此处描述了制备的实验方案 果蝇 在不同发育阶段进行纵向光学成像 果蝇 使用定制的光学相干显微成像（OCM）系统对心跳进行成像。通过分析OCM图像中的心脏结构和功能参数，可对心脏的形态学和动态变化进行定量表征。
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摘要
摘要
对小型动物心跳的纵向研究有助于理解心脏发育过程中的结构和功能变化。光学相干显微成像技术（OCM）已被证明能够以高空间分辨率和超高速成像能力对小型动物心脏进行成像。由于其高图像对比度和非侵入性特点，OCM非常适合开展无需组织解剖或染色的纵向研究。Drosophila 因其大量与人类疾病相关的同源基因、与脊椎动物相似的分子机制和遗传通路、较短的生命周期以及低廉的培养成本，已被广泛用作心脏发育研究的模式生物。本文描述了利用自主设计的OCM系统，在整个样本生命周期中对Drosophila进行制备并对其心跳进行光学成像的实验方案。按照本报告提供的步骤，可获取横向M模式和三维OCM图像，用于开展Drosophila心脏形态与功能的纵向研究。同时，还展示了en face 和轴向截面OCM图像，以及心率（HR）和心脏活动期（CAP）直方图，结合由M模式图像构建的视频直观追踪心脏活动，以分析心脏结构变化并量化Drosophila变态过程中的心脏动态。由于Drosophila与脊椎动物之间具有较高的遗传相似性，对果蝇心脏形态和动态的纵向研究有助于揭示人类心脏病的起源。本实验方案将为开展多种研究提供一种有效方法，以深入理解人类心脏疾病的发病机制。
引言
对小型动物心脏的纵向研究有助于理解多种与人类相关的心血管疾病，例如基因相关的先天性心脏缺陷1,2。在过去几十年中，多种动物模型，如小鼠3,4、非洲爪蟾5,6、斑马鱼7,8、鸟类9和Drosophila10-16，已被用于开展与人类心脏发育相关的研究。由于小鼠心脏与人类心脏具有相似性，该模型已被广泛用于研究心脏的正常与异常发育以及心脏缺陷表型3,4。非洲爪蟾胚胎因其易于操作和部分透明的特性，在心脏发育研究中尤为有用5,6。斑马鱼模型的胚胎和早期幼体具有透明性，便于对心脏发育进行光学观察7,8。鸟类模型是心脏发育研究的常用对象，因为去除蛋壳后可直接接触心脏，且鸟类心脏在形态上与人类心脏具有相似性9。Drosophila 模型具有一些独特优势，使其成为开展心脏纵向研究的理想选择。首先，Drosophila 的心脏管位于背侧表面下约 200 µm 处，便于光学观察和访问。此外，Drosophila 与脊椎动物之间在许多分子机制和遗传通路上具有保守性。在 Drosophila 中已发现超过 75% 的人类疾病基因的直系同源基因，这使其在转基因研究中得到广泛应用11,13。此外，其生命周期短、维护成本低，长期以来被普....
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方案
1. 光学成像用OCM系统的准备 果蝇16
- 选择一台光谱仪和一个高速线扫描相机，该相机的帧率至少为 80 帧/秒，以便 OCM 系统能够分辨心跳 果蝇.
- 使用宽带光源以确保轴向分辨率 2 µm 识别心脏结构 果蝇.
- 使用10倍物镜以获得高横向分辨率。
- 使用一个 45° 使用棒状反射镜反射参考臂光束，并生成环形样本臂光束，以扩展样品的焦深。
- 开发一个自定义计算机程序以控制OCM系统并执行测量。
2. Drosophila 培养
- 标准果蝇食物制备
- 加入约 5 ml 瞬时 果蝇 将公式通过纸槽辅助倒入聚苯乙烯小管中。
- 向配方中加入约 8 ml 水，以充分浸润食物。
- 为不同的实验向标准果蝇培养基中添加不同的补充成分。在准备所有实验时转录-retinal（ATR）食物，用于光遗传学起搏实验35使用移液器吸取100 mM ATR，溶于约8 ml水中，使食物中ATR浓度达到1 mM。充分混匀溶液后，将溶液倒入饲料中并充分搅拌。
- 为研究肥胖相关心脏功能障碍制备高脂饮食 果....
