利用X射线晶体学、生物物理学与功能检测确定T细胞受体识别肿瘤抗原的调控机制

摘要

本文介绍了我们在实验室中常用的方法，用于研究T细胞受体与人类白细胞抗原呈递的肿瘤抗原之间的相互作用特性如何调控T细胞功能；这些方法包括蛋白质表达与纯化、X射线晶体学、生物物理学分析以及功能性T细胞实验。

摘要

人类 CD8+ 细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）在肿瘤控制中发挥着重要作用。为了实现这一功能，细胞表面表达的T细胞受体（TCR）必须能够功能性识别由人类白细胞抗原（HLA）限制的肿瘤来源肽段（pHLA）。然而，我们及其他研究者已发现，大多数TCR与肿瘤抗原的结合效果次优。揭示决定这种低效识别的分子机制，将有助于开发新的靶向疗法，以克服这些局限性。事实上，目前缺乏此类分子层面理解的治疗方法尚未普遍有效。本文描述了我们在实验室中常用的方法，用于研究TCR与pHLA之间相互作用的性质如何调控T细胞功能。这些方法包括可溶性TCR和pHLA的制备，以及利用这些试剂进行X射线晶体学分析、生物物理分析，以及使用pHLA多聚体对T细胞进行抗原特异性染色。通过这些方法并结合结构分析，可以对TCR与pHLA之间的相互作用进行改造，并进一步检测这些改造如何影响T细胞对抗原的识别。这些研究成果已帮助阐明了T细胞识别多种肿瘤抗原的机制，并可指导改造肽段和修饰TCR的设计，从而推动新型癌症疗法的开发。

引言

X射线晶体学过去是，未来仍将是理解配体-受体相互作用本质的一种极为强大的技术。通过在原子水平上可视化这些相互作用，不仅能够揭示调控多种生物过程的分子机制，还可以直接改造相互作用界面以获得治疗效益。结合表面等离子共振和等温滴定 calorimetry（仅举两例）等技术，可对这些改造进行生物物理分析，以评估其对结合亲和力、相互作用动力学及热力学的直接影响。最后，通过对相关细胞类型进行功能实验，可以获得配体-受体相互作用在分子和功能层面影响的详细图景，从而提供非常特异的机制性信息。总体而言，这类方法提供了原子分辨率的视角，有助于阐明生物系统的工作机制，并为诊断和治疗的进步带来重要启示。

本实验室常规使用这些技术来研究介导人类T细胞对病原体和癌症免疫反应的受体，以及在自身免疫和移植过程中的相关受体。本文重点探讨由T细胞受体（TCR）与人类白细胞抗原（HLA）限制性肿瘤来源肽段（pHLA）相互作用所介导的人CD8⁺ T细胞对癌症的免疫应答。这一点非常重要，因为尽管CD8⁺ T细胞能够靶向癌细胞，但我们及其他研究团队此前已证实，抗肿瘤TCR与其对应的pHLA结合效率较低^1,2。因此，许多实验室尝试改造TCR^3,4,5或肽配体^6,7,8，以增强免疫原性并更有效地靶向癌细胞。然而，这些方法并不总是有效，且可能产生严重副作用，包括脱靶毒性^4,9,10。进一步研究调控T细胞识别肿瘤抗原的分子机制，对于克服上述局限性至关重要。

在本研究中，我们重点关注了CD8对自体黑色素瘤细胞的反应⁺ 针对黑色素细胞分化抗原糖蛋白100（gp100）片段的T细胞，gp100_280-288，由HLA-A*0201（最常表达的人类pHLA I类分子）呈递。该抗原是黑色素瘤免疫治疗中被广泛研究的靶点，并已被开发为所谓的 "异源性" 一种在锚定位点9处以缬氨酸取代丙氨酸以提高pHLA稳定性的多肽¹¹该方法被用于增强黑色素瘤反应性CTL的诱导 体外 并在临床试验中成功应用¹²然而，肽残基的修饰可能对T细胞特异性产生不可预测的影响，这一点已通过大多数异源肽在临床应用中的低效性得到证实^6,13确实，gp100的另一种异嗜性形式_280-288，其中肽段第3位的谷氨酸残基被丙氨酸取代，导致gp100多克隆群体无法识别_280-288特异性T细胞^14,15我们先前已证明，即使肽段锚定残基发生微小改变，也可能以不可预测的方式显著改变T细胞的识别^6,16因此，该研究着重于构建更详细的CD8⁺ T细胞识别gp100，以及TCR与pHLA之间相互作用的修饰如何影响这一功能。

