识别调控突触可塑性和记忆的分子与通路，至今仍是神经科学领域的主要挑战之一。本文描述了一种工作流程，用于在听觉学习范式中，对可能参与学习与记忆巩固过程中突触分子重组的突触蛋白进行相对定量分析。
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摘要
摘要
介导听觉学习与记忆的分子突触机制在很大程度上仍不明确。本文描述了一项针对小鼠听觉分辨学习的蛋白质组学研究的工作流程。在此学习范式中，小鼠在穿梭箱的“Go/NoGo”任务中接受训练，以区分上升与下降频率调制音调，从而避免轻微的电击刺激。该方案包括在训练的不同阶段，从小鼠的四个脑区——听觉皮层、额叶皮层、海马和纹状体——富集突触体。通过蛋白质组学方法，将训练小鼠获得的突触蛋白表达模式与未受训练的对照组进行比较。为达到足够的分析深度，在质谱分析前对样本采用三种不同的分离方式：一维SDS-PAGE凝胶内消化、溶液内消化以及磷酸化肽段富集。
采用高分辨率质谱分析和非标记定量技术，对突触体蛋白样品中去除了磷酸肽和富集了磷酸肽的组分进行突触蛋白谱的检测。利用商业软件分析显著调控的突触相对丰度水平（训练组/未训练对照组）的蛋白质和磷酸化肽段。观察到训练后小鼠脑区中突触蛋白质组的共同及差异性调控模式。随后，通过多个数据库的元分析，鉴定出潜在的细胞功能和生物学通路。
引言
学习依赖于记忆痕迹的形成及其维持。目前普遍认为，其潜在机制之一可能是神经元之间新的突触连接的活动依赖性形成和/或已有突触连接的重新排列。在分子水平上，已有研究描述了多种突触蛋白的蛋白质修饰、亚细胞定位变化以及周转率的改变1-4（Lamprecht, 2004 #8）。然而，迄今为止大多数研究主要集中在特定蛋白质上，而非全面分析复杂突触蛋白质组的整体组成。本方法可在小鼠脑区进行学习实验后，对突触蛋白质组的变化进行无偏倚的筛选，适用于获取学习诱导的突触结构重组过程中特定时间点的分子快照。该实验流程需要动物行为学、蛋白质生物化学、质谱分析和生物信息学等多个专业领域的研究人员协同合作。
所选的学习范式， 即 频率调制音调辨别（FMTD）是一种在啮齿类动物中特征明确的听觉辨别任务5在该穿梭箱Go/No-Go任务中，学习与长期记忆的形成涉及依赖于皮层多巴胺信号增强及蛋白质合成的机制。因此，近期针对沙鼠和小鼠的蛋白质组学研究揭示了多巴胺及学习诱导的突触组分在皮层以及更深层脑区中的可塑性重组，这些脑区在FMTD学习与记忆过程中可能相互作用。6-8这表明记忆形成涉及多个脑区之间的复杂相互作用，因此这些脑区在蛋白质组水平上可能受到差异性调控。因此，该实验流程包含了对小鼠特定皮层及皮层下脑区的分离。
此外，即使是对突触蛋白组成中微弱变化的可靠表征，也需要对突触前和突触后组分进行富集，而非直接分析匀浆液或粗膜组分9。因此，为提高突触特异性蛋白的检测水平和动态范围，在进行蛋白质组学分析之前，需采用已建立的方案制备突触体10,11。
将无标记高分辨率质谱用于定量分析的一个基本前提是蛋白质样品之间具有高度相似性。由于学习后突触蛋白质组成仅预期发生轻微变化，因此采用无标记方法比较来自训练小鼠和未训练小鼠的相应蛋白质样品是合适的。 alternatively，可采用基于稳定同位素的条件特异性蛋白质/肽段标记策略例如 TMT、iTRAQ、ICPL 和 SILAC 以及基于 MS2 的无标记定量技术（SWATH）均有应用价值，但相较于所选的无标记方法，这些技术成本更高，或需要特殊的质谱硬件。
由于蛋白质组学筛选通常会产生复杂的数据集，因此建议进行生物信息学处理，以实现对数据的恰当解读。进一步的元分析可能有助于更好地理解与范式相关变化背后的潜在分子机制，并识别所涉及的关键细胞过程和信号通路。下文还将介绍相应的研究方法。
方案
所有涉及动物受试者的操作均依照德国联邦法律、相应的欧盟法规以及美国国立卫生研究院（NIH）指南进行，并已获得萨克森-安哈尔特州行政管理局伦理委员会（42502-2-1102 IfN）的批准。
1. 听觉学习
- 穿梭箱中的听觉辨别学习（FMTD范式） 注意：操作小鼠时务必佩戴手套。
- 将C57Bl6/J小鼠以每笼三至四只的方式饲养于透明聚碳酸酯笼中，自由摄取颗粒饲料和自来水。动物房内维持12小时光照：12小时黑暗的循环周期。若动物来自其他实验室或公司，需至少给予一周时间进行适应和稳定。
- 每天进行一次穿梭箱训练。
- 从动物房的饲养笼中取出小鼠，放入隔音室内的昏暗穿梭箱中。