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结果
使用24B-GAL4/+品系的果蝇在室温下通过光相干显微镜（OCM）进行纵向心脏成像。测量时间点包括L2、L3以及从蛹期第1天（PD1）到第4天（PD4）每隔8小时一次，并持续至成虫第1天（AD1），以追踪变态发育过程（表1）。幼虫、早期蛹、晚期蛹及成虫果蝇均被固定于载玻片上，如图1A所示。幼虫和成虫果蝇心脏的节段特征在图1B的示意图中展示。
在本项发育研究中，使用我们定制的光学相干显微成像系统在32秒内采集了4,096帧图像，以追踪果蝇的心跳。为提高测量精度，对每个发育阶段的每个样本均进行了五次重复测量。还可获取三维数据，以观察果蝇在变态过程中心脏结构的变化。
使用自定义的 Matlab 程序和 ImageJ 生成了横向 M 型和三维图像。 正面 图像和轴向切面也由采集的数据构建而成，以可视化心脏重塑过程 果蝇 变态发育（图2）。为了定量分析果蝇的心脏功能.......
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讨论
快速的心跳 果蝇，幼虫和成年阶段的最大心率约为400 bpm，因此需要高速成像以分辨心脏的舒张与收缩相（根据经验，帧率不低于80帧/秒）。由于心脏腔室尺寸较小且心壁厚度在微米量级（5–10 µm），需具备高空间分辨率（优于2 µm）才能清晰分辨心管结构。本研究开发了一套高分辨率与超高速的光学相干显微成像（OCM）系统，采用具有600线/毫米透射光栅的光谱仪和2,048像素线阵扫描相机。线阵扫描相机提供20 kHz的A扫描速率，128帧/秒的成像帧率足以捕捉心脏动态 果蝇 在包括L2、L3、PD1、PD2、PD3、PD4、PD5及成虫在内的多个发育阶段记录心跳。光源为宽带超连续谱光源，中心波长约为800 nm，带宽约为220 nm，在组织中的轴向分辨率可达约1.3 µm。样品臂采用10X物镜，实现约3.9 µm的横向分辨率。由于心脏管状结构的 果蝇 位于背侧表面下方约200 µm处，需要数百微米的成像深度。可利用45°柱面镜产生环形照明光束，以扩展样品中的焦深。44灵敏度和3 dB下降距离分别确定为96 dB和600 µm，样品臂功率约为9 mW。使用定制的计算机.......
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披露
作者声明本研究不存在任何利益冲突。
致谢
本工作得到了理海大学启动基金、美国国立卫生研究院（NIH）（项目编号：R00EB010071 和 R15EB019704 资助 C.Z.，R15EB019704 资助 A.L.，R03AR063271 资助 A.L.，R01AG014713 和 R01MH060009 资助 R.E.T.）、美国国家科学基金会（NSF，项目编号 1455613 资助 C.Z. 和 A.L.）、阿尔茨海默病治愈基金（Cure Alzheimer's Fund，资助 R.E.T.）以及麻省总医院（麻省总医院研究执行委员会奖项资助 A.L.）的支持。M.C. 和 Y.M. 得到了中国国家重点基础研究发展计划（973 计划）（项目编号：2014CB340404）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 定制 OCM 成像系统 | 本实验室自主研发 | ||
| my Temp Mini 数字培养箱 | Benchmark | H2200-HC | |
| 盖玻片 | AmScope | 200PCS | |
| 棉球 | RITE AID | ||
| 速效果蝇培养基 | CAROLINA | formula 4-24 | |
| 酵母 | ActiveDry | ||
| 显微镜 | SONY | WILD M420 | |
| 毛刷 | Loew-Cornell | 245B | 用于移动样本 |
| Labview 软件 | National Instruments | ||
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| 镊子 | Wiha | AA SA | 用于固定果蝇翅膀 |
| FlyNap | Carolina Biological Supply Company | 4,224,898 | |
| Scotch 永久双面胶带，3 M | Scotch | ||
| 移液器 | Fisherbrand | MU18837 | |
| 有机特级椰子油 | Spring Valley | 13183 | |
| 显微镜载玻片 | CapitolBrand | M3504-E | |
| Drosophila 培养管 | SEOH | 8401SS | |
| 全反式视黄醛 | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |
参考文献
- Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. ....
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重印与许可
