本文介绍了一种用于检测活细胞与邻近死亡或濒死细胞发生物理相互作用后所诱导的细胞内信号转导事件的实验方案。该方案侧重于由受体介导的对死亡细胞识别所引发的信号事件，而非对死亡细胞的吞噬摄取或可溶性介质的释放。
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方法文章
通过与正在经历凋亡性细胞死亡的邻近细胞相互作用，在活细胞中诱导的细胞内信号事件的鉴定
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
通过凋亡死亡的细胞，也被称为程序性细胞死亡，会获得多种新功能，使其能够影响邻近活细胞的功能。生存、增殖、生长和分化等重要生物学活动，均属于凋亡细胞所调控的众多细胞功能之列。识别并响应凋亡细胞的能力似乎是所有细胞共有的普遍特征，无论其谱系或来源器官如何。然而，细胞对凋亡细胞的反应具有高度多样性和复杂性，因此在解析导致特定生物学效应的信号事件和通路时必须格外谨慎。尤其需要区分凋亡细胞影响活细胞内信号通路的多种机制，包括：对凋亡细胞的受体介导识别、凋亡细胞释放可溶性介质，以及/或者吞噬机制的激活。本文提供了一种用于鉴定活细胞在接触凋亡细胞后所诱导的细胞内信号事件的实验方案。该方案的主要优势在于其对凋亡细胞调控应答细胞内信号事件机制的细致解析。尽管本方案针对一种条件性永生化的小鼠肾近端小管上皮细胞系（BU.MPT细胞），但其可轻松适用于非上皮来源和/或来源于肾脏以外器官的其他细胞系。使用死亡细胞作为刺激物会引入若干独特因素，可能干扰细胞内信号事件的检测。本方案中讨论了这些问题以及最小化或规避这些问题的策略。应用此方案将有助于进一步拓展我们对死亡或濒死细胞在健康和疾病状态下对邻近活细胞广泛影响的认识。
引言
细胞凋亡，或称程序性细胞死亡1，对组织的维持和发育具有至关重要的作用。最简单的理解是，细胞凋亡能够清除衰老、受损或多余的细胞，同时不对周围组织造成损害2,3。然而，细胞凋亡在组织稳态中的作用远比这更为动态和多样。发生凋亡的细胞会获得多种新的功能，包括分泌性因子和细胞相关活性，从而影响邻近活细胞的功能4-10。早期研究主要关注凋亡细胞抑制炎症反应的能力11-16，但现已发现凋亡细胞还能调节广泛的细胞功能，包括存活4,9,10、增殖4,9,10、分化17、迁移18和生长19等关键生物学过程。此外，这些效应不仅限于巨噬细胞等专职吞噬细胞，而是几乎存在于所有细胞类型和谱系中，包括传统上被认为不具备吞噬能力的上皮细胞和内皮细胞7,9,10,18-21。
凋亡细胞暴露后邻近活细胞的特异性反应取决于多种因素，这些因素与存活的反应细胞以及凋亡细胞本身均相关。例如，尽管暴露于凋亡细胞会抑制小鼠巨噬细胞和肾近端小管上皮细胞（PTECs）的增殖，但这两类细胞在对凋亡细胞的存活反应上表现出显著差异4,6,9,10凋亡细胞可促进巨噬细胞的存活，但会诱导近端肾小管上皮细胞（PTECs）发生凋亡性死亡4,6,9,10值得注意的是，即使在同一谱系的....
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方案
1. 准备工作
注意：在本方案中，两种或两种以上的细胞系或原代细胞培养物需在特定条件下独立制备。这些制备包括凋亡细胞（方案1）、坏死细胞（方案2）以及健康的应答细胞（方案3）。在独立制备后，将凋亡或坏死细胞加入应答细胞中，并监测由此产生的信号转导（方案4、5和6）。
- 准备培养基和试剂
- 配制500 mL培养基A（用于允许条件下培养细胞，见第1.2节）：将以下成分混合，制备含4.5 g/L葡萄糖、584 mg/L L-谷氨酰胺、110 mg/L丙酮酸钠的1倍浓度DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基），添加终浓度为100单位/mL的青霉素-链霉素、10%（v/v）胎牛血清（FBS）以及10单位/mL的γ-干扰素（IFN-γ）。
- 配制500 mL培养基B（用于非许可条件下血清饥饿处理细胞，见第1.2节），在培养基A的配方中省略FBS和IFN-γ。在非许可条件下培养细胞（血清饥饿前），向培养基B中加入10%（v/v）FBS。
- 将4%储备液的多聚甲醛用1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释，配制0.4%（v/v）、pH 7.2的多聚甲醛溶液，用于固定死细胞。
注意：多聚甲醛具有毒性，使用时应采取适当的预防措施。
- 培养 BU.MPT 细胞
- 从液氮中取出一管BU.MPT细胞进行解冻。
注意：....
