离体全器官成像是一种快速确定组织内或不同处理组之间荧光标记化合物相对浓度的方法。相比之下，定量荧光组织学虽然更为耗时，但能够对标记分子的组织绝对含量进行定量分析。
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摘要
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荧光标记是一种成熟的技术，可用于在多种实验条件下观察标记分子的去向 体外 和 体内 荧光探针在确定给药大分子的生物分布方面尤为有用，因为添加小分子荧光标记通常不会影响化合物的动力学或生物分布。目前存在多种用于检测生物分布的方法，这些方法在所需工作量以及结果是否完全定量方面差异显著；但联合使用多种方法可建立一种快速而有效的生物分布分析体系。
离体全器官成像是一种可用于快速比较组织内以及多种类型组织或处理组之间荧光分子相对浓度的方法。利用专为活体动物或全器官成像设计的成像平台，可在无需进一步处理的情况下直接测定完整组织中的荧光信号，从而节省时间和人力，同时提供整体生物分布的准确图像。该方法特别适用于旨在确定化合物组织特异性或比较多种不同化合物的实验。相比之下，定量组织学分析则需要对组织进行大量后续处理，以获得标记化合物的定量数据。为了准确评估生物分布，所有目标组织均需切片、扫描，并相对于标准曲线进行分析，才能实现组织间或组间比较。定量组织学是测定组织内化合物绝对浓度的金标准。
本文介绍了如何有效结合使用这两种方法，以评估不同给药方式和化合物修饰将荧光标记分子靶向递送至中枢神经系统的能力1。
引言
荧光标记是一种易于使用且有效的确定化合物生物分布的方法，可利用许多实验室常见的多种设备。荧光染料种类丰富，价格相对低廉，并具有多种激发波长，因此可在无干扰的情况下同时使用多种标记分子。大多数荧光染料具备多种化学修饰方式，可与目标化合物上的不同反应性基团偶联，且针对大多数反应位点的偶联过程通常较为简便。此外，检测荧光标记化合物所需的设备在许多实验室中均普遍存在。荧光显微镜、成像仪和切片扫描仪可在不同实验条件下使用，使得荧光标记技术具有很高的可及性。荧光标记常用于活体成像设备（如IVIS Spectrum成像仪）以及定量组织病理学方法2,3，以确定化合物在体内（in vivo）和离体（ex vivo）的生物分布与动力学特征。
使用 离体 由于活体成像设备使用便捷，且能够快速准确地比较标记化合物在器官内的相对浓度，而无需对组织进行进一步处理，因此全器官成像的应用逐渐增多⁴。然而，尽管如此 离体 全器官成像可实现便捷的分析与比较，但无法提供组织内化合物绝对浓度的定量测量。这是由于完整器官内部存在光散射效应。 由于光散射（以及较小程度上的吸光度）会因组织大小和密度而异，全器官成像可能会低估较大或较致密器官中的组织水平。 制定绝对浓度测量的适当标准也十分困难，因为必须模拟每个个体器官的厚度和密度。另一方面，全器官成像是一种快速获取组织内药物相对分布水平的方法，非常适合比较....
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方案
注意：本方案中所有涉及动物的使用均经密西西比大学医学中心机构动物护理和使用委员会批准。
1. 动物与组织的处理
- 给药与处死
- 使用 3% 异氟烷对动物进行 5 分钟麻醉，并通过观察足趾夹捏反射消失来确认麻醉深度。在麻醉期间，向眼睛涂抹兽用眼膏以防止干燥。
- 称量动物体重，并用移液器将每公斤体重 50 mg 剂量的罗丹明标记 ELP、SynB1-ELP 或 Tat-ELP 加入一个 1.5 mL 离心管中。保留 100 µL 给药用的标记化合物，用于后续步骤中标准曲线的配制。
注意：标准品必须使用与动物给药相同批次的标记蛋白制备，以避免因荧光标记效率差异而产生误差。为了在后续荧光测量中正确去除背景荧光，必须采用与处理组动物相同的方法/试剂处死一只未处理的动物。 - 通过尾静脉或股静脉（通过腹股沟处 1 cm 切口进入）进行静脉注射，方法如前所述1。若进行腹股沟切口，为镇痛起见，应皮下注射卡洛芬（carprofen），剂量为 5 mg/kg，并在伤口夹闭前于切口部位涂抹感觉阻滞剂（sensorcaine）。若采用经鼻（IN）途径给药，将动物置于仰卧位。
- 使用 2 µL 移液器吸取 1 µL 标记化合物液滴。短暂将动物头部从麻醉面罩中移出，以便接触鼻孔。
- 将移液器尖端置于单侧鼻孔开口处，缓慢按压移液器推杆，使液滴沿鼻腔....