本研究中，我们制备了两种针对由HLA-A*0201（A2-YLE）呈递的gp100_280-288的T细胞受体（TCR）的高纯度可溶性形式，以及天然型和修饰型pHLA分子。这些试剂被用于获得蛋白质晶体，以解析人源TCR与异嗜性A2-YLE复合物的三元原子结构，以及两种未结合状态的突变型pHLA结构。随后，我们采用肽段扫描方法，通过深入的生物物理实验，揭示肽段替换对TCR的影响。最后，我们构建了一株经基因改造的CD8+ T细胞系，使其表达其中一种特异性识别A2-YLE的TCR，以开展功能实验，评估不同肽段修饰的生物学效应。研究结果表明，即使对TCR结合基序以外的肽段残基进行修饰，也可能对邻近残基产生不可预测的连锁效应，从而阻断TCR结合及T细胞识别。本研究首次揭示了T细胞识别黑色素瘤重要治疗靶点的结构机制。

方案

1. 蛋白质表达

1. 按照先前详细描述的方法构建用于生成可溶性TCR和pHLA的基因质粒^17,18。每个构建体设计为含有5'端BamH1和3'端EcoR1限制性酶切位点，以便插入pGMT7载体中。
2. 将含有目标蛋白编码序列的pGMT7衍生质粒转化至大肠杆菌（E. coli）Rosetta (DE3)pLysS中：取1 µL浓度为50–200 ng/µL的质粒与5 µL E. coli混合，于4 °C孵育5分钟，42 °C孵育2分钟，再于4 °C孵育5分钟，随后涂布于添加了50 mg/L羧苄青霉素的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。
3. 挑取单菌落，在30 mL添加了100 µM羧苄青霉素的TYP培养基（16 g/L胰蛋白胨、16 g/L酵母提取物和5 g/L KH₂PO₄）中，于37 °C、220 rpm条件下培养，直至菌液在600 nm处的光密度（OD₆₀₀）达到0.4至0.6之间。
4. 取5 mL培养物，加入0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达3小时。分别保留20 µL诱导前和诱导后的菌液用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，并对凝胶进行染色。
5. 将上述培养的种子液接种至1 L添加了100 µM羧苄青霉素的TYP培养基中，按步骤1.3所述条件继续培养，直至菌液OD₆₀₀达到0.4至0.6。
6. 加入0.5 mM IPTG诱导蛋白表达3小时。以3,000 × g离心20分钟，小心弃去上清液。
7. 将沉淀溶解于40 mL裂解缓冲液（10 mM Tris，pH 8.1；10 mM氯化镁，MgCl₂；150 mM NaCl；10%甘油）中，在冰上超声处理30分钟（功率60%，每2秒间隔一次），随后在室温（RT）下加入0.1 g/L DNase孵育30分钟。
8. 用100 mL洗涤缓冲液（0.5% Triton X-100；50 mM Tris，pH 8.1；100 mM NaCl；10 mM EDTA）处理含有包涵体（IB）形式蛋白的悬浮液。
9. 在4 °C、8,000 × g条件下离心20分钟，小心弃去上清液。将沉淀重悬于100 mL重悬缓冲液（50 mM Tris，pH 8.1；100 mM NaCl；10 mM EDTA，pH 8.1）中，再次以8,000 × g离心，小心弃去上清液。
10. 最后，将沉淀溶解于10 mL变性缓冲液（6 M盐酸胍；50 mM Tris，pH 8.1；2 mM EDTA，pH 8.1；100 mM NaCl）中，并使用分光光度计在280 nm处测定蛋白浓度。

2. pHLA 和 TCR 复性

1. 对于pHLA复性，将30 mg HLA-A2（或带有生物素标签的HLA-A2）包涵体、30 mg β2m包涵体和4 mg多肽在6 mL含10 mM二硫苏糖醇（DTT）的变性缓冲液中混合，在37 °C水浴中孵育30分钟。
2. 通过将上述混合物稀释至1 L预冷的pHLA复性缓冲液（50 mM Tris，pH 8.1；400 mM L-精氨酸；2 mM EDTA，pH 8.1；6 mM 半胱胺；4 mM 胱胺）中，启动蛋白复性过程，持续3小时。
3. 在4 °C下搅拌复性反应液3小时，随后转移至12.4 kDa截留分子量（MWCO）透析管中，用20 L的10 mM Tris缓冲液（pH 8.1）透析两次，每次24小时。
4. 对于TCR复性，将30 mg TCR α链包涵体和30 mg TCR β链包涵体在6 mL含10 mM DTT的变性缓冲液中混合，在37 °C水浴中孵育30分钟。
5. 通过将变性的TCR混合物稀释至1 L预冷的TCR复性缓冲液（50 mM Tris，pH 8.1；2.5 M 尿素；2 mM EDTA，pH 8.1；6 mM 半胱胺；4 mM 胱胺）中，启动蛋白复性，持续3小时。
6. 将复性产物转移至12.4 kDa MWCO透析管中，用20 L的10 mM Tris缓冲液（pH 8.1）透析两次，每次24小时。
7. 使用0.45 µm膜滤器对pHLA或TCR复性产物进行过滤，以用于后续纯化步骤。

