离体全器官成像是一种快速确定组织内或不同处理组之间荧光标记化合物相对浓度的方法。相比之下，定量荧光组织学虽然更为耗时，但能够对标记分子的组织绝对含量进行定量分析。
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摘要
摘要
荧光标记是一种成熟的技术，可用于在多种实验条件下观察标记分子的去向 体外 和 体内 荧光探针在确定给药大分子的生物分布方面尤为有用，因为添加小分子荧光标记通常不会影响化合物的动力学或生物分布。目前存在多种用于检测生物分布的方法，这些方法在所需工作量以及结果是否完全定量方面差异显著；但联合使用多种方法可建立一种快速而有效的生物分布分析体系。
离体全器官成像是一种可用于快速比较组织内以及多种类型组织或处理组之间荧光分子相对浓度的方法。利用专为活体动物或全器官成像设计的成像平台，可在无需进一步处理的情况下直接测定完整组织中的荧光信号，从而节省时间和人力，同时提供整体生物分布的准确图像。该方法特别适用于旨在确定化合物组织特异性或比较多种不同化合物的实验。相比之下，定量组织学分析则需要对组织进行大量后续处理，以获得标记化合物的定量数据。为了准确评估生物分布，所有目标组织均需切片、扫描，并相对于标准曲线进行分析，才能实现组织间或组间比较。定量组织学是测定组织内化合物绝对浓度的金标准。
本文介绍了如何有效结合使用这两种方法，以评估不同给药方式和化合物修饰将荧光标记分子靶向递送至中枢神经系统的能力1。
引言
荧光标记是一种易于使用且有效的确定化合物生物分布的方法，可利用许多实验室常见的多种设备。荧光染料种类丰富，价格相对低廉，并具有多种激发波长，因此可在无干扰的情况下同时使用多种标记分子。大多数荧光染料具备多种化学修饰方式，可与目标化合物上的不同反应性基团偶联，且针对大多数反应位点的偶联过程通常较为简便。此外，检测荧光标记化合物所需的设备在许多实验室中均普遍存在。荧光显微镜、成像仪和切片扫描仪可在不同实验条件下使用，使得荧光标记技术具有很高的可及性。荧光标记常用于活体成像设备（如IVIS Spectrum成像仪）以及定量组织病理学方法2,3，以确定化合物在体内（in vivo）和离体（ex vivo）的生物分布与动力学特征。
使用 离体 由于活体成像设备使用便捷，且能够快速准确地比较标记化合物在器官内的相对浓度，而无需对组织进行进一步处理，因此全器官成像的应用逐渐增多⁴。然而，尽管如此 离体 全器官成像可实现便捷的分析与比较，但无法提供组织内化合物绝对浓度的定量测量。这是由于完整器官内部存在光散射效应。 由于光散射（以及较小程度上的吸光度）会因组织大小和密度而异，全器官成像可能会低估较大或较致密器官中的组织水平。 制定绝对浓度测量的适当标准也十分困难，因为必须模拟每个个体器官的厚度和密度。另一方面，全器官成像是一种快速获取组织内药物相对分布水平的方法，非常适合比较多种相关分子（如在药物靶向研究中）的相对生物分布。另一种策略是采用定量荧光组织学技术，该技术源自定量放射自显影方法，可用于获得测试药物在组织中的绝对浓度水平5,6与将整个动物或器官直接放入成像设备不同，定量组织学要求将每份组织分别切片、贴附于载玻片上、扫描并进行单独分析。 将测试剂的标准品制备成与器官样本相同厚度的切片。通过将所有器官和标准品切割成相同厚度，可消除因光散射或吸光度差异导致的变异，从而可将组织荧光强度拟合至标准曲线，以确定其绝对浓度。尽管该方法在操作得当的情况下具有定量性，但其劳动强度大且容易操作失误。鉴于定量组织学方法更为复杂，且相较于全器官成像，其人力成本显著更高，因此在研究荧光标记化合物的生物分布时，有必要评估两种方法各自最适用的应用场景。本实验方案详细描述了如何结合使用这两种方法，以高效比较经鼻腔（IN）和静脉（IV）途径给药的罗丹明标记弹性蛋白样多肽（ELP）——无论是否添加SynB1或Tat穿膜肽——在体内的生物分布情况。
