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在斑马鱼（Danio Rerio）中检测癌细胞的血管侵袭能力

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DOI：

10.3791/55007

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2016年11月3日

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Lombardi Comprehensive Cancer Center, Georgetown University

通讯作者： Anton Wellstein <wellstea@georgetown.edu>, Eric Glasgow <eg239@georgetown.edu>

本文内容

摘要

该方法利用斑马鱼胚胎高效检测癌细胞的血管侵袭能力。将荧光标记的癌细胞注射至发育中胚胎的心前窦或卵黄囊内，24至96小时后通过尾部区域的荧光显微镜观察，评估癌细胞的血管内侵及外渗情况。

摘要

癌细胞的血管侵袭与外渗是转移进展的标志性特征。传统 体外 内皮细胞侵袭的癌症模型通常缺乏侵袭细胞原本所暴露的流体动力学环境 体内。然而， 体内 诸如小鼠模型等系统虽然生理相关性更高，但需要较长的实验周期，并在监测和数据分析方面带来独特挑战。本文描述了一种斑马鱼检测方法，旨在通过快速评估癌细胞的血管侵袭和外渗能力来弥补这一技术差距。该方法包括将荧光标记的癌细胞注射到透明的2日龄斑马鱼胚胎的心前窦中，其血管系统由一种对比性荧光报告系统标记。注射后，癌细胞需在循环系统中存活，并随后从血管外渗至胚胎尾部组织。通过在固定时间点对活体胚胎进行荧光成像，可高效识别并计数已外渗的癌细胞。通过将注射位点改为卵黄囊，该技术可进一步改造用于研究癌细胞的内渗过程和/或异质性癌细胞混合群体间的竞争行为。综上，这些方法可用于评估癌细胞的关键特征性行为，并有助于揭示向转移表型恶性进展的相关机制。

引言

转移性疾病是癌症死亡的主要原因，而许多促使癌细胞扩散的机制仍有待发现1。癌细胞要成功发生转移，必须首先侵入原发性肿瘤周围的间质组织，进入（内渗）循环系统，在循环中存活，随后离开（外渗）循环系统，最终在远端器官部位建立可存活的转移灶2。因此，内渗和外渗是转移级联过程中的关键步骤，然而并非所有癌细胞都天然具备破坏并穿过内皮细胞连接的能力3。事实上，癌细胞的血管侵袭过程受到一系列独特选择压力的影响，并可进一步受到多种内源性和外源性因素的调控4。正因如此，研究晚期癌症侵袭行为的技术通常将血管侵袭能力作为预测转移扩散的重要指标。

存在多种模型系统可用于促进对癌细胞血管侵袭的研究 体外. 最常用的 体外 实验采用Transwell系统，以评估癌细胞穿过内皮屏障的迁移能力5 或采用细胞电阻抗传感（Electric Cell-Substrate Impedance Sensing，ECIS）技术，实时监测癌细胞对完整内皮单层的破坏作用6这些检测通常缺乏影响癌细胞与血管内皮壁黏附的流体动力学和基质因素。通过将内皮细胞与支持性基质细胞进行三维共培养构建出可灌注的血管网络，可在一定程度上克服这一问题。目前，这类三维微流控系统代表了该领域的前沿进展 体外 选项7,8然而，这些方法忽略了功能性循环系统强大的微环境，因此只能部分替代 体内 模型

最广泛使用的 体内 小鼠是血管侵袭研究的常用模型，常用于进行实验性转移检测，因为该模型的转移过程在相对较短的时间内发生，且通常能够反映转移能力9这些实验通过将癌细胞直接注入循环系统，从而模拟转移的终末阶段，即癌细胞的血管外渗及在器官中的定植。根据癌细胞注射部位及最终分析器官的不同，实验性转移实验可分为不同类型。在第一种实验类型中，将癌细胞注射至小鼠尾静脉，随后监测癌细胞在肺部的定植情况10,11第二种实验方法包括进行心脏内注射，以引导转移性细胞定植于骨微环境。12-14，还包括大脑15在第三种实验中，将癌细胞注射至脾脏，以促进其在肝脏中的定植16 而第四条递送途径通过颈动脉将癌细胞输送至大脑17,18无论采用何种癌细胞递送方法，器官定植均被视为公认的实验终点，通常通过生物发光、组织学或基于PCR的技术来确定。尽管在小鼠体内进行实验性转移检测具有生理学优势，但这些实验仍需数周至数月才能完成并进行分析。

