采用改良套管技术的小鼠胰腺移植模型

摘要

在腹部实体器官移植中，胰腺移植物容易发生严重的缺血再灌注损伤相关性移植物损害，最终导致早期移植物丢失。本方案描述了一种采用无缝线套环技术的小鼠胰腺移植模型，非常适合用于分析这些早期有害性损伤。

摘要

小鼠模型在移植研究中具有多种优势，包括易于操作、拥有大量遗传背景明确的品系，以及可获得最广泛的分子探针和试剂用于实验 体内 以及 体外 研究。基于我们对多种小鼠移植模型的经验，我们建立了一种小鼠异位胰腺移植模型，旨在分析严重缺血再灌注损伤相关早期移植物损伤的潜在机制。与既往描述的缝合技术不同，本文介绍了一种采用无缝合套管技术的新手术方法。

近年来，我们已在小鼠身上完成了超过300例胰腺移植手术，总体成功率超过>90%，这一成功率在小鼠胰腺移植领域前所未有。这种无缝合套管技术用于移植物血管重建的核心步骤包括两个主要环节：（I）将受体血管拉过聚乙烯/聚酰胺套管，并用环形结扎线固定；（II）将供体血管套入外翻的受体血管之上，并用第二道环形结扎线固定。由此形成的内皮层连续性可显著减少血栓形成性病变，实现高通畅率，最终达成高手术成功率。

在此模型中，通过将供体移植物的腹主动脉拉至受体动物翻转的颈总动脉上，完成动脉吻合。移植物的静脉引流则通过将移植物的门静脉拉至受体翻转的颈外静脉上来实现。本文详细描述了器官获取与器官移植手术的关键步骤，使具备显微外科技能的研究人员能够在其实验室中成功开展移植手术。

引言

胰肾联合移植（SPK）目前是治疗糖尿病合并终末期肾病患者的标准疗法。成功的移植可实现长期的胰岛素脱离，同时伴随糖尿病微血管病变的稳定甚至逆转，并显著提高患者的生活质量¹。然而，与其他常见的实体器官移植（如肾移植和肝移植）相比，胰腺移植物更易受到缺血再灌注损伤（IRI）的影响。据报道，其发生率高达35%，不仅威胁移植物存活，甚至可能影响患者的生存^2,3。

氧化应激、微循环障碍、促炎性细胞因子和黏附分子表达增加，最终导致内皮细胞活化及其完整性丧失，这些均被认为是非同种异体移植物损伤的原因⁴。迄今为止，缺血-再灌注损伤（IRI）的确切分子机制在很大程度上仍不清楚，且可能因器官不同而有所差异。

尽管在利用体外（in vitro）模型方面已取得重大进展，但动物模型的建立对于深入理解胰腺移植后与缺血-再灌注损伤（IRI）相关的移植物改变的分子机制至关重要。已有多种胰腺移植模型在啮齿类动物中建立^5,6，但仅有一种在小鼠中报道⁷。这一高度复杂的显微外科手术的主要缺陷是术后存活率较低，仅为46%。然而，小鼠模型是移植相关研究的最佳模型，因为可对其应用最广泛的分子分析工具。基于在小鼠多种器官移植中积累的丰富显微外科经验^8,9,10，我们开发出一种新的、高度可重复的小鼠异位颈部胰腺移植技术，采用无缝合套管法，成功率超过>90%。该技术显著减少了吻合相关并发症的发生，并与缝合技术相比实现了更高的成功率¹¹。迄今为止，仅有Liu et al¹²报道过一种成功率相近的小鼠模型，但尚未有研究应用该模型发表。

方案

为避免同种免疫反应，并严格研究缺血再灌注损伤相关的移植物损害，应采用同系型供体-受体配对。在本方案中，使用雄性C57BL6（H2^b使用体重为26至28克的10至12周龄小鼠作为体型匹配的供体-受体配对。所有动物均饲养于无特定病原体屏障设施中，并按照符合 "实验室动物护理原则" 由美国医学研究学会和 "实验动物护理和使用的指南" 由美国国家科学院制定，并由美国国立卫生研究院出版（NIH 出版物编号 86-23，1985 年修订版）。本手稿中所述实验已获得奥地利教育、科学与文化部批准（BMWF-66.011/0056-II/3b/2011）。