- 使用完全由计算机控制的学习时间表进行听觉辨别学习。首先进行3分钟的静音习惯化阶段，然后开始训练阶段。
- 使用升调序列（4 - 8 kHz，CS+）作为Go-试次中的Go刺激：动物需在声音呈现后6秒内越过障碍（正确反应，命中）。若未在规定时间内越过，则给予50 - 300 µA的轻度足底电击作为惩罚 通过 穿梭箱的网格底板
- 使用下降音序列（8 - 4 kHz，CS-）作为“非条件刺激”试验中的“非反应”刺激：在6秒的音调呈现期间，动物必须停留在穿梭箱的当前隔间内。若动物出现误触反应，则通过穿梭箱的栅格地板施加50 - 300 µA的轻微足底电击作为惩罚。
- 使用20 ± 5秒的试次间间隔。
- 每 session 以伪随机顺序进行 30 次 Go-trial 和 30 次 No-Go-trial，共 60 次试验，持续约 25 分钟。
- 将训练后的动物放回动物饲养设施中的原居住笼内。
- 脑解剖
- 在完成预定次数的训练后，在预定时间点通过颈椎脱位法处死动物例如 第一次处理结束24小时后，处死动物。
- 通过以下步骤快速解剖脑组织：先用直剪刀剪开皮肤，再沿中线剪开颅骨 矢状缝 使用强力镊子完全去除覆盖脑组织的骨质部分。用解剖刀取出脑组织。
- 将脑组织置于装有冰的培养皿中进行解剖。在体视显微镜下，使用解剖刀和解剖针分离听觉皮层、额叶皮层、纹状体和海马体。
- 使用大脑表面的视觉标志（如血管和表面形状）定位听觉皮层（前囟-2.06至-3.4，前后方向2 mm，背腹方向1.3 mm），并沿双侧以皮层厚度切取呈矩形的组织块。
- 使用Bregma 3.56至1.54之间的脑切片分离额叶皮层 视交叉 作为标志并排除组织 嗅球.
- 在前囟1.54至0.5 mm之间切取纹状体脑片，并小心去除皮层组织。
- 通过小脑插入针固定大脑，从枕叶开始展开皮层，分离海马体。
- 将解剖的脑组织样本在液氮中速冻，并于 -80 °C 保存。
2. 突触体的制备或选择性制备富含突触后密度（PSD）的组分
注意：所有操作过程中，样品和缓冲液均需保持在 0 - 4 °C。缓冲液中需含有 freshly diluted 蛋白酶抑制剂混合物，以防止蛋白质发生蛋白水解降解。若同时研究蛋白质磷酸化，还需添加磷酸酶抑制剂混合物。本方案中所有标明的 g 值均为全程平均相对离心力（g (average)）。
- 粗膜组分的制备（图3A）
- 将解剖得到的脑组织转移至含有1 ml冰浴缓冲液A（5 mM HEPES，320 mM蔗糖，pH 7.4）的匀浆器中，以900 rpm转速进行12次匀浆操作。
- 将样品在1,000 × g条件下离心10分钟，保留上清液。
- 将沉淀物重新悬浮于与之前相同体积的匀浆缓冲液中，在相同条件下再次匀浆12次，随后在1,000 × g条件下离心10分钟。合并相应的上清液，弃去沉淀P1（主要含有细胞核和细胞碎片）。
- 将合并后的上清液在12,000 × g条件下离心20分钟，弃去上清液或用于进一步分级11。
- 使用匀浆器以900 rpm转速进行6次匀浆，将沉淀物重新悬浮于与之前相同体积的匀浆缓冲液中，然后在12,000 × g条件下离心20分钟。弃去上清液，所得沉淀P2即为粗膜组分。
- 从粗脑膜组分中纯化突触体（图3A）
注：可利用蔗糖密度梯度超速离心法将粗脑膜组分分离为髓鞘、轻质膜、突触体和线粒体。此过程需要含有不同浓度蔗糖（0.32 M、1.0 M或1.2 M）的5 mM Tris/HCl缓冲液（pH 8.1）。- 在进行离心以获得P2组分的同时，于超速离心管中配制蔗糖梯度。先加入2.5 ml 1.0 M蔗糖缓冲液，再用玻璃巴斯德吸管小心叠加1.5 ml 1.2 M蔗糖缓冲液，形成下层。
- 将P2组分用0.5 ml 0.32 M蔗糖缓冲液手动匀浆6次，随后加至梯度液顶部。
- 使用摆动转子在超速离心机中以85,000 × g离心2小时。
- 弃去顶部0.32 M蔗糖层以及位于其与1.0 M蔗糖缓冲液界面处的物质（含髓鞘和轻质膜）。收集位于1.0 M与1.2 M蔗糖缓冲液界面处的突触体。离心管底部的沉淀为线粒体。
- 向突触体组分中加入等体积的0.32 M蔗糖缓冲液，轻轻混匀后在150,000 × g条件下离心1小时。突触体存在于沉淀中，可将其重新悬浮于后续实验所需的缓冲液中。
- PSD富集组分的制备（图3B）