斑马鱼（Danio rerio）模型最近已成为研究癌症进展的一种新体系，与小鼠相比，该模型可在功能完整的循环系统中以更短的时间尺度评估癌细胞的血管侵袭能力19,2021-24。该方法利用一种透明的斑马鱼品系，其内皮细胞在kdrl启动子驱动下表达绿色珊瑚荧光蛋白报告基因，kdrl是斑马鱼中血管内皮生长因子的受体25。在该检测中，将标记有红色荧光标记物的癌细胞注射到2日龄胚胎的心前窦中。注射后48至96小时之间，可在荧光显微镜下高效地对已从血管系统侵袭至胚胎尾部区域的癌细胞进行计数。本文将该技术应用于一组常用的人类乳腺癌细胞系，以展示它们在血管侵袭能力上的显著差异。此外，我们还证明，将注射位点改为胚胎卵黄囊可研究异质性细胞间的相互作用，因为可使用不同荧光染料对癌细胞群体进行差异化标记，并注射到无荧光血管的斑马鱼胚胎中。在后一种检测中，注射后24至48小时，在尾部区域对侵入卵黄并进入血管系统的癌细胞进行计数。由于该模型高效且操作便捷，斑马鱼正被越来越多地用于在生理环境下快速检测癌细胞的血管侵袭能力。

方案

伦理声明：斑马鱼胚胎的制备遵循经批准的IACUC方案。这些实验严格按照乔治城大学动物护理与使用委员会的建议进行。

1. 准备用于注射的胚胎并配制储备溶液

  1. 准备所需的斑马鱼幼鱼以评估癌细胞的血管侵袭。
    1. 使用Tg(kdrl:grcfp)zn1;mitfab692;ednrb1b140斑马鱼进行成对或群体交配。
      注：我们通过将Tg(kdrl:grcfp)zn125（其在内皮细胞中表达绿色珊瑚荧光蛋白）与缺乏色素细胞的品系mitfab692;ednrb1b140（由斑马鱼国际资源中心开发）杂交，获得了Tg(kdrl:grcfp)zn1;mitfab692;ednrb1b140斑马鱼。
    2. 收集卵子，清洗，并在次日去除未受精或畸形的胚胎22。
    3. 将胚胎在28.5 °C下孵育，直至可用于注射癌细胞，此时斑马鱼胚胎处于受精后2天（2 dpf）。
  2. 制备注射用琼脂糖板。
    1. 每块板用25 ml 1.5%琼脂糖溶于dH2O中并加热融化。
    2. 将12 ml琼脂糖倒入100 mm × 15 mm的培养皿中，静置使其凝固。
    3. 重新加热剩余琼脂糖，然后将其倒入已凝固的琼脂糖板上。
    4. 立即放置一个切割好的玻璃模具（3 mm × 7.2 cm宽 × 7.5 cm长），使其与琼脂糖表面呈30度角，并位于培养皿中央。
      注：这将形成一个陡峭的60°壁和一个30°斜坡。
    5. 用胶带固定玻璃模具，并让琼脂糖完全凝固。
    6. 小心地移除玻璃模具，注意不要撕裂琼脂糖。
      注：模具可保存在4 °C的dH2O中。
  3. 用鱼水（0.3 g/L海盐）平衡注射板。
    1. 用蒸馏水冲洗板两次。
    2. 向板中加入10 ml鱼水，并置于摇床上平衡10分钟。
    3. 再次用鱼水进行第二次平衡。
  4. 将受精后2天（dpf）的胚胎转移至含有鱼水的培养皿中，按注射组进行分组22。
  5. 为每组准备注射后的恢复培养皿。确保恢复培养皿中含有10 ml鱼水，并添加青霉素（25 µg/ml）和链霉素（50 µg/ml）。
  6. 通过将4 ml缓冲三卡因储备液（4 mg/ml，10 mM Tris，pH 7）加入50 ml含青霉素和链霉素的鱼水中，配制2×三卡因溶液。
  7. 将15 mg低熔点琼脂糖溶解于10 ml 2×三卡因溶液中，制备用于固定的麻醉介质，以固定活体胚胎用于成像。
    注：固定介质由1.5%琼脂糖组成。
  8. 拉制显微注射针。
    1. 将玻璃毛细管放入垂直拉针仪中。使用20 mA电流和双线圈加热元件，拉制长锥形的微量移液管。