3. 快速蛋白液相色谱（FPLC）纯化

1. 将过滤后的复性产物（pHLA 或 TCR）上样至一个 7.9 mL、50 µm 的阴离子交换树脂柱，该柱已使用 20 mL 的 10 mM Tris（pH 8.1）在灵活且直观的层析系统上预先平衡。
2. 以 5 mL/min 的流速，用盐梯度（在 10 mM Tris，pH 8.1 中含 0–500 mM NaCl，8 个柱体积内完成）洗脱蛋白，并收集 1 mL 的组分。
3. 通过 SDS-PAGE 分析对应目标蛋白的组分，合并含有目标蛋白的组分，并通过离心（4,000 × g，20 分钟）使用 10-kDa 截留分子量（MWCO 20）或 10 kDa 截留分子量（MWCO 4）超滤管浓缩至 500 µL，弃去滤过液。
4. 将浓缩后的蛋白样品加载至 2 mL 上样环，进样到已预先用适当洗脱缓冲液平衡的 24 mL 凝胶过滤层析柱中：磷酸盐缓冲盐水（PBS）、HBS（10 mM HEPES，pH 7.4；150 mM NaCl；3.4 mM EDTA；0.005% 表面活性剂）或结晶缓冲液（10 mM Tris，pH 8.1，10 mM NaCl）。
5. 以 0.5 mL/min 的流速在一个柱体积范围内洗脱蛋白；收集经 SDS-PAGE 验证含有目标蛋白的 1 mL 组分。
   注：这些方法用于制备可溶性 PMEL17 TCR 和 gp100 TCR，以及本研究中使用的所有 pHLA：HLA-A*0201 负载 YLEPGPVTA（A2-YLE）、YLEPGPVTV（A2-YLE-9V）、ALEPGPVTA（A2-YLE-1A）、YLAPGPVTA（A2-YLE-3A）、YLEAGPVTA（A2-YLE-4A）、YLEPAPVTA（A2-YLE-5A）、YLEPGAVTA（A2-YLE-6A）、YLEPGPATA（A2-YLE-7A）或 YLEPGPVAA（A2-YLE-8A）。

4. 表面等离子体共振（SPR）分析

1. 使用配备 CM5 传感器芯片的分子相互作用分析系统进行平衡结合分析或热力学分析¹⁹。
2. 以 10 µL/min 的流速和 25 °C 的条件，注入 100 mM N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）与 400 mM 1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亚胺（EDC）的 1:1 混合液，持续 10 分钟，以活化 CM5 芯片。
3. 将链霉亲和素（200 µg/mL 溶于 10 mM 乙酸盐缓冲液，pH 4.5，共 110 µL）共价偶联至四个流通池的芯片表面，加载约 5,000 响应单位（RU），随后使用 100 µL 的 1 M 盐酸乙醇胺封闭芯片上剩余的活性基团。
4. 将约 500–600 RU 的 pHLA（浓度约为 1 µM，溶于商品化缓冲液，由生产商提供）以 10 µL/min 的低流速偶联至 CM5 传感器芯片，以确保其在芯片表面均匀分布。
5. 用商品化缓冲液（由生产商提供）中含 1 mM 生物素的溶液冲洗芯片表面 60 秒，以饱和未结合位点。
6. 在 25 °C 下，以 30 µL/min 的高流速将可溶性 TCR 的十个连续稀释浓度注入相应的流通池。
7. 采用非线性曲线拟合（y = (P1x)/(P2+x)）计算平衡结合常数（K_D (E)）值²⁰。
   注：y = 响应单位，x = 分析物浓度，P1 = r_max，P2 = K_D。
8. 假设为 1:1 Langmuir 结合模型，使用软件包中的全局拟合算法进行动力学分析²。
9. 通过在以下温度下重复该方法进行热力学实验：5 °C、12 °C、18 °C、25 °C 和 30 °C¹⁹。
10. 利用 SPR 在不同温度下测定的 K_D 值，根据标准热力学方程（ΔG° = -RTlnK_D）计算 ΔG°¹⁹。
    注：R = 气体常数，T = 开尔文温度，ln = 自然对数。
11. 根据 Gibbs-Helmholtz 方程（ΔG° = ΔH − TΔS°）计算热力学参数¹⁹。
12. 以结合自由能 ΔG°（ΔG° = -RTlnK_D）对温度（K）作图，采用非线性回归拟合三参数方程（y = ΔH+ΔCp*(x-298)-x*ΔS-x*ΔCp*ln(x/298)）¹⁹。
    注：y = 温度（K），x = ΔG°。