- 取单只动物特定脑区组织，置于200 µl超速离心管中，加入100 µl提取缓冲液（5 mM Tris/HCl pH 8.1，0.5% Triton X-100），使用聚四氟乙烯（PTFE）研杵在2,000 rpm转速下匀浆12次。
- 加入100 µl提取缓冲液，混匀后于4 °C孵育1小时。在100,000 × g条件下离心1小时，用200 µl移液器小心收集上清液S1。
- 在原管中将沉淀P1再次加入100 µl提取缓冲液，使用PTFE研杵在2,000 rpm转速下匀浆12次。
- 加入100 µl提取缓冲液，充分混匀后在100,000 × g条件下离心1小时。
- 将上清液S2与S1合并，得到可溶性蛋白组分。该组分包含胞质蛋白、0.5% Triton X-100可溶性膜蛋白以及细胞外基质分子。
- 将剩余沉淀重新悬浮于50 µl 5 mM Tris/HCl缓冲液（pH 8.1）中。该组分包含突触后密度（PSD）、去垢剂抗性膜、不溶性细胞骨架成分、线粒体以及包括细胞核在内的细胞碎片。其中PSD含量显著富集，PSD是突触后结构的核心，也包含突触前活性区细胞基质的重要组成部分。PSD的富集倍数约为4倍，其组分的富集效果已有先前研究证实12。
3. 质谱分析样品制备
- 裂解与样品归一化
注意：即使针对微弱的突触蛋白表达变化，最终获得可靠定量数据的关键步骤之一是基于蛋白浓度进行样品归一化。- 将动物各脑区的突触体或富集的突触后密度（PSD）制备物溶解于20–50 µl的8 M尿素中（具体体积取决于总材料量：例如听觉皮层组织5–15 mg时使用20 µl），并在冰上超声水浴中孵育1小时。
- 对于胶内消化，可直接将突触体溶解于SDS样品缓冲液中。需仔细计算上样量，避免凝胶过载。请注意，在此情况下，高丰度的支架蛋白将在凝胶电泳和胶内消化过程中丢失。
- 用1%可去除型去垢剂稀释，使尿素终浓度为2 M。避免任何高于30 °C的温度，以防止蛋白质发生氨基甲酰化。
- 取样品等分试样（例如 10 µl），按照标准程序进行SDS-PAGE13,14。
- 根据制造商说明书用考马斯亮蓝染色凝胶。该程序结合了甲醇和乙酸的固定与染色步骤。
- 使用校准过的凝胶扫描仪在透射模式下测定每个样品整条泳道的光密度，并计算相对蛋白含量。
- 根据上述计算结果对样品进行归一化处理。
- 将每个样品分为两个部分：三分之一用于胶内消化，三分之二用于溶液内消化。
- 将动物各脑区的突触体或富集的突触后密度（PSD）制备物溶解于20–50 µl的8 M尿素中（具体体积取决于总材料量：例如听觉皮层组织5–15 mg时使用20 µl），并在冰上超声水浴中孵育1小时。
- 胶内消化
- 凝胶分离
- 使用浓度已调整的样品进行第二次SDS-PAGE。再次染色并定量凝胶，以检查归一化质量。
- 将凝胶中每个样品的泳道切割成不同区域（每条泳道8段），但排除分子量高于170 kDa的区域。将凝胶片段转移至不同的离心管中。
- 用锋利的手术刀将各区域切成较小的块状（约1 × 1 mm），以提高胶内消化效率。
- 消化15
- 根据染色强度，用50–150 µl含有50%乙腈（ACN）和50 mM碳酸氢铵（NH4HCO3）的缓冲液多次洗涤凝胶块，每次10分钟。
- 移除上清液。用ACN覆盖凝胶块，并在20 °C孵育至凝胶块变白并收缩。
- 移除ACN，并用50 µl 0.1 M NH4HCO3重新水合凝胶块5分钟。加入等体积ACN，并在37 °C继续孵育15分钟。
- 完全移除并弃去液体。在真空离心浓缩仪中干燥凝胶块。
- 用含10 mM二硫苏糖醇（DTT）的50 µl NH4HCO3重新水合凝胶块，并在56 °C加热45分钟以还原半胱氨酸残基。
- 移除上清液，加入含55 mM碘乙酰胺（IAA）的50 µl NH4HCO3，避光孵育30分钟，以对还原的半胱氨酸进行羧氨甲基化修饰。
- 完全移除并弃去凝胶块上方所有液体，用50 µl NH4HCO3和ACN（1:1）洗涤两次，每次10分钟，以去除残留的IAA。在真空离心浓缩仪中干燥样品。
- 为实现蛋白质的有限消化，加入含12.5 ng/µl胰蛋白酶的25 mM NH4HCO3。所需体积取决于凝胶块的大小和数量。短暂孵育后检查缓冲液是否被吸收，必要时补充缓冲液，确保完全覆盖凝胶块。在37 °C孵育过夜（至少12小时）。
- 肽段提取
- 在凝胶块上覆盖10–20 µl 25 mM NH4HCO3，并加入等体积ACN。在冰上使用超声水浴孵育10分钟。随后移除并收集上清液，其中含有大部分生成的肽段。