2. 使用脂溶性荧光染料标记癌细胞

  1. 在推荐的培养条件下维持癌细胞的生长。
    注：以下细胞系维持在 DMEM + 10% FBS 中：BT-474、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468 和 SK-BR-3。以下细胞系维持在 RPMI + 10% FBS 中：HCC 1806 和 T-47D。所有细胞系在培养期间均保持在 37 oC 和 5% CO2 条件下。
  2. 通过消化贴壁生长的癌细胞获得单细胞悬液。
    1. 先用 PBS 洗涤细胞，然后加入 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液处理。
      注：胰蛋白酶消化时间取决于具体细胞系。
    2. 细胞脱落后，使用含血清的细胞培养基中和胰蛋白酶溶液。
  3. 将中和后的细胞悬液在 200 × g 条件下离心 5 分钟，然后将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中用于细胞计数。
  4. 使用自动细胞计数仪对细胞悬液进行计数，并将 100 万个细胞重悬于 200 µl 培养基中。
    1. 注射前使用台盼蓝染色排除法检测细胞活力。
      注：仅应向斑马鱼胚胎中注射活细胞群体，因为死细胞的注射无法真实反映血管侵袭情况。
  5. 向癌细胞悬液中加入 2 µl 红色脂溶性染料，使终浓度为 1:100，充分混匀后于 37 °C 孵育 20 分钟。
    注：染料浓度和标记时间可能需要根据不同细胞系进行优化。
  6. 孵育结束后，向管中加入 1 ml 新鲜培养基，然后在 200 × g 条件下离心 5 分钟。
  7. 洗去癌细胞表面残留的荧光染料。
    1. 吸除细胞沉淀中的上清液，将沉淀重悬于 1 ml 新鲜培养基中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟。
    2. 重复洗涤步骤一次：吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 1 ml 新鲜培养基中，再次在 200 × g 条件下离心 5 分钟。
    3. 第三次重复洗涤步骤：吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 1 ml 新鲜培养基中，再次在 200 × g 条件下离心 5 分钟。
  8. 吸除上清液，将含有 100 万个标记细胞的细胞沉淀重悬于 500 µl 新鲜培养基中。
    注：可在培养基中添加 0.5 mM EDTA 以防止细胞聚集。

3. 将癌细胞注射至斑马鱼胚胎的前心窦

  1. 将显微注射分配系统连接至加压气源，并接通显微注射分配系统的电源。
    1. 踩下脚踏开关测试压力。针头夹持器应释放出短暂的气流脉冲。
  2. 用2倍浓度的三卡因溶液对注射板进行两次平衡处理。
    1. 每次平衡步骤中，向注射板中加入20 ml的2倍浓度三卡因溶液，并置于摇床上震荡10分钟。
  3. 使用塑料移液管将一组胚胎转移至含有2倍浓度三卡因溶液的小培养皿中。
  4. 使用加样枪头将癌细胞回填至显微注射针头内。
    1. 将针头放入电极储存罐中，尖端朝下，使细胞沉降到针尖附近。
  5. 用塑料移液管吸取足量的2倍浓度三卡因溶液，将20–30个麻醉后的胚胎转移至注射板中。
    1. 让胚胎在移液管尖端沉降。
    2. 轻柔地将胚胎挤入注射板的槽道中，并沿槽道长度方向分散开。
    3. 将胚胎排列整齐，头部朝上，腹部朝向槽道的陡坡侧。
      注意：三卡因溶液应覆盖整个槽道长度及平坦的琼脂糖表面，但胚胎仅位于槽道内。此时胚胎已准备好进行注射。
  6. 使用显微注射分配系统将50–100个癌细胞（2–5 nl）注射到斑马鱼胚胎的前心窦区域。
    1. 将针头安装至显微操作仪的针头夹持器上。
    2. 将注射板置于体视显微镜下，使60度斜面位于左侧，并在25倍放大倍数下对准最上方的胚胎进行聚焦。
    3. 调整显微操作仪位置，使针头在伸出时能够刺入胚胎。
    4. 凭目视将针头缓慢伸出，直至接近胚胎表面。
    5. 在显微镜下观察，调整针头位置，使其在进一步伸出时能准确刺入胚胎。
    6. 穿过卵黄囊刺入胚胎，将针尖置于前心窦处，但不进入窦腔内部。
    7. 踩下脚踏开关注入细胞。注射压力将细胞推入心脏窦腔，随后回撤针头。
    8. 用右手控制注射针的伸出与回缩，同时用左手微调下一个胚胎的位置。
    9. 在准备对下一块注射板进行操作时，将针头放回电极储存罐中。
  7. 整块注射板完成注射后，将胚胎转移至恢复培养皿中。
    1. 倾斜注射板，使胚胎聚集于底部，冲洗出槽道中残留的胚胎，并用塑料移液管收集。
    2. 让胚胎在移液管底部沉降。
    3. 以最小体积的三卡因溶液将胚胎转移至恢复培养皿中。
  8. 将恢复培养皿在28 °C条件下孵育1小时。
    1. 将存活的斑马鱼胚胎与死亡胚胎及其他碎片分离。
  9. 将培养皿在33 °C条件下孵育至准备进行评分，通常为24–96小时。
    注意：该温度是在癌细胞最适生长温度37 °C与斑马鱼最适生长温度28.5 °C之间权衡确定的。