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方案
注意：本方案中所有涉及动物的使用均经密西西比大学医学中心机构动物护理和使用委员会批准。
1. 动物与组织的处理
- 给药与处死
- 使用 3% 异氟烷对动物进行 5 分钟麻醉，并通过观察足趾夹捏反射消失来确认麻醉深度。在麻醉期间，向眼睛涂抹兽用眼膏以防止干燥。
- 称量动物体重，并用移液器将每公斤体重 50 mg 剂量的罗丹明标记 ELP、SynB1-ELP 或 Tat-ELP 加入一个 1.5 mL 离心管中。保留 100 µL 给药用的标记化合物，用于后续步骤中标准曲线的配制。
注意：标准品必须使用与动物给药相同批次的标记蛋白制备，以避免因荧光标记效率差异而产生误差。为了在后续荧光测量中正确去除背景荧光，必须采用与处理组动物相同的方法/试剂处死一只未处理的动物。 - 通过尾静脉或股静脉（通过腹股沟处 1 cm 切口进入）进行静脉注射，方法如前所述1。若进行腹股沟切口，为镇痛起见，应皮下注射卡洛芬（carprofen），剂量为 5 mg/kg，并在伤口夹闭前于切口部位涂抹感觉阻滞剂（sensorcaine）。若采用经鼻（IN）途径给药，将动物置于仰卧位。
- 使用 2 µL 移液器吸取 1 µL 标记化合物液滴。短暂将动物头部从麻醉面罩中移出，以便接触鼻孔。
- 将移液器尖端置于单侧鼻孔开口处，缓慢按压移液器推杆，使液滴沿鼻腔流入鼻腔内部。每隔 1 分钟重复一次，交替使用两侧鼻孔，直至完成全部剂量给药。
注意：经鼻给药的最大体积不应超过小鼠 10–15 µL。 - 最后一次给药后，让动物在麻醉状态下保持仰卧位 10 分钟，然后分别转移至单独的笼子中。
注意：在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得将其无人看管。 - 给药后 1 小时，按前述方法重新麻醉动物，并通过经心灌注以 PBS（210.0 mg/L KH2PO4，9,000.0 mg/L NaCl，726 mg/L Na2HPO4·7H2O）以 10 mL/min 的流速灌注总共 20 mL 进行处死。
注意：在处死时对动物进行灌注以完全清除组织中的血液，是测定标记化合物血管外浓度所必需的。灌注试剂可能导致背景荧光变化，因此应保持一致。组内处死方法应保持一致。不同的处死方法可能导致血管内残留血液量不同，从而改变组织的背景荧光水平。
- 组织采集
- 按上述方法配制 PBS，用于冲洗取出的组织。
注意：如果使用了其他缓冲液作为灌注液，则应用相同缓冲液冲洗组织。 - 通过简单解剖取出心脏、肺、胃、肝、脾和肾脏。用 PBS 短暂冲洗后，使用实验室擦拭纸轻轻吸干或吸除多余水分，然后将组织放置于成像垫上。
- 将小鼠断头，并使用骨剪或咬骨钳去除颅骨顶部。用镊子小心取出脑组织，保持嗅球完整。冲洗、干燥后，将其放置于提供的成像垫上。
- 通过快速喷射法取出脊髓7，用 10 mL 注射器抽取 PBS，并连接一根钝化的 18 号针头。
注意：18 号针头适用于多种小鼠品系的成年脊髓管。所需直径随动物体型而异。 - 将动物置于俯卧位，确保断头处脊髓管开口整齐切割且无血液残留。
- 去除脊柱周围的皮肤。使用锋利的骨剪或剪刀，在髋部前方的腰段直接切断脊柱。
- 用 PBS 短暂冲洗以观察脊髓管。将针头轻轻插入脊髓管内。
注意：针头应感觉紧密，插入过程中可能需要缓慢来回滚动。若针头感觉松动，可进行更靠前的切割或使用更大直径的针头。 - 用拇指和食指在插入针头周围对脊柱施加压力，以中等且持续的压力推动注射器推杆。脊髓将完整地从脊柱前端开口处喷出。