5. 等温滴定 calorimetry（ITC）

1. 使用等温滴定微量热仪进行ITC实验。将30 µM pHLA注入量热计样品池中，并将210 µM可溶性TCR装入注射器中。缓冲液条件如下：20 mM Hepes（pH 7.4），含150 mM NaCl。
2. 进行20次TCR注射，每次注射体积为2 µL。使用分析软件计算ΔH和K_D。

6. 结晶、衍射数据收集与模型优化

1. 使用结晶机器人进行结晶实验。
2. 在18 °C条件下，采用悬滴法于96孔板中通过蒸气扩散法生长晶体，每个储液池中含60 µL结晶缓冲液（母液）²¹。
3. 将可溶性pHLA在结晶缓冲液中浓缩至约10 mg/mL（0.2 mM），使用截留分子量为10 kDa的离心浓缩器，在3,000 × g条件下离心完成。
4. 对于共复合物结构，将TCR与pHLA按1:1摩尔比混合，获得浓度约为10 mg/mL（0.1 mM）的蛋白溶液。
5. 使用结晶机器人，将200 nL单独的pHLA或TCR与pHLA的1:1摩尔比混合液，加入至结晶筛选板中每孔200 nL的储液溶液中，并在24小时、48小时、72小时后以及此后每周在显微镜下观察并记录晶体生长情况。
6. 在显微镜下手动将单晶装载至冷冻环中，并通过浸入液氮（100 K）进行冷冻冷却并保存。
   注：晶体装载需要一定练习，而判断哪些晶体适合用于数据收集则依赖经验。一般而言，晶体越大且越规则，质量越好。
7. 在100 K的氮气流中收集衍射数据。
   注：本研究的数据是在英国Diamond Light Source（DLS）国家同步辐射科学设施采集的。
8. 使用xia2程序结合MOSFLM²²和XDS软件包²³估算衍射点强度，然后使用SCALA或AIMLESS²⁴以及CCP4软件包²⁵对数据进行标度处理。
9. 采用分子置换法，使用PHASER²⁶求解结构。
10. 使用COOT²⁷对模型进行调整，并使用REFMAC5²⁸对模型进行精修。
11. 使用PYMOL²⁹生成结构图示。
12. 使用CCP4软件包中的"contact"程序计算分子间相互作用，范德华接触的截断距离设为4 Å，氢键和盐桥的截断距离设为3.4 Å。
13. 使用CCP4软件包中的"SC"程序计算表面互补性。
14. 按照文献所述方法计算TCR-pHLA复合物的交叉角度³⁰。
    注：本研究中，衍射数据和最终模型坐标已提交至PDB数据库（PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6，A2-YLE PDB: 5EU3，A2-YLE-3A PDB: 5EU4，以及A2-YLE-5A PDB: 5EU5）。

结果

利用上述方法，我们制备了可溶性 TCR（表 1）和 pHLA 分子，以对 CD8⁺ T 细胞识别 gp100_280-288 进行深入的分子分析。采用改良的 E. coli 表达系统，分别表达 TCR（α 和 β 链）和 pHLA（α 链和 β2m）各单条链的不溶性包涵体。该方法具有成本相对较低、易于建立的优点，并能产生较高的蛋白产量（每升培养液 100–500 mg）。此外，若在 -80 °C 条件下保存，这些不溶性蛋白具有高度稳定性。随后，我们采用成熟的复性和纯化技术，获得了功能完整、均一的可溶性蛋白。该方法适用于制备用于生物物理、结构和细胞实验的蛋白，也可用于制备诊断或治疗用途的试剂。

在此，我们利用这些蛋白对肽骨架进行丙氨酸扫描突变实验，并通过表面等离子共振（SPR）实验评估TCR结合亲和力（表2）。该检测明确了肽段中哪些残基对TCR结合最为关键。利用该技术进行高分辨率的结合亲和力分析，对于揭示调控蛋白质-蛋白质相互作用的生物学机制，以及分析治疗性分子的结合亲和力具有重要意义。

随后，我们将一种黑色素瘤特异性的可溶性T细胞受体（PMEL17 TCR）与一种修饰的肿瘤来源pHLA（A2-YLE-9V）形成复合物，并进行结晶，以在原子分辨率水平上研究其结合模式（图1、图2和表3）。这些实验直接展示了两种分子之间的结合界面，提供了关于相互作用基本原理的关键信息。我们进一步通过表面等离子共振（SPR）和等温滴定量热法（ITC）对这一相互作用进行了热力学分析，揭示了驱动结合的能量贡献（图3）。这些分析结果还得到了两种蛋白之间接触界面高分辨率描述的进一步支持（图4和表4）。