- 向凝胶块中加入100 µl提取缓冲液（含30% ACN/0.1%三氟乙酸（TFA））。重复超声水浴孵育，并小心收集此上清液。
- 通过将ACN浓度提高至50%，重复上一步提取过程。超声水浴10分钟后离心并收集上清液。
- 合并三次提取步骤对应的全部上清液，在真空离心浓缩仪中干燥。注意：由于凝胶分离，每泳道/样品的8个区域在此步骤中重新合并为一个样品。
- 凝胶分离
- 溶液内消化
- 消化
- 使用计算所得的归一化样品量（例如 150 µl裂解液中的100 µl，具体取决于材料量及特定脑区样品重悬所需的体积），以获得足够的起始材料，用于至少三次技术重复的无标记质谱分析。
- 加入含2 mM DTT的25 mM NH4HCO3，轻轻涡旋混匀样品。在20 °C还原45分钟。
- 加入10 mM IAA以对半胱氨酸残基进行羧氨甲基化修饰。混匀后在20 °C避光孵育30分钟。
- 最后加入1 µl胰蛋白酶储备液（25 mM乙酸中含1 µg/µl胰蛋白酶），在20 °C孵育12小时。
- 固相萃取（SPE）纯化
- 为去除酸可裂解去垢剂，将样品调节至终浓度为1% TFA，并在20 °C孵育1小时。
- 在16,000 × g离心10分钟，并小心收集上清液。
- 将SPE柱置于支架上，先用2 ml甲醇平衡填料，再用2 ml含0.1% TFA的水（缓冲液B）洗涤两次。
- 加入2 ml缓冲液B，加载样品，再洗涤三次。
- 用200 µl 70% ACN/0.1% TFA洗脱肽段，重复此步骤一次。
- 合并两次洗脱液，在真空离心浓缩仪中干燥。
- 消化
- 通过TiO2色谱法富集磷酸化肽段16
- 将胶内或溶液内消化产生的肽段溶解于150 µl含80% ACN/2.5% TFA的缓冲液C中，并将约2 mg TiO2微球在50 µl缓冲液C中平衡。
- 将微球加入样品中，在旋转装置中20 °C孵育1小时。随后离心（16,000 × g，1分钟），收集上清液。
- 用100 µl缓冲液C轻轻混匀并离心（5分钟后）洗涤微球三次，收集上清液。随后用100 µl含80% ACN/0.1% TFA的溶液重复洗涤三次，再用100 µl不含ACN的0.1% TFA洗涤三次。
- 合并全部十次洗涤的上清液，在真空离心浓缩仪中干燥，并作为去磷酸化肽段组分，按第3.5步进行后续纯化。
- 用20 µl含400 mM NH4OH/30% ACN的溶液从微球上洗脱结合的磷酸化肽段，重复三次，每次离心后收集上清液。
- 合并同一样品的胶内消化和溶液内消化所得洗脱液，作为富集磷酸化肽段组分。在真空离心浓缩仪中干燥至终体积4–8 µl。
- 通过微固相萃取（micro-SPE）浓缩和脱盐处理去磷酸化肽段组分
- 将干燥的肽段溶解于20 µl 0.1% TFA中。
- 通过向吸头中吸入20 µl ACN来平衡固定的C18填料。再通过吸入含0.1% TFA的水洗涤填料，重复三次。
- 缓慢将酸化后的样品加载至吸头中（重复三次）。
- 用20 µl含0.1% TFA的水洗涤C18填料三次，弃去洗涤液。
- 通过反复（三次）吸入20 µl含70% ACN/0.1% TFA的溶液，从移液吸头中洗脱肽段，并将洗脱液收集至另一离心管中。
- 合并同一样品的所有洗脱液，在真空离心浓缩仪中干燥。
4. 蛋白质组分析
注意：蛋白质组分析在配备超高效液相色谱（UHPLC）的混合型双压线性离子阱/轨道阱质谱仪上进行。该液相色谱系统由带20 µl进样环的制冷自动进样器、二元加载泵（µl流速范围）、二元纳米流分离泵、带有两个微切换阀的柱温箱以及脱气装置组成。样品首先注入捕获柱（例如 100 µm × 2 cm）上，流速为 7 µl/min，随后在色谱柱上进行分离例如 75 µm x 25 cm）上，流速为 250 nl/min。分离柱出口直接连接至固定在质谱仪电离源纳米喷雾接口中的涂层Pico喷针尖端。
- 纳米液相色谱与串联质谱
- 将肽样品溶解于 12 µl 含 2% 乙腈（ACN）和 0.1% 三氟乙酸（TFA）的溶液中，孵育至少 30 分钟。离心 15 秒后，取 11 µl 上清液转移至自动进样瓶（锥形，减径）。
- 在控制软件（例如，Xcalibur）中设置自动化的样品进样、色谱分离及串联质谱分析程序，具体如下：
- 温度设置如下：自动进样器：5 °C；柱温箱：45 °C。
- 进样设置如下：进样体积：10 µl；流速：7 µl/min（2% ACN，0.1% TFA）；时间：8 分钟；阀位：捕获柱 - 废液；质谱采集：关闭。
