）细胞信号技术公司2118兔单克隆抗体

参考文献

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通过与正在经历凋亡性细胞死亡的邻近细胞相互作用，在活细胞中诱导的细胞内信号事件的鉴定
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