1. 胰腺获取

1. 使用27号（G）针头，通过腹腔内（i.p.）注射赛拉嗪（5 mg/kg体重）和氯胺酮（100 mg/kg体重）对供体动物进行麻醉。
2. 使用电动剃毛器剃除腹部区域的毛发，并用胶带将小鼠仰卧位固定在手术区域。
3. 用浸有氯己定的纱布对手术区域进行三次擦拭消毒。
4. 使用剪刀沿中线行腹部切口，并向双侧肋缘下延伸。用无菌棉签轻轻将内脏向左外翻，并用湿润纱布包裹。用蚊式钳向上提起剑突，以充分暴露腹腔，便于后续操作。
5. 使用19 G针头，向下腔静脉（IVC）注入400 µL无菌的1:4肝素-氯化钠溶液以实现肝素化。拔出针头后，通过横断主动脉放血的方式处死动物。
6. 用弯头镊子轻轻分离纤维组织，在肠系膜上动脉起始处与右肾动脉之间解剖腹主动脉。游离腹主动脉下方并用8/0丝线结扎。
7. 辨认连接幽门后段十二指肠与肝脏门部的肝十二指肠韧带。在远端结扎后，于胆囊管汇入处下方切断胆管，并尽可能向远端游离并横断门静脉，以保留足够长度用于受体的吻合操作。
8. 使用弯头镊子从先前结扎处（见步骤1.6）开始钝性分离腹主动脉。用弯头镊子游离主动脉周围组织，以8/0丝线结扎，并用剪刀横断。
   1. 使用双极电凝镊凝固所有腰动脉分支，并尽可能靠近膈肌处用剪刀横断主动脉，以保证血管吻合所需的足够长度。最后，在左肾动脉上方横断已结扎的主动脉。
9. 通过腹主动脉顺行灌注，使用19 G注射器将5 mL 4 °C的组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐（HTK）灌注液灌入胰腺，直至门静脉流出液变清亮。操作时施加低压，以避免水肿形成。
   注意：为避免因温缺血导致移植物损伤而引入偏倚，步骤1.5至1.9应快速且标准化地完成。
10. 使用无菌棉签将内脏复位至腹腔内。
11. 使用弯头镊子从幽门后段十二指肠开始逐步分离胰腺，向前推进直至屈氏韧带。在此过程中，辨认胰腺与十二指肠壁之间的无血管结缔组织区域。
    1. 用弯头镊子钝性分离这些区域，以游离胰腺与十二指肠之间的桥接血管。对每一根游离出的血管结构绕行8/0丝线并结扎。
    2. 最后，用剪刀朝向十二指肠壁方向横断该血管结构。以相同方式，使用8/0丝线将胰腺与肠系膜、横结肠及胃部分离。
       注意：此过程中应结扎胆胰管。
12. 将胃向上提起，辨认从脾脏至胃的胃脾韧带及短胃支，并用剪刀切断。保留脾脏附着于获取的移植物上。
    注意：为最大限度减少移植物复温，应持续使用装有冰上保存的4 °C HTK灌注液的10 mL注射器（配19 G针头）对胰腺进行冲洗。
13. 最后，用镊子夹住脾脏，将胰腺从供体部位取出（图1B），并转移至受体动物。
    1. 另可选择：为诱导严重的缺血-再灌注损伤，在将移植物植入受体动物前，将其置于无菌、4 °C的灌注液中保存16小时。

2. 受体准备

1. 使用27 G针头，通过腹腔注射给予受体动物赛拉嗪（5 mg/kg体重）和氯胺酮（100 mg/kg体重）进行麻醉。
2. 使用电动剃毛器剃除右侧颈外侧区域的毛发，将小鼠仰卧位放置于手术区域，并用胶带固定四肢。注意避免过度拉伸前肢，以免影响呼吸。
3. 使用浸有氯己定的纱布对手术区域进行三次擦拭消毒。
4. 从颈静脉切迹至右侧下颌角做一条右侧旁正中、略呈斜向的皮肤切口。
5. 钝性分离并游离右侧颈外静脉的侧支分支，使用双极电凝镊凝固后，用剪刀切断。
6. 将下颌下唾液腺的右叶向头侧抬起，辨认其血管蒂，使用双极电凝镊进行电凝，随后用剪刀切断已电凝的血管蒂，移除腺体组织。
7. 参照步骤2.5，辨认颈外静脉的所有内侧分支，使用双极电凝镊电凝后，用剪刀切断。用弯头镊尽可能向头侧游离颈外静脉，并使用两根8/0丝线结扎，两结扎线之间保留适当间距。
8. 用直剪刀在先前放置的两根结扎线之间切断颈外静脉。
9. 将颈外静脉近端穿过聚乙烯套管（内径0.75 mm，外径0.94 mm），并用静脉微血管夹固定套管手柄。
10. 剪除血管残端的结扎线，将血管外翻覆盖于套管上，并用一圈8/0丝线环扎固定外翻的血管（图1A）。
11. 在近端和远端电凝右侧胸锁乳突肌的浅层部分，用剪刀切断并移除该部分肌肉组织。
12. 轻柔游离颈总动脉，于分叉下方钝性分离，并使用两根结扎线进行结扎，注意避免结扎颈动脉分叉处。在两结扎线之间剪断血管。
13. 参照步骤2.9，将颈总动脉近端穿过聚酰胺套管（内径0.57 mm，外径0.6 mm），并用动脉微血管夹固定。
14. 剪除血管残端的结扎线，使用血管扩张器轻柔扩张管腔。将血管外翻覆盖于动脉套管上，并用一根8/0丝线固定（图1A）。