注意：所有主要器官的完整取出、冲洗和干燥过程可在 5–7 分钟内合理完成。这一短时间可避免在 PBS 中长时间储存，从而防止过度光照暴露以及标记蛋白从组织中渗出。
- 按上述方法配制 PBS，用于冲洗取出的组织。
2. 全器官 离体 荧光成像
- 成像参数
- 启动图像采集软件。在采集控制面板的右下角，点击“initialize”。
- 在“imaging mode”下，选中“fluorescent”复选框。在“exposure time”下，选择“AUTO”。
- 在“binning”下，选择“small”，并将F/Stop设为2。
- 选择535-nm激发滤光片和580-nm发射滤光片。
注意：具体参数将根据所使用的标记物而有所不同。 - 选择“Field of View B”，并将目标高度设为0.3 cm。
注意：具体参数将根据待成像的组织类型而有所不同。 - 当温度指示灯变为绿色（表示仪器已完成初始化）后，将组织放置在提供的黑色背景垫上，确保各组织之间完全分离。将垫子放入成像仪中，确保所有组织均位于所选区域网格内。对于较大或非均质的组织（如整个肝脏），应将其展开以减少叶之间的重叠。
注意：可将组织集中排列为一组，使单张图像容纳单个动物的所有组织或同类型组织，便于后续分析和管理。若不同组织间的荧光强度差异较大，最好单独成像或按相同组织类型分组成像，因为单一曝光时间可能无法同时适用于所有组织的荧光强度。 - 点击“Acquire”。
- 成像完成后，立即取出组织，并按照步骤4所述进行储存或冷冻，用于定量组织学分析。
3. 标准品与图像处理
- 标准品制备
- 在 PBS 中对用于动物处理的每种蛋白质进行两倍系列稀释，起始浓度为原始浓度，共进行 15 次稀释。
注意：浓度范围应尽量涵盖预期的组织浓度，根据起始浓度的不同，可能需要对原始样品进行额外稀释。 - 将每种标准品各 100 µL 加入黑色 96 孔板的每个孔中。设一个纯 PBS 孔，用于测定背景荧光。
- 使用与组织成像相同的参数对标准品进行成像。
- 在图像采集软件的“工具面板”中，于“ROI 工具”下选择“感兴趣区域（ROI）”圆形工具，围绕一个孔绘制 ROI。将该 ROI 复制到所有其他已加样孔中，然后点击“测量 ROI”。
- 从其他各标准品的平均辐射效率值中减去纯 PBS 孔的值，以消除背景荧光。将校正后的值与已知浓度绘制散点图。
注意：所得线性趋势线的方程可用于计算相对荧光值。
- 在 PBS 中对用于动物处理的每种蛋白质进行两倍系列稀释，起始浓度为原始浓度，共进行 15 次稀释。
- 图像处理
- 在图像采集软件中，选择自由形状 ROI 工具，围绕每种单独的组织绘制 ROI，然后点击“测量”。
- 利用所得的平均辐射效率测量值，减去未处理动物中相应组织类型的测量值，并将这些差值代入先前建立的标准曲线中进行计算。
注意：所得的相对荧光值可快速、准确地反映标记化合物在体内的生物分布情况。
4. 定量组织学
- 切片用组织的制备与冷冻
- 制作或购买尺寸足够用于冷冻所选组织及适配冰冻切片机的容器。使用铝箔包裹适当大小和形状的物体即可获得合适的容器。
- 通过在500 mL烧杯中加入半杯干冰，并加入约350 mL异丙醇，配制异丙醇与干冰混合物，使干冰上方有足够的液体，以便部分浸没冷冻容器。
注意：液氮常导致最佳切割温度包埋剂（OCT）及包埋组织发生断裂，应避免使用。 - 向冷冻容器中部分填充OCT，确保无气泡产生。若存在气泡，可用镊子或类似工具将气泡从溶液中去除。
- 将组织从PBS中取出，并用实验纸巾轻轻拍干，或通过将精细组织的边缘接触实验纸巾，使液体被吸走，从而彻底干燥。
- 将组织轻柔地放入冷冻容器内的OCT中，注意避免在组织下方引入气泡。组织就位后，继续添加OCT直至完全覆盖组织。
- 尽可能将冷冻容器浸入异丙醇-干冰混合物中，但避免异丙醇接触容器内暴露的OCT。让OCT和组织完全冷冻30–90秒（较大组织可能需要更长时间），然后于-80 °C长期保存。