4. 渗出评分

  1. 将待评分的胚胎放入含有三卡因溶液的培养皿中，使其麻醉。
  2. 将一只已麻醉的幼鱼置于凹面载玻片上的一滴三卡因溶液中。
    1. 将幼鱼侧向放置，以获得尾部区域的最佳成像效果。
  3. 通过在尾部区域上下调焦，计数已成功侵出血管系统的癌细胞数量。
    注意：此过程最好由至少两名人员共同完成，其中负责评分的人员应对所评估的实验条件设盲。
    1. 使用10倍物镜在复合荧光显微镜下对幼鱼进行评分；对于难以判断的情况，可使用20倍物镜。

5. 将胚胎固定在载玻片上及后续荧光成像

  1. 融化1.5%琼脂糖/三卡因溶液，并升温至37 °C。
  2. 将待成像的胚胎置于三卡因溶液中以进行麻醉。
  3. 将胚胎连同一滴三卡因溶液转移至成像表面。可选择使用玻璃底培养皿或显微镜载玻片。
  4. 使用玻璃移液管除去多余的三卡因溶液，使胚胎保留在成像表面上。
  5. 在胚胎上方覆盖一滴融化的琼脂糖溶液。
  6. 在琼脂糖凝固前迅速使用精细工具（如睫毛刷）将胚胎调整为侧向位置以便成像，特别注意使胚胎在成像表面上充分展平。
  7. 将已凝固的琼脂糖液滴浸没于三卡因溶液中。
  8. 对活体斑马鱼胚胎进行显微成像。

6. 改良方法：将癌细胞注射到斑马鱼胚胎的卵黄囊中

  1. 按照本方案第 (3) 部分所述方法准备显微注射分配系统和注射用培养皿。
  2. 按照本方案第 (2) 部分所述方法，使用对比性荧光染料标记两个细胞群体。
  3. 将 5 - 10 nl 浓度为 2 × 10⁷ 个细胞/ml 的细胞悬液注入卵黄囊中。保持注射体积恒定，以确保从每个细胞群体中注射相同数量的细胞（100 - 200 个癌细胞）。
    注意：本实验可使用缺乏荧光血管系统的透明斑马鱼胚胎。可通过注射荧光微珠（< 10 µm）或不发生内渗的细胞系，来对照控制颗粒被动进入血管系统的情况。
  4. 按照本方案第 (3) 部分所述方法回收已注射的胚胎，随后筛选注射成功的胚胎。
    1. 使用体视显微镜筛选并转移成功注射且存活的胚胎至新的培养皿中。
      注意：所有胚胎的卵黄中均应存在大小一致的细胞团块。若细胞团块大小不一，或有细胞位于卵黄外，则该胚胎应予弃用。
    2. 若在卵黄囊中清晰可见癌细胞，则将存活的胚胎转移至新的培养皿中。
  5. 将培养皿置于 33 °C 条件下孵育，直至准备进行评分，通常为 24 - 48 小时。
    注意：该温度是在癌细胞最适生长温度（37 °C）与斑马鱼最适生长温度（28.5 °C）之间权衡确定的。
  6. 为评估内渗情况，请参照本方案第 (4) 部分所述指南，但改为计数成功侵入尾部区域血管系统的癌细胞数量。

结果

本研究利用斑马鱼胚胎模型检测了常用乳腺癌细胞系的血管侵袭能力（图1）。在对不同细胞系的外渗情况进行评分时采用了严格的标准，仅当癌细胞明显发生外渗时才计为阳性事件，此举主要是为了减少因将细胞碎片误判而导致的假阳性结果。