3. 植入

1. 使用脾脏作为操作手柄，将移植物放置到受体颈部区域，头部朝向外侧，尾部连同脾脏朝向内侧，血管残端朝向腹尾侧。使用棉签将移植物调整至正确位置。
2. 轻轻将胰腺移植物的门静脉拉至受体动物已外翻的颈外静脉上，并固定在相应的套管上（参见步骤2.10）。用环形8/0丝线结扎固定。
3. 将移植物腹主动脉残端拉至受体动物外翻的颈总动脉上。用环形8/0丝线结扎固定（图1C）。
4. 在脾门附近识别脾血管，用弯头镊子从下方分离血管。使用8/0丝线结扎并横断脾血管以切除脾脏。最后剪短结扎线。
5. 使用持夹钳，先移除静脉套管上的夹子，再移除动脉夹。
   注意：若移植成功，胰腺移植物将立即再灌注，呈现均匀的粉红色，并可见动脉搏动（图1D）。
6. 用常温生理盐水润湿移植物。
7. 使用直头镊子移除静脉套管的手柄部分。
8. 用连续缝合的6/0缝线关闭手术切口。

4. 术后护理（终点）

1. 操作后，使用19 G针头皮下注射（s.c.）最多0.5 mL生理盐水，以补充术中液体丢失。
2. 将受体动物置于加热垫上，直至其完全从麻醉中恢复。
3. 清醒后，将受体动物送回饲养设施，可自由摄取食物和饮水（ad libitum）。
4. 为预防术后疼痛，手术结束后立即给予：(1) 丁丙诺啡（0.1 mg/kg 体重）每12小时一次，持续前5天；(2) 卡洛芬 4 mg/kg 体重，每12小时皮下注射一次，持续第一周。
5. 为评估营养摄入是否充足，每日监测每只受体动物的体重（g）。若体重较手术当天下降超过10–15%，或出现精神萎靡、行动困难、背部严重弯曲以及手术部位感染等情况，即达到实验终点。
   1. 在此情况下，或达到临床终点后，采用终末期异氟烷吸入法处死动物。

结果

在过去十年中，我们完成了超过300例小鼠胰腺移植手术。在建立该方案后，总体生存率>90%。术后出血是导致手术失败的主要原因，其次是移植物血栓形成继发致死性坏死性移植物胰腺炎。在这两种情况下，动物均在24小时内达到实验终点并被实施安乐死。本系列实验中未出现任何神经系统疾病、吞咽困难等症状以及外科手术部位感染。

为了研究移植移植物的内分泌功能，从而验证该模型的可行性，在手术前4天，通过单次腹腔注射链脲佐菌素（312.5 mg/kg 体重）诱导受体小鼠出现高血糖。若小鼠血糖水平>300 mg/dL，则被视为高血糖状态。图2A展示了不同组小鼠的血糖水平。接受未经历16小时长时间冷缺血的移植物的小鼠在移植后24小时内恢复至正常血糖水平，并在整个观察期间维持该代谢状态。相比之下，未接受移植的小鼠则持续处于高血糖状态。由于我们关注缺血再灌注损伤相关移植物损伤对内分泌功能的影响，因此增设第三组，该组移植物经历16小时长时间冷缺血时间（CIT）和45分钟暖缺血时间（WIT）。接受此类移植物的小鼠未能恢复至正常血糖水平，并因发生严重胰腺炎而在48小时后被实施安乐死，此前研究已证实该模型中此类情况具有致死性¹³。