- 从液氮中取出一管BU.MPT细胞进行解冻。
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结果
在图1中，我们提供了一个示意图，展示了制备凋亡细胞（方案1）和坏死细胞（方案2）的时间安排及关键步骤，以及用凋亡细胞和坏死细胞悬液刺激应答细胞（方案4）的过程。
在图2中，我们展示了凋亡细胞对丝氨酸-苏氨酸激酶糖原合酶激酶-3（GSK-3）两种同工型GSK-3α和GSK-3β磷酸化影响的代表性结果。GSK-3α/β在调控细胞增殖与存活中具有重要作用，同时也在葡萄糖代谢中发挥重要功能。GSK-3α在丝氨酸21位点（serine-21）和GSK-3β在丝氨酸9位点（serine-9）的磷酸化会抑制激酶活性，从而导致β-catenin的磷酸化减少和稳定性增加。随后，β-catenin转移至细胞核内，促进已知可刺激细胞增殖并抑制凋亡的基因转录。因此，GSK-3α/β磷酸化水平升高与细胞增殖和存活增强相关，而GSK-3α/β磷酸化水平降低则与细胞增殖和存活减少相关联。
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讨论
本文提供了一种用于表征活细胞在暴露于发生凋亡或其他形式细胞死亡的细胞后所诱导的细胞内信号事件的实验方案。该方案重点阐述了凋亡细胞通过多种机制调节活体应答细胞内信号通路的过程，这些机制包括：死亡细胞或其脱落的囊泡和微囊泡（常称为凋亡小体）通过桥接分子或表面决定簇与应答细胞上的特异性受体相互作用；可溶性介质的释放（甚至其在细胞外的生成27）；以及吞噬机制的参与。在发生显著吞噬作用的情况下，还需考虑另一种机制，即凋亡细胞或其囊泡中富集的介质（如微小RNA）被递送至应答细胞21。与其它方法相比，本方案的意义在于能够精细区分凋亡细胞调节应答细胞内信号转导的多种机制。其主要优势在于，所需技术大多为常规且标准的细胞培养技术。
尽管本实验方案以永生化的小鼠肾近端肾小管上皮细胞系BU.MPT作为死亡细胞和反应细胞的来源，但该方案可直接并简便地适用于其他细胞系或原代细胞培养。此外，正如我们先前发表的研究中所述，死亡细胞与反应细胞的来源不一定必须相同9,10,19。虽然本文描述了使用星形孢菌素和加热分别作为诱导细胞凋亡和坏死的方法，但细胞.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
这项工作部分或全部得到了伊利诺伊大学芝加哥分校肾病科 José A. Arruda 博士提供的机构资金（资助 J. S. L.）；以及麦吉尔大学医学院和麦吉尔大学健康中心研究所的资助（资助 J. R.）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>细胞培养材料 | |||
| DMEM，1×，含[4.5 g/L]葡萄糖 ʟ-glutamine && 焦磷酸钠 | Mediatech（美国弗吉尼亚州马纳萨斯） | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II，胎牛血清 | GE Healthcare（美国洛根） | SH30066.03 | 加入10%（v/v） 加入培养基A |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺，100倍浓缩液 | Life Technologies（美国纽约州格兰岛） | 10378-016 | 向培养基 A 和 B 中各加入 100 单位/毫升 |
| γ- 干扰素，小鼠重组，来源 大肠杆菌 | Calbiochem，Millipore（美国马萨诸塞州比勒里卡） | 407303 | 向培养基A中加入10单位/毫升 |
| Falcon 聚苯乙烯组织培养处理培养皿，无热原 | 康宁公司（美国北卡罗来纳州德罕市） | 353003 | 无菌，100 mm 直径 |
| Falcon 聚苯乙烯离心管，锥形底 | 康宁公司（美国北卡罗来纳州德罕市） | 352095 | 无菌，15 mL |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，Gibco | Fisher（Waltham，MA） | 25300062 | 无菌，100 mL |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>目录 | <强>评论 |
| <强>化学品与抑制剂 | |||
| Staurosporine，来自 链霉菌属 sp. | Sigma（美国密苏里州圣路易斯） | S4400 | 使用于 [1 μg/mL] 处理 3 小时以诱导细胞凋亡 |
| 表皮生长因子（EGF），[1 mg/mL] | 默克密理博（美国马萨诸塞州比勒里卡） | EA140 | 以50 nM浓度刺激应答细胞 |
| UltraPure，0.5 M EDTA，pH 8.0 | Life Technologies（美国纽约州格兰岛） | 15575-038 | 使用 5 mM 的溶液解离贴壁细胞 |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | MP Biomedicals（美国加利福尼亚州圣安娜） | 91691049 | 用于死细胞染色 |
