在斑马鱼（Danio Rerio）中检测癌细胞的血管侵袭能力

摘要

该方法利用斑马鱼胚胎高效检测癌细胞的血管侵袭能力。将荧光标记的癌细胞注射至发育中胚胎的心前窦或卵黄囊内，24至96小时后通过尾部区域的荧光显微镜观察，评估癌细胞的血管内侵及外渗情况。

摘要

癌细胞的血管侵袭与外渗是转移进展的标志性特征。传统 体外 内皮细胞侵袭的癌症模型通常缺乏侵袭细胞原本所暴露的流体动力学环境 体内。然而， 体内 诸如小鼠模型等系统虽然生理相关性更高，但需要较长的实验周期，并在监测和数据分析方面带来独特挑战。本文描述了一种斑马鱼检测方法，旨在通过快速评估癌细胞的血管侵袭和外渗能力来弥补这一技术差距。该方法包括将荧光标记的癌细胞注射到透明的2日龄斑马鱼胚胎的心前窦中，其血管系统由一种对比性荧光报告系统标记。注射后，癌细胞需在循环系统中存活，并随后从血管外渗至胚胎尾部组织。通过在固定时间点对活体胚胎进行荧光成像，可高效识别并计数已外渗的癌细胞。通过将注射位点改为卵黄囊，该技术可进一步改造用于研究癌细胞的内渗过程和/或异质性癌细胞混合群体间的竞争行为。综上，这些方法可用于评估癌细胞的关键特征性行为，并有助于揭示向转移表型恶性进展的相关机制。

引言

转移性疾病是癌症死亡的主要原因，而许多促使癌细胞扩散的机制仍有待发现¹。癌细胞要成功发生转移，必须首先侵入原发性肿瘤周围的间质组织，进入（内渗）循环系统，在循环中存活，随后离开（外渗）循环系统，最终在远端器官部位建立可存活的转移灶²。因此，内渗和外渗是转移级联过程中的关键步骤，然而并非所有癌细胞都天然具备破坏并穿过内皮细胞连接的能力³。事实上，癌细胞的血管侵袭过程受到一系列独特选择压力的影响，并可进一步受到多种内源性和外源性因素的调控⁴。正因如此，研究晚期癌症侵袭行为的技术通常将血管侵袭能力作为预测转移扩散的重要指标。

存在多种模型系统可用于促进对癌细胞血管侵袭的研究 体外. 最常用的 体外 实验采用Transwell系统，以评估癌细胞穿过内皮屏障的迁移能力⁵ 或采用细胞电阻抗传感（Electric Cell-Substrate Impedance Sensing，ECIS）技术，实时监测癌细胞对完整内皮单层的破坏作用⁶这些检测通常缺乏影响癌细胞与血管内皮壁黏附的流体动力学和基质因素。通过将内皮细胞与支持性基质细胞进行三维共培养构建出可灌注的血管网络，可在一定程度上克服这一问题。目前，这类三维微流控系统代表了该领域的前沿进展 体外 选项^7,8然而，这些方法忽略了功能性循环....

方案

伦理声明：斑马鱼胚胎的制备遵循经批准的IACUC方案。这些实验严格按照乔治城大学动物护理与使用委员会的建议进行。

1. 准备用于注射的胚胎并配制储备溶液

1. 准备所需的斑马鱼幼鱼以评估癌细胞的血管侵袭。
   1. 使用Tg(kdrl:grcfp)zn1;mitfa^b692;ednrb1^b140斑马鱼进行成对或群体交配。
      注：我们通过将Tg(kdrl:grcfp)zn1²⁵（其在内皮细胞中表达绿色珊瑚荧光蛋白）与缺乏色素细胞的品系mitfa^b692;ednrb1^b140（由斑马鱼国际资源中心开发）杂交，获得了Tg(kdrl:grcfp)zn1;mitfa^b692;ednrb1^b140斑马鱼。
   2. 收集卵子，清洗，并在次日去除未受精或畸形的胚胎²²。
   3. 将胚胎在28.5 °C下孵育，直至可用于注射癌细胞，此时斑马鱼胚胎处于受精后2天（2 dpf）。
2. 制备注射用琼脂糖板。
   1. 每块板用25 ml ....