该模型适用于多种旨在研究缺血再灌注损伤相关早期移植物损伤的项目。进一步的研究包括移植后2小时进行的共聚焦活体荧光显微镜检查，用于量化微循环紊乱。通过向阴茎静脉注射0.3 mL浓度为0.4%的异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（分子量150 000），增强移植物微血管的对比度。图2B显示了未经长时间冷缺血时间（CIT）处理的小鼠胰腺移植物以及正常小鼠胰腺的规则毛细血管模式（图2C）。相比之下，图2D显示了因长时间CIT导致胰腺移植物微循环破坏的情况。

图1：术中图像。（A）用于吻合的受体血管术中观。颈外静脉（1）已外翻并套入静脉聚乙烯套管，并用环形8/0丝线结扎固定。类似地，颈总动脉（2）已外翻并固定于较小的动脉聚酰胺套管上。标尺：1 mm。（B）离体胰腺移植物。门静脉（1）和用于血管吻合的腹主动脉残端（2）。脾脏（3）与胰腺一同获取，并用作操作手柄。在移植物再灌注前将切除脾脏。标尺：1 cm。（C）吻合口术中观。门静脉（1）被拉过外翻的颈外静脉（2）套管并用环形8/0丝线结扎固定。类似地，腹主动脉残端（3）被拉过外翻的颈总动脉（4）套管。标尺：1 mm。（D）再灌注5分钟后灌注良好的胰腺移植物术中观：静脉夹移除后，继而松开动脉夹，成功移植的胰腺移植物呈现均匀的粉红色。再灌注前已切除脾脏（1：结扎的脾血管）。标尺：1 cm。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：胰腺移植物的内分泌功能及活体共聚焦 在体荧光显微镜观察。图2A 显示了未接受冷缺血处理（CIT）的移植小鼠（n = 10，PTX w/o CIT，蓝线）、未移植小鼠（n = 11，无PTX，红线）以及接受长时间冷缺血处理移植物的小鼠（PTX + 16 h CIT，n = 10，绿线）的血糖水平折线图。所有受体小鼠均通过腹腔注射312.5 mg/kg体重的链脲佐菌素（streptozotocin）诱导为高血糖状态。所有接受无CIT处理移植物的小鼠在整个观察期（50天）内均存活，并维持正常的内分泌功能；而未移植小鼠在整个观察期间持续处于高血糖状态。接受经16小时CIT处理移植物的小鼠未能恢复血糖正常水平，并因体重下降超过10-15%，在移植手术后48小时被实施安乐死。完成整个观察期存活的小鼠在第50天进行最后一次血糖测量后被安乐死。移植后2小时，采用共聚焦活体荧光显微镜评估移植移植物中的微循环情况，以未处理胰腺作为对照。图2B 显示正常胰腺中规则的毛细血管分布模式。在未经历长时间CIT的移植移植物中也可见规则的毛细血管网络（图2C）。相比之下，在经历长时间CIT的移植移植物中观察到微循环结构的破坏（图2D）。比例尺：100 µm。图中数据以±标准差表示。PTX：胰腺移植；CIT：冷缺血时间；w/o：无 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

与缺血-再灌注损伤（IRI）相关的移植物损伤是实体器官移植中固有的问题，其特征是微循环障碍。在缺血阶段多种代谢产物积聚，再灌注期间主要由活性氧和活性氮介导的炎症级联反应被激活，从而导致移植物组织损伤⁴。这一级联反应不仅可能危及移植的短期效果，还可能影响长期预后，因而显著影响患者的生存率¹⁴。迄今为止，肾胰联合移植是治疗终末期肾病合并1型糖尿病患者的首选疗法¹⁵。多项研究表明，成功的肾胰联合移植不仅能恢复并保护糖尿病受者中肾移植物的功能，还能稳定甚至逆转包括神经病变以及微血管和大血管病变在内的多种继发性并发症^16,17,18。

尽管在动物研究中持续推行“减少、替代、优化”（3R原则），但诸如缺血-再灌注损伤（IRI）等复杂病理生理过程在体外（in vitro）条件下仍几乎无法重现。因此，动物模型目前仍被视为转化研究的理想工具^19,20。与大鼠或其他动物模型相比，本文所述的小鼠模型具有多项优势，包括可获得大量遗传背景明确的近交系小鼠品系（例如 转基因和基因敲除品系）、丰富的分子分析工具，以及操作简便且成本低廉²¹。该模型的一个主要优势在于采用无缝合套管技术。通过使用本文所述技术，可实现>90%的成功率，显著优于以往报道的模型²²。采用这种无缝合技术，我们显著减少了低血容量性休克、血栓形成以及吻合口狭窄等常见并发症的发生¹²。该方法的另一优势在于移植物位于腹腔外，有利于受体术后快速恢复。此外，颈部移植位置非常适用于活体（in vivo）分析，例如在无张力条件下通过移植物外置进行活体成像²²。