- 分离设置如下：流速：250 nl/min；阀位：捕获柱 - 分离柱；质谱采集：开启。
0 分钟 - 100 分钟：2% ACN，0.1% 甲酸 - 40% ACN，0.1% 甲酸
100 分钟 - 105 分钟：40% ACN，0.1% 甲酸 - 95% ACN，0.1% 甲酸
105 分钟 - 109 分钟：95% ACN，0.1% 甲酸
109 分钟 - 120 分钟：2% ACN，0.1% 甲酸 - 质谱参数设置如下：全扫描 MS：傅里叶变换质谱（FTMS）；分辨率 60,000；m/z 范围 400 - 2,000；MS/MS：线性离子阱；最小信号阈值 500；隔离宽度 2 Da；动态排斥时间 30 秒；排除单电荷离子入选；归一化碰撞能量设为 35%，激活时间设为 10 毫秒。
注：一次全扫描 MS 后，最多进行 15 次 LTQ MS/MS 扫描，采用碰撞诱导解离（CID）对丰度最高的肽离子进行碎裂分析。
- 对所有样品进行三次技术重复实验。
- 蛋白质鉴定与非标记定量
- 使用商业软件套件（例如，PEAKS Studio）对质谱原始数据进行处理，实现蛋白质鉴定与非标记定量分析。与其他大多数蛋白质组学软件不同，该软件在进行蛋白质数据库比对前，首先采用 从头测序（de novo sequencing）算法。然而，此步骤也可由其他常用软件替代。
- 采用 表 2 中列出的关键参数设置。
- 磷酸化蛋白质组学
注：高效且可靠的磷酸肽检测需要对蛋白质组学工作流程进行若干关键调整。- 磷酸肽富集后，切勿将样品完全干燥，应始终保持样品处于溶解状态。
注：磷酸化苏氨酸或丝氨酸的磷酸酯键极为不稳定。在离子阱中发生碰撞诱导解离时，易发生磷酸基团的中性丢失，从而阻止肽段进一步碎裂，而后续碎裂是完成鉴定所必需的。质谱设置中允许使用 宽频激活（wideband-activation），可在磷酸基团发生中性丢失后继续对磷酸肽进行碎裂，实现节省时间的 "pseudo-MS3" 效果。磷酸化位点在 MS/MS 数据中的确定需专门的验证与评估，可使用 phosphoRS 3.0 软件完成。
- 磷酸肽富集后，切勿将样品完全干燥，应始终保持样品处于溶解状态。
5. 生物信息学 - 荟萃分析
注意：在进行功能注释和网络分析之前，必须对蛋白质列表进行预处理。首先分别合并每个脑区的调控蛋白和磷酸化肽段列表。然后去除每个组分中的所有重复 UniProt-ID，以防止误读。
- 使用 GeneCodis 进行单一富集分析 17
- 打开基于网络的 GeneCodis 工具（http://genecodis.cnb.csic.es）
- 选择 "Mus musculus" 生物体和 "GO生物学过程" 作为注释。
- 粘贴某一组分的 UniProt ID 列表。提交后等待分析完成。点击 "GO生物过程的单基因集富集分析" 并查看结果。
- 对其他三个组分重复步骤5.1.3。
- 要查看结果列表之间的重复和交集，可使用 Perl 或 Python 等脚本语言来筛选所需数据。适用于单一富集分析的类似工具有 DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）和带有插件 BiNGO（http://apps.cytoscape.org/apps/bingo）与 ClueGO（http://apps.cytoscape.org/apps/cluego）的 Cytoscape（http://www.cytoscape.org/）。
- 利用 Gephi（https://gephi.org/）将 GeneCodis 数据生成基于力导图的可视化图形
注意：图表所需数据必须由用户自行提供，可采用图表格式（.gexf、.graphml、.dot、.gv、.gml）上传，或手动输入。- 生成图节点
- 手动操作：打开 Gephi，然后点击 "数据实验室". 创建节点。单击 "节点" 向左切换 "节点" 表格。点击 "添加节点"输入术语名称。点击 "好的"/按 Enter 键。
- 替代方案：将 GeneCodis 结果保存至计算机。使用电子表格程序打开 .txt 文件。删除除以下内容外的所有行 "项目详情" （术语名称）。更改标题 "项目详情" 到 "标记". 将电子表格另存为 ".csv"现在，在 Gephi 中点击 "导入电子表格". 在 Gephi 的文件浏览器中选择电子表格。点击 "下一步". 点击 "完成".