随后，我们解析了未结合配体的pHLA分子结构，这些分子呈递了突变形式的肽段，揭示出一种分子开关机制，可解释为何某些突变会消除TCR结合（图5）。

总体而言，这些技术提供了新的数据，阐明了T细胞识别黑色素瘤来源抗原的机制，该抗原是抗癌治疗的重要靶点。更广泛地说，这些技术可用于研究几乎任何受体-配体相互作用，揭示可能成为新型治疗手段靶点的新生物学机制。

图 1：电子密度图分析。 左侧一列表示在模型 refinement 过程中省略了多肽的 omit 图谱。差值电子密度图在 3.0 sigma 水平进行等高线绘制，正密度以绿色表示，负密度以红色表示。右侧一列表示在使用 REFMAC5 自动施加的非晶体学对称性限制进行后续 refinement 后，1.0 sigma 水平的观测图谱（以灰色网格形式显示在蛋白质链的棍状模型周围）。(A) PMEL17 TCR-A2-YLE-9V 的模型，其中 TCR 的 CDR3 环以蓝色（α 链）和橙色（β 链）标出，多肽以绿色标出。(B) A2-YLE 的模型，多肽以深绿色标出。(C) A2-YLE-3A 的模型，多肽以橙色标出（对于 A2-YLE-3A，非对称单元中包含两个分子，但它们在 omit 图谱和密度图方面几乎完全相同，因此此处仅显示拷贝 1）。(D) A2-YLE-5A 的模型，多肽以粉红色标出。经参考文献³¹许可转载。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：PMEL17 TCR 与 A2-YLE-9V 复合物的总体结构。（A）PMEL17 TCR-A2-YLE-9V 复合物的卡通图。TCR 以黑色表示；TCR 的 CDR 环以不同颜色标示（红色，CDR1α；深绿色，CDR2α；蓝色，CDR3α；黄色，CDR1β；青色，CDR2β；橙色，CDR3β）；HLA-A*0201 以灰色表示。YLE-9V 肽以绿色棍状模型表示。（B）PMEL17 TCR CDR 环残基（颜色编码同 A）与 A2-YLE 表面（A2，灰色；YLE-9V，绿色棍状）接触的表面与棍状表示。黑色对角线表示 TCR 相对于 YLEPGPVTV 肽长轴的交叉角度（46.15°）。（C）PMEL17 TCR 在 A2-YLE-9V 表面的接触足迹（A2，灰色）；紫色和绿色（分别为表面和棍状）分别表示 HLA-A*0201 和被 gp100 TCR 接触的 YLE 残基。氢键的截断距离为 3.4 Å，范德华相互作用的截断距离为 4 Å。经参考文献 31 许可转载。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：PMEL17 TCR与A2-YLE相互作用的热力学分析。（A）PMEL17 TCR在5、12、18、25和37 °C下对A2-YLE的平衡结合响应，共进行九至十次TCR连续稀释。表面等离子共振（SPR）原始数据及拟合数据（假设为1:1 Langmuir结合模型）显示于各曲线插图中，并采用全局拟合算法（BIAevaluation 3.1）计算K_on和K_off值。表格列出了各温度下的平衡结合常数（K_D (E)）和动力学结合常数（K_D (K) = K_off/K_on）。平衡结合常数（K_D，µM）通过非线性拟合（y = (P1x)/(P2+x)）计算得出。（B）根据Gibbs-Helmholtz方程（ΔG° = ΔH° − TΔS°）计算热力学参数。结合自由能ΔG°（ΔG° = -RTlnK_D）随温度（K）的变化通过非线性回归拟合三参数方程（y = ΔH°+ΔCp°*(x-298)-x*ΔS°-x*ΔCp°*ln(x/298)）进行分析。在298 K（25 °C）下的焓变（ΔH°）和熵变（TΔS°）以kcal/mol表示，通过自由能（ΔG°）随温度（K）变化的非线性回归计算获得。（C）PMEL17 TCR与A2-YLE相互作用的等温滴定量热法（ITC）测定结果。298 K（25 °C）下的焓变（ΔH°）和熵变（TΔS°）以kcal/mol表示。经参考文献³¹许可重印。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：PMEL17 CDR环聚焦于肽残基Pro4、Val7和Thr8。（A）YLE-9V肽与PMEL17 CDR环残基之间相互作用的示意图（颜色编码同图2A）。面板底部的数字表示TCR与肽之间的总相互作用数。（B）PMEL17 TCR与YLE-9V肽（绿色棍状）之间的相互作用，显示TCR CDR3α（蓝色）、CDR1β（黄色）、CDR2β（青色）和CDR3β（橙色）环所形成的范德华相互作用（黑色虚线）和氢键（红色虚线）。下部面板分别为YLE Pro4、Val7和Thr8与TCR CDR环残基（棍状颜色编码同图1A）之间相互作用的放大视图。氢键的截断距离为3.4 Å，范德华相互作用为4 Å。经参考文献³¹许可重印。请点击此处查看此图的放大版本。

