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一种基于组织位移的挫伤性小鼠脊髓损伤模型

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DOI：

10.3791/54988

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2017年6月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Spinal Cord and Brain Injury Research Group, Stark Neurosciences Research Institute, Department of Neurological Surgery and Goodman and Campbell Brain and Spine, Indiana University School of Medicine, 2Norton Neuroscience Institute, Norton Healthcare, 3Department of Anatomical Sciences and Neurobiology, University of Louisville

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍一种基于组织位移的挫伤性脊髓损伤模型，可在成年小鼠中产生一致的挫伤性脊髓损伤。

摘要

生产出一致且可重复的脊髓挫伤（SCI）对于最大限度地减少实验动物间的行为学和组织学变异性至关重要。目前已开发出多种脊髓挫伤模型，通过不同的机制造成损伤。脊髓损伤的严重程度通常依据下落重物的高度、损伤力或脊髓位移量来确定。在本研究中，我们介绍了一种新型的小鼠脊髓挫伤装置——路易斯维尔损伤系统装置（Louisville Injury System Apparatus, LISA）撞击器，该装置能够以高损伤速度和精确度实现基于位移的脊髓损伤。该系统结合激光测距传感器与先进软件，可产生分级且高度可重复的损伤。我们在第10th 小鼠胸椎（T10）水平，以演示逐步操作过程。该模型也可应用于颈椎和腰椎脊髓水平。

引言

人类最常见的脊髓损伤（SCI）是挫伤性脊髓损伤1。为了研究脊髓损伤的机制以及损伤后各种治疗策略，需要建立一种精确、一致且可重复的啮齿类动物挫伤性脊髓损伤模型。

在实验性脊髓损伤（SCI）研究中，已采用多种不同致伤机制的脊髓挫伤模型2,3,4,5,6。其中三种挫伤性SCI模型在SCI研究领域被广泛接受：基于重物下落的纽约大学（NYU）/多中心动物脊髓损伤研究（MASCIS）撞击器3,6、俄亥俄州立大学（OSU）撞击器/电磁脊髓损伤装置（ESCID）5,7，以及无限地平线（Infinite Horizon, IH）撞击器4,8。NYU/MASCIS撞击器或其等效装置通过将固定重量从不同高度下落至目标脊髓，从而产生不同程度的损伤3,6。OSU/ESCID通过诱导组织位移造成损伤5,7。IH撞击器则通过对脊髓施加不同的作用力来产生损伤4,8。每种撞击器使用不同的撞击速度，而速度是影响损伤结果的重要参数。NYU/MASCIS装置产生的速度范围为0.33–0.9 m/s。IH装置的最大速度为0.13 m/s4。OSU/ESCID撞击器的速度固定为0.148 m/s5。值得注意的是，这些模型的速度均低于临床观察到的损伤速度，后者通常超过1.0 m/s9。

本文介绍了一种基于位移的新型压迫性脊髓损伤（SCI）装置，称为路易斯维尔损伤系统装置（Louisville Injury System Apparatus, LISA），可用于以高冲击速度在小鼠中诱导脊髓损伤10。该系统包含一个椎体稳定器，可牢固固定损伤部位的椎骨，从而产生稳定且可重复的脊髓损伤。装置的激光传感器可精确定量组织位移，进而准确评估脊髓损伤的严重程度。撞击杆在接触脊髓时的速度可在0.5至2 m/s之间调节。这些损伤参数能够很好地模拟临床中所见的创伤性脊髓损伤情况。