在注射至心脏前腔后96小时评估侵袭情况时，我们发现各细胞系之间存在显著差异（表1）。在测试的7种细胞系中，注射MDA-MB-231细胞系的斑马鱼胚胎每胚胎中渗出的癌细胞数量最多，这一结果与其公认的转移特性一致（图2）。我们还发现，BT-474细胞容易侵入胚胎尾部区域，而其他细胞系（如MCF-7、SK-BR-3和T-47D细胞）的侵袭性则极低（图3）。一个引人注意的发现是，大约一半注射了MDA-MB-468细胞的斑马鱼胚胎在心脏区域出现水肿，这些样本未被计分。因此，在找到足够数量可用于外渗定量分析的存活胚胎之前，大量注射了MDA-MB-468细胞的胚胎被剔除。尽管存在这些明显差异，值得注意的是，所有测试的癌细胞系均发生了外渗现象。

作为对前心脏窦实验的一种改进，我们进行了一项竞争实验，使用两种在血管侵袭能力上存在差异的 MDA-MB-231 细胞群体26 同时注射到发育中胚胎的卵黄囊内。注射前在汇合培养条件下扩增的 MDA-MB-231 细胞，其进入血液循环的内渗能力降低，因此在评分时在胚胎尾部区域的出现频率减少图4）.

细胞系每胚胎平均外渗细胞数范围
MDA-MB-231 (Subconfluent)40-9
BT-4741.50-4
MDA-MB-4680.70-6
MCF-70.60-2
T-47D0.30-2
HCC18060.20-1
SK-BR-30.10-1

表1：乳腺癌细胞系在斑马鱼中血管侵袭能力的比较 将常用乳腺癌细胞系注射至2日龄斑马鱼胚胎的心前窦，4天后进行评分。每种细胞系检测10个胚胎，定量分析从血管侵入尾部区域的癌细胞。表中列出了外渗癌细胞的平均数量及其范围。

斑马鱼胚胎显微注射过程示意图，展示标记、注射和评分步骤。
图1. 斑马鱼癌细胞外渗实验的可视化概要。 在该实验中，将癌细胞用荧光染料标记后注射到2日龄斑马鱼胚胎的心前窦中，胚胎的血管系统由一种对比性荧光报告系统标记。再经过2至4天培养后，对已侵入胚胎尾部区域的癌细胞进行计数，并可将其置于含麻醉剂的琼脂糖介质中，用于后续成像。该示意图中所示的每个步骤均对应本实验方案中的一个部分。请点击此处查看该图的放大版本。

斑马鱼癌症模型；共聚焦成像显示MDA-MB-231细胞；肿瘤侵袭分析。
图2. 注射MDA-MB-231细胞后4天斑马鱼胚胎的图像拼接图。 显示明场 (A) 和荧光 (B) 拼接图像。荧光图像为z轴层扫的最大投影，其中绿色表示血管系统，红色表示癌细胞。比例尺：200 µm。 (C) 放大胚胎尾部区域以显示外渗的癌细胞。放大后可见点状荧光标记。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

乳腺癌细胞显微镜图像，BT-474、MCF-7、SK-BR-3、T-47D；荧光可视化。
图3. 实验结果示例。 在注射了BT-474癌细胞的胚胎中可观察到外渗现象，而在注射MCF-7、SK-BR-3和T-47D癌细胞的胚胎中则未观察到外渗。箭头指示外渗的细胞。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

斑马鱼模型侵袭实验；荧光显微镜；侵袭性细胞比较；柱状图结果。
图 4. MDA-MB-231 细胞群体在卵黄囊注射后 2 天的内渗情况。 (A) 卵黄囊中带有绿色（具侵袭性）和红色（侵袭性较低）标记的 MDA-MB-231 细胞。(B) 尾部区域，其中 MDA-MB-231 细胞已侵入血管系统并迁移至尾部。(C) 注射后 2 天，尾部区域出现内渗 MDA-MB-231 细胞的斑马鱼胚胎数量26。比例尺，250 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

该技术利用斑马鱼模型高效检测癌细胞的血管侵袭能力（见图1）。本文将该技术应用于一组乳腺癌细胞系，旨在提供一个基准，供其他研究者在此基础上开展各自的研究（见表1；图2 - 3）。观察发现MDA-MB-231细胞 readily侵入斑马鱼胚胎的尾部区域，表明该细胞系适用于测试可能抑制血管侵袭的药物或因子。相比之下，侵袭性较弱的细胞系（如HCC1806或MDA-MB-468细胞）则可用于研究能够增强血管侵袭能力的因素。若此类实验需要加入药物，则可根据预期治疗效应的持续时间选择两种不同的给药途径：可在将癌细胞注射入胚胎前对其进行药物预处理，或将药物直接加入饲养胚胎的水中，通过扩散作用影响癌细胞。

