支架支持的胰岛移植至糖尿病小鼠附睾脂肪垫

摘要

本方案演示了小鼠胰岛的分离及其在脱细胞支架上的接种。将支架支持的胰岛移植到链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠的附睾脂肪垫中。胰岛在移植部位存活，并逆转了高血糖状态。

摘要

胰岛移植在临床上已被证实对治疗1型糖尿病有效。然而，目前的肝内移植策略可能引发急性全血反应，并导致胰岛移植存活率较低。本文报道了一种在糖尿病小鼠模型中将胰岛移植至肝外部位——附睾脂肪垫（EFP）的可靠方案。文中描述了从C57BL/6J小鼠中高产量分离和纯化胰岛的流程，以及通过将胰岛接种于脱细胞支架（DCS）上，并将其植入经链脲佐菌素诱导糖尿病的同系C57BL/6J小鼠EFP部位的移植方法。含有500个胰岛的DCS移植物在10天内即可逆转高血糖状态，而未使用DCS的游离胰岛则至少需要30天。正常血糖水平可维持长达3个月，直至移植物被取出。综上所述，DCS可增强胰岛在肝外EFP部位的植入效果，且该部位易于获取，可能为研究支架材料及其他实现成功胰岛植入所需的移植参数提供一个可重复且实用的平台。

引言

1型糖尿病（T1D）是一种自身免疫性内分泌疾病，患者的胰岛细胞被免疫系统破坏，导致其终生依赖外源性胰岛素注射。埃德蒙顿方案（Edmonton protocol）是胰岛移植临床研究中的一个里程碑；该方案通过门静脉输注胰岛，并将其移植至肝内部位¹。然而，供体胰岛来源不足和胰岛移植后植入效果差这两个主要障碍，限制了胰岛移植的广泛应用²。通常需要从三名尸体供体中获取胰岛才能逆转一名患者的高血糖状态；这主要是由于胰岛分离过程的得率较低以及移植后的胰岛丢失。特别是，尽管移植后的胰岛处于富氧血液环境中，但与血液的直接接触常引发即刻性血液介导的炎症反应（IBMIR），从而导致胰岛的急性丢失。从长期来看，患者体内胰岛的逐渐丢失被认为是临床组中糖尿病逆转率下降的原因，该逆转率在移植后第一年可达90%，至2年和5年时分别下降至30%和10%³。

胰岛移植到肝外部位已成为一种有吸引力的策略，可在将移植物限制于更明确位置的同时，减少胰岛与血液的直接接触，相较于肝内输注具有优势。近年来，已有研究在肾包膜、眼、肌肉、脂肪垫以及皮下空间等部位开展，结果表明这些部位的胰岛能够存活并发挥功能，恢复正常的血糖水平⁴。此外，这些部位的胰岛可被取出，使得活检甚至后续的替换操作成为可能。因此，肝外部位在临床移植中展现出巨大潜力

方案

所有实验均经北京大学实验动物福利与使用委员会（IACUC，批准号：COE-LuoY-1）批准。

1. 胰岛分离

1. 试剂与仪器的准备
   1. 将胶原酶P粉末（2 U/mg）用HBSS重悬，配制成5 mg/mL溶液，并通过一个滤器过滤 0.22 µm 过滤以去除细菌。在15 mL锥形管中制备含胶原酶P的0.6 mL分装溶液，并于-20 °C.
      注意：使用时，每份等分试样用HBSS稀释，配制成6 mL工作液，终浓度为0.5 mg/mL或1 U/mL（足以处理3只小鼠）。工作液置于冰上，供1小时内立即使用。工作液不得重复使用或再次冷冻。
   2. 通过向HBSS中加入FBS（2.5%）和P/S（1%）配制中和溶液；将溶液置于冰上保存。每处理6只小鼠需准备60 mL中和溶液。
   3. 在RPMI 1640培养基中添加D-葡萄糖（7 mM）、胎牛血清（10%）和青霉素-链霉素溶液（1%），配制胰岛培养基。
   4. 对手术器械进行高压灭菌 115 °C 30分钟，15 psi压力。
2. 胰腺的膨胀。
   1. 按照步骤1.1.1所述，为6只小鼠（12周龄）配制12 mL胶原酶工作液。用9 mL工作液填充10 mL注射器，并将注射器连接至27 G静脉穿刺针。将注射器置于冰上保存，....