结果

本研究利用斑马鱼胚胎模型检测了几种常用乳腺癌细胞系的血管侵袭能力（图1）。在对不同细胞系的外渗情况进行评分时采用了严格的标准，仅当癌细胞明显发生外渗时才计为阳性事件，主要目的是减少因误将细胞碎片计数而导致的假阳性结果。

分析结果显示，在注射至心脏前腔后96小时评估侵袭情况时，各细胞系之间表现出显著差异（表1）。在测试的7种细胞系中，注射MDA-MB-231细胞系的斑马鱼胚胎每胚胎中渗出的癌细胞数量最多，这一发现与其公认的转移特性一致（图2）。我们还发现，BT-474细胞 readily 侵入胚胎尾部区域，而其他细胞系（如MCF-7、SK-BR-3和T-47D细胞）侵袭性极低（图3）。一个引人注意的发现是，大约一半注射MDA-MB-468细胞的斑马鱼胚胎在心脏区域出现水肿，这些样本未被计分。因此，在获得足够数量可用于外渗.......

讨论

该技术利用斑马鱼模型高效检测癌细胞的血管侵袭能力（见图1）。本文将该技术应用于一组乳腺癌细胞系，旨在提供一个基准，供其他研究者在此基础上开展各自的研究（见表1；图2 - 3）。观察发现MDA-MB-231细胞 readily侵入斑马鱼胚胎的尾部区域，表明该细胞系适用于测试可能抑制血管侵袭的药物或因子。相比之下，侵袭性较弱的细胞系（如HCC1806或MDA-MB-468细胞）则可用于研究能够增强血管侵袭能力的因素。若此类实验需要加入药物，则可根据预期治疗效应的持续时间选择两种不同的给药途径：可在将癌细胞注射入胚胎前对其进行药物预处理，或将药物直接加入饲养胚胎的水中，通过扩散作用影响癌细胞。

在我们的比较中，我们分析了癌细胞注射到斑马鱼胚胎心前窦后96小时时在尾部的外渗情况。对于MDA-MB-231细胞竞争实验，在卵黄囊注射后48小时评估癌细胞进入循环系统的内渗过程。所选择的分析时间点通常需要根据不同细胞系进行优化，某些实验中外渗高峰可能在注射后仅24小时即出现。值得注意的是，当向斑马.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	25300-054
100 mm 培养皿	康宁公司	3160-100
5 3/4" 一次性巴斯德吸管，硼硅酸盐玻璃	Fisher Brand	13-678-20B
60 mm 培养皿	康宁公司	3160-60
低熔点琼脂糖	Fisher	BP165-25
琼脂糖，分子生物学级别	Bioline	BIO-41026
毛细玻璃管，标准型，1.2 mm × 0.68 mm，4"	A-M Systems, Inc	627000
David Kopf 700C 垂直拉针仪	霍夫斯特拉团队	3600
DMEM	Life Technologies	11995-065
电极储存罐，1.0 mm	世界精密仪器公司	E210
盐酸三卡因甲磺酸盐（Tricaine，MS-222）	Fluka	A5040
睫毛刷	Ted Pella, Inc	113
胎牛血清，热灭活	Omega Scientific	FB-12
Fisherbrand 移液管	赛默飞世尔科技	13-711-7M
凝胶上样移液器吸头	Fisher Brand	02-707-181
玻璃底培养皿（12.0 mm）	赛默飞世尔科技	150680
玻璃凹片载玻片	VWR	470005-634
Instant Ocean 盐，海盐	Pentair	IS50
乳胶橡胶吸头，2 ml，每包72个	Heathrow Scientific	HS20622B
SP8 共聚焦显微镜	Leica
显微操作仪	Narishige
Eclipse E600	尼康
PBS	Life Technologies	10010-023
青霉素G钾	Fisher Biotech	BP914-100
培养皿，100 mm × 15 mm	Fisher Brand	FB0875713
Picospritzer II	General Valve Corporation
RPMI 1640培养基	Life Technologies	11875-093
硫酸链霉素	Fisher Biotech	BP910-50
Vybrant DiI	赛默飞世尔科技	V22885
Vybrant DiO	赛默飞世尔科技	V22886
斑马鱼	乔治城斑马鱼共享资源中心
细胞系在DMEM + 10% FBS中培养，BT-474和HCC1806细胞除外，后者在RPMI + 10% FBS中培养。