图 5：HLA-A*0201 呈递的 YLE、YLE-3A 和 A2-YLE-5A 肽的构象比较。 （A）通过叠加 HLA-A*0201 α1 螺旋（灰色卡通图）对 YLE（深绿色棍状）和 YLE-3A（橙色棍状）肽进行比对。方框中的残基表示谷氨酸3突变为丙氨酸。插图显示，在 A2-YLE-3A 结构中，Glu3Ala 取代导致邻近残基 Pro4 的位置发生偏移（黑色箭头），与 A2-YLE 结构相比。 （B）通过叠加 HLA-A*0201 α1 螺旋（灰色卡通图）对 YLE（深绿色棍状）和 YLE-5A（粉红色棍状）肽进行比对。方框中的残基表示甘氨酸5突变为丙氨酸。经参考文献³¹许可转载。 请点击此处查看该图的放大版本。

TCR	CDR1α	CDR2α	CDR3α	CDR1β	CDR2β	CDR3β
PMEL17	DSAIYN	IQSSQRE	CAVLSSGGSNYKLTFG	SGHTA	FQGTGA	CASSFIGGTDTQYFG
gp100	TSINN	IRSNERE	CATDGDTPLVFG	LNHDA	SQIVND	CASSIGGPYEQYFG
MPD	KALYS	LLKGGEQ	CGTETNTGNQFYFG	SGHDY	FNNNVP	CASSLGRYNEQFFG
296	DSASNY	IRSNVGE	CAASTSGGTSYGKLTFG	MNHEY	SMNVEV	CASSLGSSYEQYFG

表1：PMEL17、gp100、MPD 和 296 gp100特异性TCR的TCR CDR3区比对。 重新发表已获参考文献³¹许可。

肽序列	肽	PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 亲和力 KD	gp100 TCR TRAV17 TRBV19 亲和力 KD
YLEPGPVTA	YLE	7.6 ±2 μM	26.5 ±2.3 μM
YLEPGPVTV	YLE-9V	6.3 ±1.2 μM	21.9 ±2.4 μM
ALEPGPVTA	YLE-1A	15.9 ±4.1 μM	60.6 ±5.4 μM
YLAPGPVTA	YLE-3A	无结合	无结合
YLEAGPVTA	YLE-4A	19.7 ±1.3 μM	144.1 ±7.8 μM
YLEPAPVTA	YLE-5A	>1 mM	>1mM
YLEPGAVTA	YLE-6A	11.4 ±2.7 μM	954.9 ±97.8 μM
YLEPGPATA	YLE-7A	31.1 ±4 μM	102.0 ±9.2 μM
YLEPGPVAA	YLE-8A	38.1 ±7.4 μM	121.0 ±7.5 μM