该模型的主要缺点是胰管的阻塞，这与临床实际情况不符。在此模型中，外分泌引流通过结扎胆胰管来实现。长期来看，这会导致腺体出现明显纤维化和萎缩，但不会引发移植物胰腺炎²²。由于我们观察到外分泌组织的这种退化早在移植后第30天即已出现，因此认为该模型不适合用于长期观察。相比之下，内分泌功能未受影响，使得受体的血糖监测成为评估移植物功能的一种简便的日常手段^13,23,24。

这些特性使得该模型成为分析与长时间保存或不同保存溶液及技术相关的早期移植物损伤的理想选择。为了在此模型中获得最佳成功，必须考虑若干关键步骤。胰腺本身对操作极为敏感，因此在器官获取和移植过程中使用棉签轻柔操作，可最大限度减少机械性损伤。应避免使用镊子直接夹取腺体，因为这不可避免地会导致严重的移植物损伤。出于同样原因，脾脏与胰腺一同获取，并作为操作手柄使用，这在临床实践中也已确立。另一个需要注意的问题是冷灌注，通过主动脉残端使用4 °C的组氨酸-色氨酸-酮戊二酸（histidine-tryptophan-ketoglutarate）灌注液进行灌注。通过轻柔灌注移植物，可避免腺体过度肿胀。剩余的灌注液应用于润湿移植物，以在器官获取期间保持其低温状态。

在受体准备方面，仔细分离双侧颈外静脉和颈总动脉是成功进行血管重建的基础。尤其需要完全暴露静脉，不仅要切断所有属支，还需清除周围脂肪组织，以避免残留脂肪组织造成的外部压迫和狭窄。选择合适的套管直径至关重要。根据共同经验，对于体重在25至28克的小鼠，动脉套管内径宜为0.57毫米，静脉套管内径则宜为0.75至0.8毫米。必须精确、整齐地切割套管边缘，以防止撕裂血管残端。血管（尤其是动脉）的扩张最好使用尖端精细的血管扩张器来完成。一般经验是，血管应能扩张至套管管腔直径的两倍。在将血管外翻并固定于套管上的过程中，建议将血管夹置于皮瓣下方以固定其位置，从而便于完成这一关键步骤。

如前所述，无缝线套管技术是一种简便的血管吻合方法，可在5分钟内完成。然而，移植物在受体颈部区域的正确位置对于实现准确的再血管化至关重要。因此，必须预先考虑到移植物在颈部区域的最终正确位置，以确保静脉和动脉均能安全、平直且无张力地完成吻合。应避免使用过长的血管，因为这可能导致因扭曲而引起的流出道梗阻。出于同样原因，在静脉吻合后，一旦恢复血流，应立即移除静脉吻合处的套管手柄。对于胰腺移植物局部出血的情况，可通过棉签轻轻压迫出血部位5分钟来成功止血，这是处理此类并发症的唯一有效方法。即使电凝止血具有高度选择性，也几乎在所有情况下均导致移植物因坏死性胰腺炎而丧失功能。

综上所述，我们建立了一种采用无缝合套管技术的小鼠胰腺移植方法，该技术在显微外科操作上可行，且成功率高。由于导管阻塞导致胰腺进行性纤维化，该模型最适合用于研究早期移植物损伤的相关领域。本文旨在帮助研究人员在其实验室中安全地建立该模型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
外膜剪	S&T	S-00102	直型
Dumont #7 镊子	FST	11271- 30	弯曲尖端 0.17 × 0.1 mm
Yasargil 7 mm微型永久夹	Aesculap	FE720K
微血管夹	S&T	B1 00396 V
血管扩张器	S&T	D-5a.2, 00125
血管夹施夹器	S & T	CAF-4 00072	用于静脉套管
血管夹施夹器	Aesculap	FE572K	用于动脉套管
聚乙烯管	Portex Ltd		内径 0.75 mm，用于静脉套管
聚酰亚胺管	Vention Medical	141-0051	内径 0.8 mm（可替代 Portex Ltd 的聚乙烯管）
聚酰亚胺管	Vention Medical	141-0033	内径 0.57 mm，用于动脉套管
双极电凝镊	Micromed	140-100-015
8/0 丝线结扎线	Catgut GmbH, Merkuramed	17209008
Custodiol HTK 溶液	Dr. Franz Köhler Chemie	59997
氯胺酮 Graeub	aniMedica GmbH	32554
赛拉嗪 Graeub	aniMedica GmbH	50855