- 通过边连接节点。
- 点击 "边缘" 向左切换 "边缘" 表格。对于每个节点（Term）：在其他 Term 中查找基因名称。如果存在一个或多个共享基因——> 创建边缘。
- 点击 "添加边缘"选择 "无导向的"从下拉列表中选择源节点和目标节点。点击 "好的"/按回车键。若存在多个共有的基因，请输入其丰度 "重量" （表格）
- 基于力的图形布局。
- 打开图形数据文件，将图形类型设置为 "无导向的" 或使用手动输入的数据，点击 "概述" 如果尚未选择。
- 根据连接的丰富程度调整节点大小。点击“Statistics”，运行以下任意一项 "平均度数" （无权重边）或 "平均加权度数" （加权边）下 "网络概述"在 "外观"，点击 "节点"，然后点击大小按钮，接着选择 "属性" 并将属性参数设置为 "平均加权度数" 或 "平均度数"点击应用。
- 最后：选择 "力图谱" 在 "布局" 并运行；更改 "排斥强度" 如果节点发生碰撞。
- 导出为图片。
- 截图功能：点击 "概述"，通过底部菜单更改图表布局、边线粗细、标签大小和缩放比例 "图形" 单击相机左侧按钮，保存图片。
- 导出功能 "预览"点击 "预览". 将预设更改为 "默认直形"根据所选偏好更改设置，然后点击 "SVG/PDF/PNG" 导出。
- 生成图节点
结果
图1 总结了小鼠在听觉辨别学习后，对其脑区进行定量突触蛋白质组分析的完整工作流程。该流程始于动物在穿梭箱中的训练。在下图示例中 图2小鼠开始在4 kHz频率调制音分辨任务中表现出显著的分辨能力th 训练阶段显示出高效的学习效果。在选定的时间点处死动物，以分离脑区。突触的富集可通过制备突触体实现，或者 alternatively 通过制备富集突触后密度（PSD）的组分来实现，两种方法均在下文中详细描述。 图3. PSD富集法已针对微量组织样本进行优化， 例如 1 - 2 个大鼠脑 hippocampal 脑片12, 18需要小型离心管、与这些离心管匹配的聚四氟乙烯（PTFE）研磨杵，以及用于驱动研磨杵的实验室钻孔机。
由于突触体具有特殊的蛋白质组成，强烈建议采用两种不同但互补的方法进行样品制备。突触后致密物质（PSD）支架通常是高化学计量比的高分子量蛋白质。溶液内消化是高效提取这些蛋白的最佳方法，但可能导致肽混合物的过度取样。同时平行进行的凝胶内消化则可排除这些高分子量蛋白，有利于中低分子量蛋白质的分析。为了实现全面的分析，建议同时采用这两种类型的蛋白酶解消化方法。
所研究的不同脑区组织量存在差异，需对所用材料进行调整，以便更好地进行比较。在所研究的四个脑区中，听觉皮层通常是限制因素。在制备突触体或富含突触后密度（PSD）组分后（见3.1.1节），其他所有脑区的材料量应根据听觉皮层的量进行精确调整。从小鼠新鲜制备的各脑区典型重量如下：听觉皮层（AC）：约50 mg；海马（HIP）：约90 mg；纹状体（STR）：约120 mg；前额叶皮层（FC）：约100 mg。
第2.3节所述的PSD富集方法，可在单个动物水平上，从每个脑区鉴定出约1500种不同的蛋白质和约250种不同的磷酸化肽（表1）。在首次训练后24小时进行的蛋白质组学分析显示，与未经训练的对照组相比，7.3%的已鉴定蛋白质和5.8%的磷酸化肽在突触表达水平上发生了显著（p<0.05）的定量变化（表1）。突触支架蛋白表现出明显的下调趋势，这可能提示在FMTD学习的早期阶段发生了显著的突触结构重塑。绝大多数受调控的蛋白质在不同脑区呈现区域特异性变化，仅有22%的蛋白质在两个或更多脑区中被共同调控。六个代表性示例见图4。
IPA 对复杂结果的荟萃分析表明，以下经典信号通路可能被特别参与或调控：“网格蛋白介导的内吞作用信号通路”、“轴突导向信号通路”、“钙信号通路”、“RhoA 信号通路”、“Notch 信号通路”、“上皮粘附连接重塑”、“谷氨酸受体信号通路”、“GABA 受体信号通路”、“多巴胺受体信号通路”以及“突触长时程增强”。
单次富集分析显示，前额叶皮层中与蛋白质转运、细胞黏附、磷酸化、内吞作用、囊泡介导的转运、前脑发育以及轴突发育相关的生物学过程显著富集（图5）。在听觉皮层中，显著的生物学过程包括离子转运、翻译、mRNA转运、蛋白质转运以及学习功能。对海马体蛋白质组分的分析检测到与离子转运、细胞周期、翻译、磷酸化以及神经系统发育显著相关的富集过程。在纹状体中，发现显著富集的生物学过程包括mRNA转运、囊泡介导的转运、轴突发育、蛋白水解、蛋白质转运以及内吞作用。
图1： 方法学策略的系统性工作流程。 本图以示意图形式总结了针对特定脑区突触蛋白组成进行高分辨率定量分析的整体工作流程。请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 小鼠在FM音调辨别任务中表现的示例。 在训练过程中，动物的命中率（蓝色曲线）逐渐上升，而误报率（黑色曲线）逐渐下降。从第四次会话开始出现显著的辨别能力。误差条表示标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3： 突触体及PSD富集组分的制备。 A： 突触体的制备。 B： PSD富集组分的制备。两图分别说明了从脑组织中制备突触体或PSD富集组分的详细操作流程。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4： 部分定量蛋白质组学结果。 比较在首次训练后 24 小时，接受 FMTD 任务训练的小鼠（AV，n = 6）与未受训练的对照小鼠（NV，n = 6）之间特定蛋白质在突触中的相对丰度。蛋白质丰度值通过其三条最强烈肽段的峰面积中位数计算得出。图中标注了丰度变化显著的蛋白质（AV/NV；t 检验）：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.005。误差线表示标准差（SD）。请点击此处查看该图的高清版本。
图 5： 通过 GeneCodis/Gephi 对额叶皮层生物通路的可视化。 此处仅显示与“生物过程”相关的 Gene Ontology (GO) 数据库（http://geneontology.org）中具有统计学显著性的条目，且每个条目所包含的蛋白质数量至少为三个。节点代表 GO 条目，节点的大小、连线的宽度以及某一节点的连接数量表示共享该 GO 条目的蛋白质数量。由于采用了 Gephi 的“Force Atlas”布局算法，相关的节点会紧密聚集在一起。请点击此处查看该图的放大版本。
| 脑区 | AC | FC | HIP | STR | ∑ |
| 鉴定出的蛋白质 | 1435 | 1758 | 1572 | 1507 | 6272 |