结果

与结扎缝合技术相比，我们采用显微止血钳进行夹闭的方法更为简便且节省时间。从6只小鼠中分离并纯化约1,200个胰岛大约需要4小时。在光学显微镜下，新分离的胰岛通常边缘粗糙（图3A）。胰岛在经历分离过程后恢复一段时间，会呈现明亮、致密的形态，并具有光滑的表面。然而，分离过程带来的应激仍可能诱导细胞死亡，导致胰岛表面细胞脱落，不健康的胰岛常含有深色坏死核心（图3B）。我们测量了来自5只小鼠的945个胰岛的直径，计算得出胰岛平均直径为130.42 ± 41.75 µm（图3C）。

为避免受体产生免疫排斥，我们在C57BL/6J小鼠中进行了同系移植。通常，将500个负载DCS的胰岛移植至EFP部位，可在10天内逆转高血糖，而游离胰岛组则需30天。血糖正常水平可维持约100天，直至移植物.......

讨论

胰腺灌注和消化时间是影响胰岛产量和质量的两个关键参数。Moskalewski 首次报道使用粗制胶原酶混合物消化剪碎的豚鼠胰腺¹¹。Lacy et al. 报道了将酶注入导管系统以灌注胰腺，显著提高了胰岛产量¹²。通过导管灌注酶可使胰腺表面积最大程度地暴露于酶中，与消化剪碎的胰腺相比，能够实现更均匀的消化，并释放出更多完整的胰岛¹³。根据我们的经验，成功插管胆管并完成整个胰腺的灌注是获得高胰岛产量的前提条件。这是因为与靠近十二指肠的胰腺组织相比，胰腺尾部（脾叶）实际上含有更多的胰岛。文献中报道了两种胆管插管方法：i）在靠近肝脏的位置插入针头，同时阻止酶进入十二指肠^13,14；ii）在靠近十二指肠的位置插入针头，同时阻止酶进入肝脏¹⁵。本文采用后一种技术，该方法无需弯曲针头或重新定位小鼠。按照本方案，一名训练有素的研究.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
解剖剪	Ningbo Medical
镊子	Ningbo Medical
0.5 mm 直径金属网	Ningbo Medical
70 μm 细胞筛	Falcon	352350
动脉止血钳	Ningbo Medical
显微止血钳	Ningbo Medical
止血钳	Ningbo Medical
可吸收性6-0 PGLA缝合线	JINHUAN		带针
伤口夹	Ningbo Medical
棉签	Ningbo Medical
纱布	Ningbo Medical
无菌铺巾	Ningbo Medical
10 mL 注射器	JINGHUAN
1 mL 注射器	JINGHUAN
27G 静脉注射针头	JINGHUAN	0.45x15 RWSB
1.5 mL Eppendorf 管	Axygen
15 mL 锥形管	Corning	430791
50 mL 锥形管	Corning	430829
35 mm 未经处理 培养皿	Corning	430588
Transwell 小室	Corning	3422
0.22 μm 滤器	Pall	PN4612
10 mL 血清移液管	Corning	4488
移液器吸头 S1	Thermo Scientific	9501
移液器（2–20 μL）	Axygen	AP-20	AXYPETTM
解剖显微镜	Olympus	SZ61
离心机	Eppendorf	5810R
Hank’s 平衡盐溶液	Gibco	C14175500CP
胶原酶 P	Roche	COLLP-RO
Histopaque 1077	Sigma	10771
RPMI 1640	Gibco	11879-20
FBS	Gibco	16000-044
D-葡萄糖	Gibco	A24940-01
血糖仪	Roche		ACCU-CHEK
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
链脲佐菌素	Sigma	V900890	VetecTM
水合氯醛	J&K	C0073
柠檬酸钠	Sigma	71497
柠檬酸	Sigma	C2404
碘伏	Ningbo Medical
C57BL/6J，10–12 周龄	VitalRiver		中国北京
脱细胞支架	冠昊生物	131102	中国广州