一种用于研究中性和带电溶质在关节软骨中跨膜转运的实验与有限元分析方案

摘要

我们提出了一种利用近期开发的实验与数值方法研究带电及不带电分子在关节软骨中跨膜运输的实验方案。

摘要

骨关节炎（OA）是一种致残性疾病，与关节软骨及软骨下骨的退变密切相关。关节软骨的退变会显著损害其承载负荷的功能，因为软骨会经历严重的化学降解，即 蛋白聚糖丢失和胶原纤维破坏。研究OA过程中化学损伤机制的一种有前景的方法是将软骨样本暴露于外源性溶质中，并监测分子的扩散行为。软骨损伤程度（即 关键大分子的浓度与分布状态）会影响外源性溶质在穿过关节软骨时的碰撞能量损失，从而产生与健康软骨不同的扩散特征。在本研究中，我们介绍了一种基于先前建立的实验性微计算机断层扫描（micro-CT）和有限元建模的实验方案，该方案包含多个步骤。首先利用micro-CT记录带电与非带电碘化分子的运输过程，随后应用双相-溶质和多相有限元模型，获取软骨不同区域的扩散系数和固定电荷密度。

引言

分子转运在关节软骨的稳态维持、治疗药物向关节软骨的递送以及增强对比的软骨成像中起着至关重要的作用^1,2,3。影响转运速率的因素包括软骨的整合性与完整性、溶质的电荷与尺寸，以及与软骨接触的溶液环境的渗透压和浓度^4,5,6。由于关节软骨不同区域含有不同浓度和排列方向的主要细胞外基质分子（即蛋白聚糖（PGs）和II型胶原），中性或带电溶质在各区域间的转运可能存在差异^{1,7,8,9,10,11}。更重要的是，带电溶质的转运高度依赖于细胞外基质中蛋白聚糖所携带的负性固定电荷浓度，而该浓度在关节软骨中由表层向深层逐渐增加^8,9。随着骨关节炎（OA）的进展，这些参数——特别是固定电荷密度（FCD）、胶原纤维的取向以及软骨内水分含量的变化——可能发生改变，因此研究软骨内扩散过程具有重要意义。

在本研究中，提出了一种基于先前已建立的实验与计算研究^6,8,9的实验方案，旨在利用中性与带电溶质在有限浴扩散模型中精确研究不同边界条件下的扩散行为。所提出的实验方法包括对包含软骨及有限浴的系统进行显微计算机断层扫描成像（micro-CT），并结合先进的双相-溶质及多相有限元模型进行分析。这些模型能够获取中性和带电分子在关节软骨不同区域的扩散系数以及固定电荷密度（FCD）。通过使用这些模型，可更深入理解扩散过程中中性和带电分子的行为，进而用于研究软骨与上方有限浴之间的相互作用。

方案

注意：本方案改编自近期研究论文中的实验与计算步骤^6,8,9。该方案在图1中进行了图示说明。

尸体材料经乌得勒支大学兽医学院许可后收集。

1. 样品与浴液准备

1. 使用定制钻头从马尸股骨髁钻取圆柱形骨软骨栓（直径为8.5 mm）图1喷洒冷的磷酸盐缓冲液（PBS）以防止过热及随之发生的软骨损伤。
2. 使用塑料收缩套管对骨软骨塞进行热缩处理，以最大限度减少上覆灌注液的侧向扩散。
   1. 将软骨朝上的骨软骨柱先装入塑料收缩套管内，随后用热风加热。在软骨表面放置湿润的棉片，以防止热损伤。
3. 准备带电有限浴液（例如， 650 µL，420 mM，碘克沙酸盐，分子量（MW）= 1,269 Da，电荷 = -1）和中性（650 µL，420 mM，碘克沙醇，MW = 1,550 Da）溶质分别处理。
4. 使用注射器将制备好的有限浴液加载到软骨表面，并在包裹的样品上放置软木塞，以防止在室温实验期间蒸发（图2A为了研究中性溶质的转运，将碘克沙醇溶液置于软骨表面；为了研究带负电荷溶质的转运，将碘他拉酸溶液置于软骨表面。

2. 成像与图像处理

1. 将用软木塞隔离的包裹样品放置在连接于显微CT电动载物台的定制支架上。放置样品时，确保覆盖有对比剂溶液的软骨表面朝上。
2. 使用显微CT（体素尺寸为40 × 40 × 40 µm³，扫描时间为2分钟，管电压为90 kV，管电流为180 µA）对包含软骨、软骨下骨板和有限浴液区域的视野进行多次时间点扫描，直至达到平衡状态（48小时）（图2A）。当浓度值随时间不再变化时，即达到平衡状态。
3. 基于初始图像对不同时间点的3D图像进行配准，以便使用制造商提供的软件（例如，Analyze）定位感兴趣区域（ROI）。
4. 在使用制造商软件处理之前，将重建的3D显微CT图像转换为2D标记图像文件格式（TIFF）序列。
5. 在软件中对软骨进行全局分割（ImageJ>调整>阈值），以区分软骨、软骨下骨及上方的浴液。
6. 使用前一步生成的软骨掩膜，获取不同时间点软骨的平均灰度值（ImageJ>分析>测量）。
7. 根据初始浴液浓度和软骨中对比剂的初始浓度，利用线性校准曲线将平均灰度值转换为溶质的实际浓度。已有数据支持灰度值与对比剂浓度之间存在线性关系。
8. 绘制溶质浓度随实验时间点的变化曲线。