- 切片用标准品的制备
- 准备1 mL一次性注射器并做好适当标记，移除注射器筒末端，使整个注射器长度保持单一内径，以便后续推出冷冻后的圆柱状样品。
- 使用OCT对所施用的化合物进行15步两倍系列稀释（如同先前在PBS中操作），最终体积为1 mL。另设一个纯OCT样品，用于扣除背景荧光值。
- OCT的黏稠性使得充分混匀较为困难。需反复倒置管子，待OCT完全沉降后再倒置，重复10–20次以确保混合均匀。混匀过程中将标准溶液置于4 °C并避光保存。
- 混匀后，再次按前述方法配制异丙醇与干冰混合物。
注意：也可使用液氮替代异丙醇/干冰混合物，但需在注射器完全冻结后立即取出。 - 将OCT标准品吸入注射器，尽量避免引入气泡。吸样后立即垂直插入异丙醇中，使溶液在注射器内完全冻结10–20秒。必要时可长期保存于-80 °C。
- 组织与标准品的切片
- 将组织和标准品置于-20 °C环境中，使其充分达到平衡温度。
注意：大多数组织的理想切片温度约为-10 °C，但具体温度取决于组织大小和脂肪含量，需通过实验经验优化。 - 使用冰冻切片机将组织切成20 µm厚的切片，并按先前所述方法贴附于载玻片上8。切片过程中及扫描前应尽可能避光，并将载玻片保存于-20 °C。
注意：待测切片应均匀分布于组织全层厚度中，这一点至关重要。 - 将标准品安装至冰冻切片机持样器时，从冰箱取出注射器，用手握住使其外壁升温3–5秒，推动活塞，使一小段（约1 cm）OCT圆柱体露出注射器。
- 使用剃刀片垂直切割圆柱体，并将所得圆柱片段用OCT固定于持样器上，呈垂直方向。此构型可确保切出清晰的圆形切片。
- 以20 µm厚度切取圆柱体，将每个稀释梯度的一个切片置于同一张载玻片上，使单张载玻片包含完整的标准曲线。切片完成后保存于-20 °C，待扫描时使用。
- 将组织和标准品置于-20 °C环境中，使其充分达到平衡温度。
- 扫描与定量分析
- 启动扫描阵列软件，点击“543激光”开始激光预热程序，等待15分钟直至激光准备就绪。
- 激光就绪后，从-20 °C取出载玻片，转移至大型避光容器中，使其升至室温并干燥3分钟，以防止切片扫描仪内产生冷凝水。
- 将载玻片装入扫描仪的载片槽中，点击“scan”，选择“run easy scan”。
- 将扫描分辨率为设为50 µm。
- 在“Fluorophore”下方选择第一个“Use”复选框，并选择“TRITC”，将PMT增益设为80%。
注意：这些参数设置将根据所用荧光染料及标记分子浓度的不同而有所调整。 - 在左侧确保扫描区域覆盖整张载玻片，点击“Start”开始扫描。
- 扫描完成后，选择“file”和“save as”，将图像保存为.tif格式。
注意：组织与标准品的载玻片应在相同设置下进行扫描。 - 将所得图像导入ImageJ，围绕组织和标准品选择感兴趣区域（ROI）。在“analyze”选项卡中选择“set measurements”，勾选“mean grey value”，点击“measure”。
注意：与前述方法相同，所有测量值均需扣除背景荧光。 - 以标准品的平均灰度值对其已知浓度作图，建立标准曲线。
注意：组织的测量结果应在每个组织内部取平均值，并在该标准曲线上进行定位，以确定组织内的浓度。
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结果
以下数据描述了三种化合物的递送情况：一种被称为ELP的药物递送载体，以及两种经细胞穿透肽修饰的ELP变体（SynB1-ELP和Tat-ELP）9。这三种化合物均用四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺（tetramethylrhodamine-5-maleimide）标记，并通过两种给药途径（IN和IV）进行递送。这些实验的目的是确定哪种化合物与给药途径组合能够实现最佳的中枢神经系统（CNS）穿透效果3。