| 4% 多聚甲醛溶液，溶于 DPBS | Affymetrix（美国加利福尼亚州圣克拉拉） | 19943 | 使用0.4% (v/v) 的1x DPBS进行细胞固定 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），1×，Gibco | Life Technologies（美国纽约州格兰岛） | 14040133 | 储备液 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），含钙离子2+- 和 Mg2+无血清，1倍，Gibco | Life Technologies（美国纽约州格兰岛） | 14190367 | 储备液 |
| 细胞松弛素D，4 mM，溶于二甲基亚砜（DMSO），来源 Zygosporium mansonii | Sigma（美国密苏里州圣路易斯） | C8273 | 使用于[4 μg/mL] 以抑制吞噬作用 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma（美国密苏里州圣路易斯） | D2650 | 细胞松弛素D的溶剂 |
| [页眉] | |||
| <强>细胞裂解缓冲液成分 | |||
| Tris缓冲盐溶液（TBS），10倍浓度，pH 7.4 | BioRad（美国加利福尼亚州赫克力士） | 1706435 | 用于细胞裂解缓冲液 |
| 焦磷酸钠 | Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯） | 221368 | 细胞裂解缓冲液中 10 mM |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯） | D6750 | 0.5% w/v 的细胞裂解缓冲液 |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯） | L3771 | 0.1% w/v 的细胞裂解缓冲液 |
| 甘油 | Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯） | G5516 | 细胞裂解缓冲液的10% |
| 氟化钠 | Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯） | 450022 | 细胞裂解缓冲液中25 mM |
| 完全型无EDTA蛋白酶抑制剂混合片剂 | 罗氏诊断（美国印第安纳波利斯，IN） | 4693159001 | 每 10 mL 裂解缓冲液使用 1 片裂解缓冲液片剂 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯） | T8787 | 细胞裂解缓冲液，10% |
| 二硫苏糖醇（DTT） | MP Biomedicals（美国加利福尼亚州圣安娜） | 11DTT00005 | 1 mM 细胞裂解缓冲液 |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | MP Biomedicals（美国加利福尼亚州圣安娜） | 4800263 | 细胞裂解缓冲液中 1 mM |
| 原钒酸钠 | MP Biomedicals（美国加利福尼亚州圣安娜） | 2159664 | 细胞裂解缓冲液中 10 mM |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>目录 | <强>评论 |
| <强>仪器设备 | |||
| Sorvall T6000B 离心机 | 杜邦（美国特拉华州威尔明顿） | T6000B | |
| Fisher Tissuemat，水浴 | Fisher（Waltham，MA） | ||
| Sonic Dismembrator（超声破碎仪），型号 100 | Fisher（Waltham，MA） | ||
| <强>其他 | |||
| 细胞计数板，Neubauer | Hawksley（英国西萨塞克斯郡兰塞） | AC2000 | |
| Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒 II | 默克密理博（Billerica，MA） | CBA059 | 用于PI和Annexin V染色以确定细胞凋亡阶段 |
| Eppendorf 微量离心管，1.5 mL | Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯） | T9661 | |
| Transwell 可渗透支持膜，0.4 μm 聚碳酸酯膜 | 康宁公司（美国纽约州康宁市） | 3413 | 无菌、聚苯乙烯、组织培养处理 |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>目录 | <强>评论 |
| <强>抗体 | |||
| 磷酸化糖原合成酶激酶-3α/β (GSK-3α/β)（Ser21/9），多克隆抗体 | 细胞信号技术公司 | 9331 | 兔多克隆抗体 |
| 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体（14C10） | 细胞信号技术公司 | 2118 | 兔单克隆抗体 |
参考文献
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in i....
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重印与许可