| 差异表达蛋白质 (p<0.05) | 59 | 130 | 162 | 108 | 459 |
| ↑ AV/NV | 8 | 4 | 76 | 35 | 123 |
| ↓ AV/NV | 51 | 126 | 86 | 73 | 336 |
| 鉴定出的磷酸化基序 | 197 | 361 | 273 | 278 | 1109 |
| 差异表达磷酸化基序 (p<0.05) | 8 | 22 | 21 | 14 | 65 |
| ↑ AV/NV | 4 | 17 | 5 | 9 | 35 |
| ↓ AV/NV | 4 | 5 | 16 | 5 | 30 |
表1：蛋白质组学结果概要。 本表总结了一项代表性蛋白质组学实验，比较了训练小鼠（AV，n=6）在首次训练后24小时与其未训练对照组（NV，n=6）的差异。共检测到459种表达改变的蛋白质，其中包含重叠的调控结果。其中283种调控被确定为脑组织特异性。具体而言，57种蛋白质在两个脑区中发生调控，18种蛋白质调控在三个脑区中被检测到，仅有2种蛋白质在所有四个被研究的脑区中均发生调控。
| 误差容限 | |
| 前体离子质量（傅里叶变换质谱法） | 10 ppm |
| 碎片离子质量（线性离子阱） | 0.6 Da |
| 每条肽段允许的最大漏切位点数 | 3 |
| 固定修饰 | |
| 凝胶内消化样品 | 半胱氨酸的羧氨甲基化 |
| 溶液内消化样品 | 半胱氨酸的甲硫基化 |
| 可变修饰 | 甲硫氨酸的氧化 |
| 天冬酰胺和/或谷氨酰胺的脱酰胺 | |
| 数据库 | Uniprot/Sprot |
| 物种分类 | 小鼠 |
| 统计学鉴定-接受参数设置 | |
| 从头平均局部置信度（ALC） | > 50% |
| 肽段错误发现率（FDR，基于估计的诱饵融合） | < 1% |
| 蛋白质显著性（-10logP，基于修正的t检验） | > 20 |
| 每种蛋白质的唯一肽段数 | ≥ 1 |
| 定量参数设置： | |
| 用于定量的肽段需满足： | |
| 肽段显著性（-10logP） | > 30 |
| 肽段在 | ≥ 50% 的样品中被鉴定到 |
| 肽段信号质量 | >1 |
| 肽段平均峰面积 | > 1E5 |
| 肽段保留时间容差 | < 5 min |
| 归一化 | 基于总离子流（TIC） |
表2：蛋白质鉴定参数设置（步骤4.2.2）。
讨论
该研究提出了一种方法学工作流程，旨在对小鼠不同脑区在学习与记忆巩固过程中突触蛋白表达变化进行精确的定量分析。尽管质谱分析要求每个样本至少进行三次技术重复，该实验设计仍可在单个动物水平上研究蛋白表达情况。
该方法考虑了突触前和突触后特殊的蛋白质组成，其中包括高分子量的支架蛋白，也包括具有中等或较低分子量的重要介导蛋白。突触体样本的溶液内消化会产生大量源自支架蛋白的肽段，从而导致这些肽段的过度代表。这反过来可能抑制对较小或丰度较低蛋白的分析。建议从各样本等分试样中制备SDS-PAGE组分，并平行进行胶内消化，该方案有助于中等及低丰度蛋白的分析，是一种强烈推荐的互补方法。在对一个样本所获得的各组分分别进行质谱分析后（例如 溶液内消化、凝胶内消化、联合磷酸化富集组分）相应的质谱/质谱数据集可合并，并通过PEAKS软件或其他常用软件包进行蛋白质鉴定与定量分析。
或者，可分别应用样品的胶内消化组分（样品泳道中单独处理的凝胶区域）以及溶液内消化样品所产生的组分例如 通过离子交换色谱与质谱联用可提高分析深度。然而，这一扩展的工作流程会显著延长液相色谱-串联质谱（LS-MS/MS）数据采集所需的时间。为了获得学习与记忆形成过程中突触蛋白重排的详细分子序列，需要进行特定时间点的蛋白质组学分析。该时间进程可从首次训练开始时甚至训练过程中立即启动，并持续覆盖密集的时间节点，直至动物行为表现达到约8至10天训练后的学习曲线平台期（参见 图2 详情请参见）。
对突触蛋白磷酸化变化的分析需要特别关注FMTD学习过程中选定的时间点。一方面，在动物训练的早期阶段，预计会启动已知由蛋白磷酸化和去磷酸化触发的信号级联反应，从而引发突触蛋白的重排。另一方面，已知多种突触蛋白的磷酸化状态会发生持久性改变，这些改变调控着突触结构内部的连接性和组装19, 20。这些翻译后修饰甚至在记忆巩固的后期时间点仍然存在。
该蛋白质组学工作流程产生的复杂数据集需要经过生物信息学处理，以鉴定参与的分子通路和关键分子。荟萃分析显示，存在显著富集的通路，这些通路在学习和记忆过程中发挥重要作用。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Yvonne Ducho 和 Kathrin Pohlmann 提供出色的技术支持。本工作由德国研究基金会（SFB 779）以及萨克森-安哈尔特州/欧洲区域发展基金（ERDF）通过行为脑科学中心（CBBS）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3 M Empore 固相萃取-滤膜 | 3M Bioanalytical Technologies | 4245SD | 7 mm/3 ml |
| Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164564 | 100 µm x 2 cm, C18 |
| Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164569 | 75 µm x 25 cm, C18 |
| 乙酸 | Carl Roth GmbH | 3738.1 | |
| 乙腈 (ACN) | Carl Roth GmbH | AE70.2 | |
| 丙烯酰胺 (30%) | AppliChem | A0951 | |
| 碳酸氢铵 | Fluka | 9830 | |
| 氢氧化铵 | Fluka | 44273 | |
| 过硫酸铵 (APS) | AppliChem | A2941 | |
| Biofuge pico | Heraeus GmbH | 75003280 | |
| 考马斯亮蓝 R-250 | SERVA Electrophoresis GmbH | 17525 | |
| 溴酚蓝 | Pharmacia Biotech | 17132901 | |
| C57BL/6J 小鼠 | Charles River | ||
| 斑蝥素 | Carl Roth GmbH | 3322.1 | |
| 适用于 MLS-50 的离心管 | Beckman Coulter | 344057 | |