图1A 显示代表性 离体 经处理动物各器官的全器官成像。热图叠加显示了组织内辐射效率的荧光水平。通过在各个组织周围绘制感兴趣区域（ROI），并将这些数值绘制于相应的标准曲线上，获得标准化的荧光值图示 图1B 生成标准化荧光值，可用于准确比较不同化合物的相对浓度。这些数据精确描述了ELP修饰对进入特定组织的影响，以及给药途径对每种化合物的影响。根据这些结果，可以明确看出，通过鼻内（IN）给药的ELP递送是到达中枢神经系统（CNS）最有效的组合方式。
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讨论
尽管 离体 整体器官成像通常较为直接，但遵循一些基本概念和技术可提高生物分布测量的准确性。短波长光在大多数组织中会发生强烈的散射和吸收，这显著影响了短波长荧光染料的应用效果。这些荧光染料在深层组织研究中的应用受限，但在观察表层组织或眼部的实验中已得到有效应用。相反，长波长光的散射和吸收程度显著降低，因而具有更强的组织穿透能力，可在较厚组织中获得更准确的结果。10. 发射光谱位于远红光和近红外（NIR）范围（激发） ∼ 600 nm）常被选用于整体动物或较大组织的成像。在使用这些长波长荧光染料的实验中，特定组织或材料的自发荧光可能成为关键影响因素。例如，啮齿类动物胆囊内的胆汁在500–600 nm波长范围内具有强烈的自发荧光。由于这会显著干扰肝脏信号的准确性，成像前通常最好先切除胆囊。或者，若需保留完整的肝脏和胆囊，则可选择激发波长位于光谱更远端的荧光染料，以降低胆汁自发荧光的干扰。此外，许多常用的啮齿类饲料含有未纯化的苜蓿，其在中波至长波光谱范围内均表现出强烈荧光。如果所选用的荧光标记物的发射波长落在该范围内，且需对消化道进行成像，则更换饲料可能是最佳选择。
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披露
GLB 是 Leflore Technologies, LLC 的所有人，该公司是一家致力于开发基于 ELP 的药物递送技术的私营企业。Leflore Technologies 未为本文的发表或文中数据的生成提供任何支持。
致谢
GLB的部分薪资由NIH资助项目R01HL121527提供支持。JWDM获得神经病学Currier研究员职位的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 马来酰亚胺衍生物荧光染料（例如，四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺，AlexaFluor 633-C5-马来酰亚胺） | Thermo Fisher | T6027, A20342 | 用于蛋白质标记的巯基反应性荧光染料 |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma | 1002243569 | 用于冲洗的 PBS 缓冲液 |
| 最佳切割温度包埋剂 | Tissue-Tek | 4585 | 用于冷冻和切片固定 |
| 设备 | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 用于离体器官整体成像 | |
| 冷冻切片机 | Thermo | 用于冷冻切片 | |
| 荧光切片扫描仪 | Perkin Elmer | 用于切片扫描 |
参考文献
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