表2：PMEL17 TCR 和 gp100 TCR 与 gp100_280-288 肽变体的亲和力分析（K_D）。经参考文献³¹许可转载。

参数	PMEL17 TCR-A2-YLE-9V	A2-YLE	A2-YLE-3A	A2-YLE-5A
PDB 编号	5EU6	5EU3	5EU4	5EU5
数据集统计
空间群	P1	P1 21 1	P1	P1 21 1
晶胞参数 (Å)	a= 45.52, b= 54.41, c= 112.12, a=85.0°, b=81.6°, g=72.6°	a= 52.81, b= 80.37, c= 56.06, b=112.8°	a= 56.08, b= 57.63, c= 79.93, a=90.0°, b=89.8°, g=63.8°	a= 56.33, b= 79.64, c= 57.74, b=116.2°
辐射源	DIAMOND I03	DIAMOND I03	DIAMOND I02	DIAMOND I02
波长 (Å)	0.9763	0.9999	0.9763	0.9763
测量分辨率范围 (Å)	51.87 – 2.02	45.25 – 1.97	43.39 – 2.12	43.42 – 1.54
最外层分辨率区间 (Å)	2.07 - 2.02	2.02 – 1.97	2.18 – 2.12	1.58 - 154
观测反射数	128,191 (8,955)	99,442 (7,056)	99,386 (7,463)	244,577 (17,745)
唯一反射数	64,983 (4,785)	30,103 (2,249)	49,667 (3,636)	67,308 (4,962)
数据完备性 (%)	97.7 (96.7)	98.5 (99.3)	97.4 (96.7)	99.6 (99.9)
多重性	2.0 (1.9)	3.3 (3.1)	2.0 (2.1)	3.6 (3.6)
I/Sigma(I)	5.5 (1.9)	7.2 (1.9)	6.7 (2.3)	13 (2.3)
Rpim (%)	5.7 (39.8)	8.8 (44.7)	8.7 (41.6)	4.5 (35.4)
Rmerge (%)	7.8 (39.6)	9.8 (50.2)	8.7 (41.6)	5.0 (53.2)
精修统计
分辨率 (Å)	2.02	1.97	2.12	1.54
用于精修的反射数	61688	28557	47153	63875
Rfree 数据集中的反射数	3294	1526	2514	3406
Rcryst (无截断) (%)	18.1	19.7	17.2	17.0
Rfree	22.2	25.5	21.1	20.1
理想几何结构的均方根偏差
键长 (Å)	0.018 (0.019)*	0.019 (0.019)*	0.021 (0.019)*	0.018 (0.019)*
键角 (°)	1.964 (1.939)*	1.961 (1.926)*	2.067 (1.927)*	1.914 (1.936)*
整体坐标误差 (Å)	0.122	0.153	0.147	.055
Ramachandran 统计
最适构象	791 (96%)	371 (98%)	749 (99%)	384 (98%)
允许区	32 (4%)	6 (2%)	10 (1%)	5 (1%)
异常值	2 (0%)	3 (1%)	1 (0%)	2 (0%)

表3： 数据还原与精修统计结果（分子置换法）。 重印自参考文献³¹，经许可。括号中的数值对应最高分辨率壳层。

HLA/肽残基	TCR残基	范德华接触数（≤4Å）	氢键数（≤3.4Å）
Gly62	αGly98	3
	αSer99	1
Arg65	αSer99	2
Arg65 O	αAsn100 Nδ2	2	1
Arg65 NH1	βAsp58 Oδ2		1
	βSer59	8
Lys66	αGly98	1
	αSer99	4
	αAsn100	4
Ala69	αAsn100	2
	βAla56	2
Gln72 Nε2	βGln51 O	3	1
	βGly54	7
	βAla55	1
Thr73	βGln51	1
Val76	βGln51	3
	βGly52	2
Lys146	βPhe97	3
	βIle98	3
Ala150	βIle98	1
	βAsp102	3
Val152	βIle98	1
Glu154	αTyr32	1
Gln155 N	αTyr32 OH	4	1
Gln155 Oε1	βThr101 N	10	1
Tyr1OH	αGly97 O	1	1
	αGly98	1
	αSer96	1
Glu3	αTyr101	1
Pro4	αSer96	1
	αSer99	1
	αAsn100	4
Pro4 O	αTyr101N	14	1
Gly5	αTyr101	3
	βGly100	2
Val7	βIle98	7
	βGly99	2
	βGly100	2
Thr8	βThr31	5
	βGln51	1
	βPhe97	1
Thr8 N	βIle98 O	6	1

表4：PMEL17 TCR-A2-YLE-9V 相互作用表。 经参考文献³¹许可重印。

讨论

本文所述方案为在任何人类疾病背景下进行T细胞反应的分子与细胞层面解析提供了框架。尽管本研究主要聚焦于癌症，但我们已采用非常相似的方法来研究T细胞对病毒^{32,33,34,35,36,37}以及自身免疫疾病^38,39,40的反应。此外，我们还更广泛地应用这些技术来理解调控T细胞抗原识别的分子机制^2,19,41,42。事实上，肽段残基修饰的不可预测性——即使这些残基位于TCR接触残基之外——对T细胞识别的影响，对于异源肽（heteroclitic peptides）的设计具有重要意义。这些发现已直接推动了新型T细胞疗法的发展，包括肽疫苗^6,43和人工高亲和力TCR^3,4,5,20,44，以及更优的诊断技术^45,46,47。

方案中的关键步骤
获得高纯度且具有功能活性的蛋白质对于本文所述所有方法均至关重要。

修改与故障排除
获得高纯度蛋白的困难通常与表达高纯度但不溶性包涵体（IBs）有关 E. coli 表达系统。通常，修改表达方案（例如， 在不同光密度下诱导，使用不同的 E. coli 菌株或使用不同培养基配方）可解决这些问题。

技术的局限性
这些技术使用的是通常在细胞表面表达的可溶性蛋白质分子（TCR 和 pHLA）。因此，重要的是要确保结构/生物物理研究结果与细胞水平的研究方法一致，以验证其生物学意义。