| 适用于 TLA 100.1 转子的离心管 | Beckman Coulter | 343776 | |
| 二硫苏糖醇 (DTT) | AppliChem | A1101 | |
| Eppendorf 5417R 离心机 | VWR | 22636138 | |
| Eppendorf A-8-11 转子 | VWR | 5407000317 | |
| 甲酸 | Fluka | 14265 | |
| GeneCodis | http://genecodis.cnb.csic.es/ | ||
| Gephi | https://gephi.org/ | ||
| 甘油 | AppliChem | A1123 | |
| 甘氨酸 | AppliChem | A1067 | |
| HALT 磷酸酶抑制剂混合液 | Pierce /Thermo Scientific | 78420 | |
| HEPES 缓冲液 | PAA Laboratories GmbH | S11-001 | |
| 2 ml 匀浆管 | Sartorius AG | 854 2252 | |
| 盐酸 | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| 咪唑 | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Ingenuity 通路分析 | Qiagen | ||
| 碘乙酰胺 (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| 实验室钻孔驱动器 K-ControlTLC 4957 | Kaltenbach & Vogt GmbH | 182997 | |
| LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2 | Thermo Scientific | ||
| LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Scientific | ||
| Macs-mix 试管旋转混合仪 | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | |
| Magic Scan 4.71 | UMAX | ||
| 甲醇 | Carl Roth GmbH | AE71.2 | |
| MLS-50 转子 | Beckman Coulter | 367280 | |
| Optima MAX 超速离心机 | Beckman Coulter | 364300 | |
| PageRuler 预染蛋白 Marker | Thermo Scientific | 26616 | |
| PEAKS 7.5 | Bioinformatic Solutions | ||
| 磷酸酶抑制剂混合液 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
| PhosphoRS 3.1 | IMP/IMBA/GMI | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| 聚四氟乙烯 (PTFE) 制推杆/研杵 | Sartorius AG | 854 2651 | |
| PotterS 匀浆器 | Sartorius AG | 853 3024 | |
| 蛋白酶抑制剂完全 mini | Roche | 4693159001 | |
| Quantity One 4.5.1 | BioRad | ||
| RapiGest | Waters | 186002122 | |
| 穿梭箱 | Coulbourne Instruments | ||
| 十二烷基硫酸钠 (SDS) | AppliChem | A1112 | |
| 钼酸钠 | Carl Roth GmbH | 274.2 | |
| 酒石酸钠二水合物 | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| SONOREX RK 156 超声波清洗仪 | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | 305 | |
| 隔音室 | Industrial Acoustics Company | ||
| 蔗糖 | Carl Roth GmbH | 4621.2 | |
| 四甲基乙二胺 (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Thermomixer basic | CallMedia | 111000 | |
| Titansphere TiO 5µm | GL Sciences Inc. Japan | 502075000 | |
| TLA 100.1 转子 | Beckman Coulter | 343840 | |
| 三氟乙酸 (TFA) | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| 三(羟甲基)氨基甲烷 (TRIS) | AppliChem | A1086 | |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| 胰蛋白酶 Gold | Promega | V5280 | |
| Ultimate 3000 超高效液相色谱 | Dionex/Thermo Scientific | ||
| 超速离心管 | Beckman Coulter | 343776 | |
| Unijet II 冷却式抽吸泵 | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
| UNIVAPO 100 H 浓缩离心机 | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
| 尿素 | AppliChem | A1049 | |
| 水（高纯度纯化水） | 电阻率：> 18.2 MΩ*cm（25 °C） 内毒素：< 0.02 EU/ml 总有机碳 (TOC)：< 10 ppb | ||
| Xcalibur 3.0.63 | Thermo Scientific | ||
| ZipTipC18 吸头 | MILLIPORE | ZTC18S960 |
参考文献
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