方案

所有外科手术和动物操作均按照《实验动物护理和使用指南》（美国国家研究委员会）以及印第安纳大学医学院机构动物护理和使用委员会指南的规定批准后进行。

1. 动物准备及T10脊髓椎板切除术操作

  1. 将手术器械和金属脊柱稳定器在高压灭菌器中灭菌。清洁手术操作台。将加热垫预热至37 °C。将加热垫放置在手术台上，并覆盖无菌手术单。整个手术过程中均采用无菌操作技术。
  2. 使用10周龄的雌性成年C57/6J小鼠进行本研究。通过腹腔注射（i.p.）给予每只动物氯胺酮（87.7 mg/kg）和赛拉嗪（12.3 mg/kg）混合物进行麻醉。通过施加足垫夹捏诱发的伤害性刺激，确认动物无反应，以判断麻醉完全。
    1. 皮下注射镇痛剂布托啡诺（0.01–0.05 mg/kg）和非甾体抗炎药卡洛芬（5 mg/kg）。
  3. 使用电动剃刀剃除胸腰段脊柱区域的毛发。用聚维酮碘溶液和70%酒精擦拭液清洁皮肤。
  4. 手术期间在角膜上涂抹眼药膏，以保护眼睛免于干燥。
  5. 使用手术刀在动物背部正中做一条1.5 cm的皮肤切口，以暴露第9节th 至 11th 胸椎椎板。将皮下脂肪组织向头侧推开。从棘突和椎板处游离椎旁肌，向两侧的侧块方向解剖。
  6. 将小鼠置于稳定器的U形槽中图2A 和 2B). 在T10椎骨暴露的关节突下方，用不锈钢臂进行双侧夹紧（图 4A）并使用臂部附带的拇指螺丝拧紧图2A).
  7. 使用显微咬骨钳切除T10棘突和椎板（椎板切除术），暴露覆盖脊髓的硬脑膜图4B).

2. 使用 LISA 撞击器进行 T10 挫伤损伤操作

  1. 将氮气罐上压力调节器的旋钮转动，将压缩氮气压力设定为 20 PSI 或 138 kPa（图1A本研究使用了该试剂盒。
    注意：压力可在10-120 psi范围内调节。较高的压力将产生更高速度的冲击。直径为1.2 mm的脊髓损伤（SCI）装置尖端适用于小鼠，直径为2.2 mm的尖端适用于大鼠。当从小鼠转换为大鼠实验时，可通过在金属尖端（内径1.2 mm/外径2.2 mm）上加装一个环来形成较大直径的尖端。本小鼠脊髓损伤研究中使用的是1.2 mm尖端。使用前对SCI尖端进行灭菌处理。
  2. 打开计算机以启动软件。按下按钮1（图1B）以将撞击头激活至完全伸展位置（图3A-1).
    注意：按钮1的功能是手动启动或关闭气动气缸。
  3. 将装有小鼠的U形容器放置于载物台上（图2B）。通过拧紧支架上的滚花螺钉将载物台固定到位（图2B).
  4. 在……之下 "设定零点水平" 区域（绿色），通过点击设置零位，使用激光传感器测量至完全伸出的柱塞尖端的距离 "开始阅读" 按钮（图3A）。距离将在 "范围" 此区域的参数（图3A）。点击 "设为零" 按钮（图3A），并会显示一个以毫米为单位的数值 "零" 参数框（例如， 8.951 mm，如图所示 图3A).
  5. 按下按钮1（图1B）以撤回撞击器尖端（图3B-1，由上方箭头指示）并松开固定螺丝1（图2B）。将螺丝拉至正确位置（图3B-1，用侧向箭头指示）将探针移离激光束路径，并顺时针旋转螺丝90°以锁定。
  6. 通过调节前部和侧向的微调驱动装置来移动载物台（图1C) 将激光束对准暴露的背侧脊髓中心。确定损伤位置后，通过点击测量组织距离 "开始阅读" 按钮位于下方 "设定损伤程度" 区（蓝色）（图3B 和 3B-1).
  7. 通过垂直微调驱动器缓慢调节传感器与脊髓之间的距离（图1C）以达到所需的位移参数（例如， 0.500 mm，如图所示 "损伤" 参数框）中的 "设定损伤程度" 区（蓝色）图3B).
    1. 当达到预期的损伤位移时，记录组织距离（例如， 8.451 mm，如图所示 "范围" 参数框）（图3B）。定义期望的位移（损伤）= 尖端距离（零点）- 组织距离（范围）（图3B）。当达到预期损伤（例如， 0.500 mm 组织位移）时达到（图3B），点击 "设定损伤" 按钮位于下方 "设定损伤程度" 用于设定损伤区域。
  8. 将螺钉1逆时针旋转90°以解锁，将冲击头推回激光束光路中（图3C-1，箭头所示方向），并通过顺时针旋转90°拧紧螺钉1。
  9. 点击红色区域下方的运行按钮 "运行实验" 区域（图3C）以执行撞击。该区域下方的参数框将显示损伤时间（s）、力（mV）、速度（m/s）和损伤位移（mm）（图3C).
  10. 在记录并保存所有损伤数据后，将带有小鼠的U形槽从平台上取下。在手术显微镜下直观确认脊髓损伤情况图4C).
  11. 使用3-0丝线（Henry Schein，776-SK）连续缝合椎旁肌、浅筋膜和皮肤。
  12. 皮下注射0.9%生理盐水1 mL以补充水分，并将动物置于控温垫上直至完全恢复意识。将小鼠放入笼中，提供可自由获取的食物和饮水。
  13. 术后护理中，需手动排空膀胱，直至自主排尿功能恢复。  用于镇痛，皮下注射布托啡诺（Buprenorphine，0.05–2.0 mg/kg，每日8–12小时一次），持续2天。若发生膀胱感染，皮下注射拜耳瑞（Baytril，5–10 mg/kg溶于0.1 mL，每日1次），持续7–10天。若发生局部或全身感染，皮下注射庆大霉素（Gentamycin，5–8 mg/kg，溶于1 mL无菌生理盐水中，每8–12小时一次），持续4天。
  14. 在脊髓损伤（SCI）后14天拆除缝合线。 
  15. 损伤后第42天，小鼠将通过灌注法处死。在按照1.2节进行适当麻醉后，依次用30 ml 0.01 M磷酸盐缓冲液（PBS）和30 ml含4%多聚甲醛的0.01 M PBS进行灌注。取包含损伤中心在内的1厘米脊髓组织，用于切片及组织学分析。