该技术相对于现有/替代方法的重要性
通过结合功能分析验证的X射线晶体学和生物物理学方法，我们及其他研究者已证明，特异性识别癌症表位的TCR通常具有较低的结合亲和力⁴⁸。这种低TCR亲和力可能有助于解释为何T细胞在自然状态下无法有效清除癌细胞。抗肿瘤TCR与相应肿瘤抗原复合物的高分辨率原子结构研究正逐步揭示这种弱亲和力的分子基础。此外，这些研究有助于阐明旨在克服这一问题的治疗干预措施背后的机制，为未来的改进提供依据¹⁶。在本研究中，我们解析了天然存在的αβTCR与gp100 HLA-A*0201限制性黑色素瘤表位复合物的首个结构。该结构结合深入的生物物理分析，揭示了该相互作用的整体结合模式。我们还发现了一种意外的分子开关机制：在肽段的突变形式中，该机制阻断了TCR的结合（通过表面等离子共振检测）以及CD8⁺ T细胞的识别（通过功能实验验证）。只有借助本文所述的高分辨率方法，才能揭示这种HLA抗原呈递的新机制。

掌握该技术后的未来应用或研究方向
总体而言，我们的结果展示了X射线晶体学与生物物理方法在结合稳健的功能分析时的强大能力。利用这些方法，可以解析出调控T细胞抗原识别的精确分子机制。事实上，该方法也可用于解析未结合配体的TCR结构，从而揭示构象变化在抗原分辨过程中的作用^49,50,51。对TCR-pHLA相互作用背后高度复杂且动态特性的更深入理解，显然对治疗策略的设计具有重要意义。能够直接"观察"治疗靶向的分子，以及修饰对抗原识别所产生的影响，将显著促进未来药物的开发。在本研究中，我们发现即使TCR并未显著接触的肽段单个残基发生改变，也可能不可预测地将结构变化传递至HLA结合肽段中的其他残基，从而剧烈改变T细胞的识别行为。在设计针对多种人类疾病的未来疗法时，对T细胞抗原识别过程中所涉及分子机制的更全面理解将带来巨大裨益。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
S.O.C. 培养基	Invitrogen
Orbi-Safe New Orbit 培养箱	Sanyo
carbenicillin	Sigma
IPTG	Fisher
Quick Coomassie Stain SafeStain	Generon
Legend RT 离心机	Sorvall
Tris	Fisher
氯化镁	Arcos
NaCl	Fisher
甘油	Sigma-Aldrich
Sonopuls HD 2070	Bandelin
DNA酶	Fisher
Triton	Sigma-Aldrich
EDTA	Fisher
胍	Fisher
NanoDrop ND1000	Thermo
多肽	Peptide Protein Research
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich
L-精氨酸	SAFC
半胱胺	Fisher
胱胺	Fisher
透析袋	Sigma-Aldrich
尿素	Sigma-Aldrich
Metricel 0.45 μm 膜滤器	Pall
POROS 10/100 HQ	Applied biosystems
ÄKTA pure FPLC 系统	GE Healthcare Life Sciences
10 kDa MWCO Vivaspin 20	Sartorius
10 kDa MWCO Vivaspin 4	Sartorius
Superdex 200 10/300 GL 色谱柱	GE Healthcare Life Sciences
磷酸盐缓冲液	Oxoid
BIAcore 缓冲液 HBS	GE Healthcare Life Sciences
生物素化试剂盒	Avidity
BIAcore T200	GE Healthcare Life Sciences
CM5 芯片偶联试剂盒	GE Healthcare Life Sciences
链霉亲和素	Sigma-Aldrich
Microcal VP-ITC	GE Healthcare Life Sciences
Hepes	Sigma-Aldrich
Gryphon 结晶机器人	Art Robbins Instruments
Intelli-plate	Art Robbins Instruments
结晶筛选试剂盒及试剂	Molecular Dimensions
75 cm2 培养瓶	Greiner Bio-One
0.22 μm 滤器	Miller-GP, Millipore
Ultra-Clear 超速离心管	Beckman Coulter
Optima L-100 XP 配 SW28 转子	Beckman Coulter
CD8 磁珠	Miltenyi Biotec
抗 CD3/CD28 Dynabeads	Invitrogen
抗 PE 磁珠	Miltenyi Biotec
CK 培养基，PHA	Alere Ltd
抗 TCRVβ 单克隆抗体	BD
达沙替尼	Axon
MIP-1β 和 TNFα ELISA	R&D Systems
51Cr	PerkinElmer
1450 Microbeta 计数器	PerkinElmer