3. 计算建模

注意：本问题中的扩散假设发生在一维（沿 z 轴方向），符合实验的边界条件。因此，几何构型可任意创建。

1. 构建基于有限浴液的软骨多区域模型：1）软骨由表层（占总软骨厚度的20%）、中层（占总软骨厚度的50%）和深层（占总软骨厚度的30%）组成¹²；2）在FEBio中建立有限浴液模型^13,14（图2B）。
2. 在FEBio中为软骨不同区域及浴液分配力学和物理属性。假设杨氏模量为10 MPa，足以抵抗上覆浴液施加的渗透压，从而保护软骨免受过度变形。
   1. 使用10^-3 mm⁴/Ns的液压渗透率和0的泊松比。在模拟中使用浴液的实际溶质扩散系数^8,9。
3. 生成网格（8节点三线性六面体单元），并在边界附近进行细化（图2B）^8,9。
4. 双相-溶质模型
   1. 在浴液中施加初始溶质浓度以及对应的等效应力。参见文献^9,15中关于等效应力的描述。
   2. 以瞬态模式运行模型，根据各软骨区域规定的扩散系数获得溶质浓度随时间变化的曲线。
5. 多相模型
   注意：通过在浴液和组织中各添加两种单价反离子，可避免浴液与组织之间的电势波动。
   1. 对于稳态模型：在软骨和上覆浴液中使用相同的等效流体压力和浓度，同时将固定电荷密度（FCD）逐步增加至目标值。
   2. 对于瞬态模型：通过保持浴液中的溶质扩散系数足够高，以形成充分搅拌的有限浴液。从浴液-空气界面将溶质注入浴液，使其达到目标浓度。
   3. 瞬态过程：移除上一步中设定的溶质浓度边界条件，并将有限浴液的扩散系数恢复为其实际值。
   4. 运行模型，基于不同软骨区域中施加的FCD和扩散系数，获得溶质浓度-时间曲线。
6. FEBio-MATLAB接口
   1. 开发MATLAB代码，以自动在FEBio中执行模拟并绘制浓度-时间曲线（FEBio-MATLAB接口）^8,9。
   2. 利用FEBio-MATLAB接口更改软骨区域中的扩散系数和FCD。在FEBio中运行模型，并提取溶质浓度-时间曲线^8,9。
   3. 将获得的溶质浓度-时间曲线与实验数据进行比较，并基于最小均方根误差（RMSE）确定各软骨区域中的一组扩散系数和FCD值^8,9。

图1： 实验装置。A) 使用定制钻头进行样本提取的流程。B) 采用显微CT成像监测扩散过程的步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：示意图。 A) 实验设计。B) 多区域计算模型，包含软骨的有限浴液、表层、中层和深层区域及其对应的网格结构。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

此处提供的代表性结果摘自以往的研究论文^6,8,9,16。

在骨关节炎中，关节软骨发生显著变化，最重要的是糖胺聚糖丢失和胶原纤维损伤 ^17,18,19这些变化可能会影响溶质在关节软骨中的扩散行为 ^20,21我们研究了两种碘化对比剂的轴向扩散。 即 碘克沙醇（电荷 = 0）和碘昔兰（电...

讨论

我们提出了一种结合有限元建模的实验方案，用于研究中性溶质和带电溶质在关节软骨中的扩散行为。根据我们近期的研究，所提出的模型能够准确描述中性溶质（双相-溶质）和带负电溶质（多相）在关节软骨不同区域的传输过程^8,9。普遍认为，在骨关节炎（OA）进展过程中，关节软骨的关键组分（如带负电的糖胺聚糖大分子和胶原纤维）逐渐丧失，导致其功能受限^21,22,23,24。利用本研究中提出的技术，有望评估关节软骨的健康状况。在OA中，中性溶质的传输可能增强，主要原因是溶质与糖胺聚糖及胶原之间的相互作用减弱。另一方面，带负电溶质的传输可提供有关蛋白聚糖固定电荷浓度的信息，从而反映OA进展的程度。

基于先前研究中有限浴概念的提出而建立的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Hexabrix	Guerbet	15HX005D	带负电荷的对比剂
Visipaque	GE healthcare	12570511	中性对比剂
PBS（磷酸盐缓冲液）	Life technologies	10010023	培养基
micro-CT	Perkin Elmer		监测扩散
冰点渗透压仪	Advanced instruments		测量溶液渗透压