结果

该装置由五个主要部件组成：（1）带有撞击头的主体（图1C），（2）配备软件的计算机（图1B），（3）电控箱（图1B），（4）脊柱稳定器（图2A），以及（5）用于气动控制系统的压缩空气（图1A）。为实现精确的组织位移，系统依赖激光传感器测量完全伸出的撞针头端与目标脊髓背侧表面之间的距离。软件在计算时会考虑撞针头4 mm的厚度，因为激光束仅能到达撞击器的反射面（图2B 和 图3A-1）。撞针头可置于两个位置：（1）激光束路径中（图3A-1），或（2）远离激光束路径的侧向位置（图3B-1）。当撞针位于激光束路径中时（图3A-1），系统测量撞击头端的距离，并在撞针伸出与回缩运动过程中监测其速度；当撞针位于远离激光束路径的侧向位置时（图3B-1），系统测量激光与脊髓之间的距离。

使用我们的椎体稳定器对 T10 椎骨进行固定是该操作的关键步骤之一（图 2A）10,11。激光传感器进行可靠的距离测量依赖于靶标位置的稳定性，若存在移动则可能导致测量失真。为评估该系统的准确性和一致性，对 8 只小鼠实施了 0.5 mm 的位移损伤。这些动物的位移变异范围为 ± 0.001 mm（± SD），表明该系统具有高度的准确性和可重复性。图 4 展示了在稳定器中固定的靶向椎骨（图 4A），以及在撞击损伤前（图 4B）和损伤后（图 4C）于手术显微镜下暴露的 T10 脊髓。

压缩空气的压力控制损伤发生时撞击器的速度。我们的数据显示，在138 kPa压力下，撞击速度为0.81 ± 0.0345 m/s（均值 ± 标准差）。电气箱上的旋钮（图1B）用于控制损伤后探针与绳索接触的持续时间（停留时间），可在0至5,000 ms之间调节。在大多数实验中，探针-绳索停留时间设定为0.32 ± 0.0147 s（均值 ± 标准差）（图5）。使用该装置，可在成年小鼠中产生严重程度依赖性的挫伤损伤，组织位移分别为0 mm（假手术对照）、0.2 mm（轻度损伤）、0.5 mm（中度损伤）和0.8 mm（重度损伤）（图6）。

压缩空气冲击系统；控制界面，激光传感器；实验装置示意图。
图1：路易斯维尔损伤系统装置（LISA）。（A）该系统由一个冲击器、一个控制系统和一个压缩空气源组成。（B）控制系统包括一个控制箱和一台笔记本电脑。控制箱的软件和控制按钮允许用户设定损伤参数。（C）激光传感器是该设备的关键组件，用于测量损伤靶点的位置、脊髓与传感器之间的距离以及损伤速度。冲击头的快速上下运动由压缩空气驱动。损伤位置和组织位移程度通过微驱动器进行调节，微驱动器可控制三维方向上的运动。请点击此处查看该图的放大版本。