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结果
以下数据描述了三种化合物的递送情况：一种被称为ELP的药物递送载体，以及两种经细胞穿透肽修饰的ELP变体（SynB1-ELP和Tat-ELP）9。这三种化合物均用四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺（tetramethylrhodamine-5-maleimide）标记，并通过两种给药途径（IN和IV）进行递送。这些实验的目的是确定哪种化合物与给药途径组合能够实现最佳的中枢神经系统（CNS）穿透效果3。
图1A 显示代表性 离体 经处理动物各器官的全器官成像。热图叠加显示了组织内辐射效率的荧光水平。通过在各个组织周围绘制感兴趣区域（ROI），并将这些数值绘制于相应的标准曲线上，获得标准化的荧光值图示 图1B 生成标准化荧光值，可用于准确比较不同化合物的相对浓度。这些数据精确描述了ELP修饰对进入特定组织的影响，以及给药途径对每种化合物的影响。根据这些结果，可以明确看出，通过鼻内（IN）给药的ELP递送是到达中枢神经系统（CNS）最有效的组合方式。
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讨论
尽管 离体 整体器官成像通常较为直接，但遵循一些基本概念和技术可提高生物分布测量的准确性。短波长光在大多数组织中会发生强烈的散射和吸收，这显著影响了短波长荧光染料的应用效果。这些荧光染料在深层组织研究中的应用受限，但在观察表层组织或眼部的实验中已得到有效应用。相反，长波长光的散射和吸收程度显著降低，因而具有更强的组织穿透能力，可在较厚组织中获得更准确的结果。10. 发射光谱位于远红光和近红外（NIR）范围（激发） ∼ 600 nm）常被选用于整体动物或较大组织的成像。在使用这些长波长荧光染料的实验中，特定组织或材料的自发荧光可能成为关键影响因素。例如，啮齿类动物胆囊内的胆汁在500–600 nm波长范围内具有强烈的自发荧光。由于这会显著干扰肝脏信号的准确性，成像前通常最好先切除胆囊。或者，若需保留完整的肝脏和胆囊，则可选择激发波长位于光谱更远端的荧光染料，以降低胆汁自发荧光的干扰。此外，许多常用的啮齿类饲料含有未纯化的苜蓿，其在中波至长波光谱范围内均表现出强烈荧光。如果所选用的荧光标记物的发射波长落在该范围内，且需对消化道进行成像，则更换饲料可能是最佳选择。
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披露
GLB 是 Leflore Technologies, LLC 的所有人，该公司是一家致力于开发基于 ELP 的药物递送技术的私营企业。Leflore Technologies 未为本文的发表或文中数据的生成提供任何支持。
致谢
GLB的部分薪资由NIH资助项目R01HL121527提供支持。JWDM获得神经病学Currier研究员职位的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 马来酰亚胺衍生物荧光染料（例如，四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺，AlexaFluor 633-C5-马来酰亚胺） | Thermo Fisher | T6027, A20342 | 用于蛋白质标记的巯基反应性荧光染料 |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma | 1002243569 | 用于冲洗的 PBS 缓冲液 |
| 最佳切割温度包埋剂 | Tissue-Tek | 4585 | 用于冷冻和切片固定 |
| 设备 | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 用于离体器官整体成像 | |
| 冷冻切片机 | Thermo | 用于冷冻切片 | |
| 荧光切片扫描仪 | Perkin Elmer | 用于切片扫描 |
参考文献
- George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).
- George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification a....
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