用于啮齿类动物研究中精确颅骨定位的立体定位手术装置与激光校准系统。
图 2：稳定器与小鼠固定装置。（A）脊柱稳定器由一个U形槽和两个用于固定小鼠椎骨的金属臂组成。（B）随后将稳定器安装在撞击装置上。红线表示激光束的路径。请点击此处查看该图的高清版本。

用于损伤测量的 Louisville 冲击器系统设置；软件界面中显示的数据读取阶段 A 至 C。
图 3：制备挫伤性脊髓损伤的方法。（A-C）显示了具有三个损伤参数/区域的图形用户界面（GUI）软件。（A、A-1）绿色区域（SET ZERO LEVEL）用于校准撞杆尖端的距离。红线表示激光束路径。（B、B-1）蓝色区域用于设定损伤水平（SET INJURY LEVEL）。冲击器被向上提起并向右侧横向移动，以允许激光束到达脊髓背侧表面，从而设定零位。红线表示激光束路径。（C、C-1）在冲击前，将撞杆尖端移回激光束路径上以执行损伤操作（RUN）。损伤参数位于红色区域下方（RUN EXPERIMENT）。红线表示激光束路径。 请点击此处查看此图的放大版本。

脊髓减压；T9-T11 椎骨，手术显微镜，骨科手术，医学研究。
图4：损伤暴露与评估。（A）脊柱稳定器的金属臂固定T10椎骨。（B）T10椎板切除术暴露脊髓，背侧血管清晰可见。（C）脊髓背侧表面的撞击所致挫伤（箭头）证实损伤成立。比例尺 = 2 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

位移、速度和停留时间变量的静态平衡数据图表。
图5：损伤参数。 一致的损伤参数包括组织位移（mm）、损伤速度（m/s）和探头停留时间（s）。N = 8，均值 ± 标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

甲苯胺蓝-伊红染色的脑组织、示意图、厚度变化分析、组织学研究。
图6：组织学评估。 使用LISA装置在T10水平造成假手术（0 mm）（A）、轻度（0.2 mm）（B）、中度（0.5 mm）（C）和重度（0.8 mm）（D）挫伤性脊髓损伤后，脊髓的代表性横切面经甲苯胺蓝和伊红染色显示损伤程度与位移严重性相关。图像取自损伤中心部位。比例尺 = 500 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

1911年，Allen首次描述了使用固定重量撞击暴露的犬脊髓以诱导损伤的落锤模型12。此后，基于Allen模型开发了多种类似的落锤模型，包括NYU/MASCIS撞击器3,6,13,14。除了落锤模型外，还开发了其他脊髓损伤（SCI）装置。OSU/ESCID5,7模型采用组织位移机制来控制损伤程度，而IH模型4,8则通过施加可控力来产生可分级的脊髓损伤。在这些系统中，通过夹住损伤部位头侧和尾侧的棘突来实现椎体稳定。这些装置使用的损伤速度较低，分别为0.33–0.9 m/s（NYU/MASCIS）、0.148 m/s（OSU/ESCID）和0.13 m/s（IH）。固定头侧和尾侧棘突可能在撞击过程中引起脊柱柔韧性及移动，从而影响损伤的精确性。

LISA 方法旨在克服现有模型的不足之处，特别是脊柱不稳定性和损伤速度较低的问题。该方法采用双侧关节突稳定技术，避免了与损伤相关的运动伪影。该装置利用高冲击速度，可在 0.5–2 m/s11,15 范围内设定。激光传感器比 ESCID 模型中使用的 Ling 振动器更为先进，能够精确测量距脊髓表面的距离，且无需与组织接触。该模型最初用于制备大鼠脊髓损伤（SCI）模型，现已经过改良，可应用于小鼠和非人灵长类动物的脊髓损伤建模16。

脊柱稳定化可降低所有实验性脊髓损伤（SCI）方法的变异性，尤其是在组织位移模型中。激光测距传感器用于确定脊髓在呼吸运动期间的组织位移程度。必须确保激光聚焦的脊髓位置与撞击器作用的位置完全一致。此步骤在标定阶段完成（图3），此时需对准撞击器尖端与激光束。该模型的一个潜在局限在于，组织位移的测量是从硬脊膜表面进行的。尽管硬脊膜厚度在不同动物之间差异可忽略不计，但充满脑脊液（CSF）的蛛网膜下腔可能存在显著的个体差异。当使用较小的组织位移制造极轻度挫伤时，可能导致损伤结果的变异性。总体而言，损伤的一致性主要取决于组织位移的精确性，同时也依赖于撞杆的速度及其与组织的接触时间。

组织位移的范围较广（精度：0–10 ± 0.005 mm）。根据前期预实验数据以及啮齿类和非人灵长类动物的已发表信息，脊髓（SC）前后径20%的位移可导致轻度脊髓损伤（SCI），30–40%的位移产生中度SCI，而在1 m/s速度下，>50%的位移则导致重度SCI。不同动物物种之间可能存在轻微差异。停留时间可通过时间继电器在0至5秒范围内调节。在本研究中，停留时间设定为300 ms。该参数可轻松调整，以模拟其他脊髓损伤装置（包括NYU和IH模型）的停留时间。

综上所述，我们建立了一种基于位移的成年小鼠脊髓 contusive 损伤模型。该模型采用U形稳定器固定双侧脊柱关节突，避免了激光引导测量脊髓表面时可能产生的脊髓移动伪影。该模型可产生速度为0.5–2 m/s的高速脊髓损伤。激光传感器在确定冲击速度和距离冲击面的距离方面比传统方法更为精确。该模型可在所有损伤程度范围内（从轻度到重度）产生各节段脊髓损伤。经过适当改装后，该装置还可用于大鼠以及非人灵长类等大型动物的损伤建模。

披露

Christopher B. Shields 博士拥有由 Louisville Impactor System, LLC 生产的 Louisville 损伤系统装置（LISA）的所有权。

致谢

本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）NS059622、NS073636项目，美国国防部CDMRP W81XWH-12-1-0562项目，美国退伍军人事务部杰出研究奖I01 BX002356，Craig H Neilsen基金会296749项目，印第安纳州脊髓与脑损伤研究基金会及Mari Hulman George捐赠基金（XMX），肯塔基州路易斯维尔Norton Healthcare（YPZ），印第安纳州卫生部ISDH 13679项目（XW）以及NeuroCures基金会资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯胺酮 (7.2 mg/mL)/赛拉嗪 (0.475 mg/mL)/乙酰丙嗪Patterson Veterinary07-890-8598/07-869-7632/07-808-1947麻醉剂
丁丙诺啡(0.03 mg/mL)Patterson Veterinary07-891-9756镇痛剂
卡洛芬Patterson Veterinary07-844-7425抗生素剂
普渡产品聚维酮碘外科洗手液Fisher Scientific19-027132用于皮肤消毒
杜卡尔纱布海绵Fisher Scientific22-415-490用于皮肤消毒
Decon 无水乙醇（200 proof）Fisher Scientific04-355-450用于皮肤消毒
1 mL NORM-JECT 注射器HENKE SASS WOLFD-78532用于麻醉/镇痛/抗生素药物注射
10 mL 注射器TERUMOREF SS-10L用于生理盐水注射
人工泪液眼膏Webster Veterinary07-870-5261防止眼睛干燥
抗生素软膏Webster Veterinary07-877-0876预防手术切口感染
棉签Fisher Scientific1006015止血
器械灭菌器Fine Science Tools18000-50用于手术器械灭菌
精细镊子Fine Science Tools11223-20夹持组织
手术刀Fine Science Tools10003-12皮肤切开
手术刀片 #15Fisher Scientific10015-00皮肤切开
止血钳Fine Science Tools13004-14止血
咬骨钳Fine Science Tools16021-14椎板切除术
阿格里科拉牵开器Fine Science Tools17005-04保持手术视野开放
精细剪刀Fine Science Tools14040-10用于肌肉与脊柱分离
无菌缝合线Fine Science Tools12051-10皮肤缝合
小鼠脊椎稳定器Louisville Impactor SystemN/A稳定并暴露椎骨
LISALouisville Impactor SystemN/A在小鼠中产生实验性脊髓挫伤

参考文献

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