在我们的比较中，我们分析了癌细胞注射到斑马鱼胚胎心前窦后96小时时在尾部的外渗情况。对于MDA-MB-231细胞竞争实验，在卵黄囊注射后48小时评估癌细胞进入循环系统的内渗过程。所选择的分析时间点通常需要根据不同细胞系进行优化，某些实验中外渗高峰可能在注射后仅24小时即出现。值得注意的是，当向斑马鱼胚胎注射癌细胞时，其先天免疫系统已具备功能27，因此免疫细胞（如巨噬细胞或中性粒细胞）可能会吞噬来自癌细胞的荧光碎片。因此，在评估外渗时，先天免疫系统的活性可能导致假阳性荧光信号；必须谨慎识别仅在相应荧光通道中强荧光的细胞进行计数。鉴于当前癌症研究 increasingly 揭示免疫系统在促进癌症转移中的作用28，斑马鱼胚胎模型可能为该领域提供独特见解，允许研究癌细胞与先天免疫系统之间的相互作用。这一观点已在若干近期研究中得到体现。其中一项研究证明，在斑马鱼体内抑制VEGFR可增强中性粒细胞诱导癌细胞转移行为的能力29。另一项研究显示，CXCR4-CXCL12免疫趋化因子信号轴在斑马鱼体内保持完整，人类癌细胞上的受体能够感知并响应斑马鱼体内的配体30，且癌细胞中CXCR4的表达水平与其在动物模型中的侵袭能力相关。此外，研究还证实斑马鱼巨噬细胞对人源CXCL12具有趋化反应。例如，可利用中性粒细胞荧光标记的斑马鱼胚胎品系31，进一步探索该模型中癌细胞与免疫系统的相互作用。

该实验方案中有几个步骤需要特别注意。首先，必须将癌细胞充分解离成单细胞悬液，以防止注射到胚胎时堵塞针头。细胞团块还可能阻塞血流，干扰癌细胞向尾部区域迁移，从而影响分析结果的准确性。此外，细胞团块还可能引起血管破裂；若发生这种情况，则无法可靠或准确地评估这些区域中活癌细胞的侵袭能力，因此不建议进行评分。另一个潜在的问题是使用荧光染料对癌细胞进行标记。在我们实验室开展的实验中发现，脂溶性染料（例如DiI）通常能产生最佳的标记效果，但其荧光强度在不同细胞系之间可能存在差异。因此，在将细胞注射入胚胎前，应预先优化癌细胞的荧光标记条件，以避免过度标记。标记完成后，必须通过方案中标记部分所列出的多次离心步骤彻底洗去多余的染料；这些步骤看似多余，实则至关重要。过量的荧光染料可能对细胞产生毒性，或泄漏至血液循环中，造成人为的荧光背景信号。上述许多问题可通过使用表达荧光蛋白的癌细胞系来规避，因此建议在可行的情况下优先采用此类系统，而非荧光染料。最后，在对胚胎进行癌细胞外渗评分时，必须对所有实验组应用一致的评判标准。我们发现，由至少两名研究人员共同参与评分过程有助于提高科学严谨性：一人负责制备样本并记录结果，另一人则在不知晓实验分组的情况下独立做出外渗判断。评分时，可选择定量统计尾部区域中已外渗的癌细胞数量，也可建立二元判读标准以方便比较。使用荧光染料标记的癌细胞会呈现点状荧光信号，在高倍镜下可见（图2c）；但在较低倍镜下更易于识别完整细胞（图3），因此推荐采用后者进行评分。对于外渗现象较模糊的案例，可通过共聚焦显微镜获取光学切片图像加以辅助判断，通过计算尾部区域中外渗细胞占全部细胞的百分比，可校正因向胚胎注射癌细胞数量不均所带来的偏差。

卵黄囊注射途径与心脏前窦不同，因其可容纳更多的细胞，从而更有利于适应细胞群体内的异质性。如图4所示，可将多个带有不同标记的细胞群体同时注射至卵黄囊中，以比较其侵袭能力与侵袭模式。注射细胞的血管生成能力以及对血管的募集增强可能促进癌细胞进入尾部区域，但这一方面尚未被分析。从技术上讲，卵黄囊注射比心脏前窦注射更容易操作；然而，卵黄囊富含营养物质，可能阻碍癌细胞的迁移。此外，若在卵黄囊的血管附近注射，可能使癌细胞过早进入循环系统，因此必须仔细筛选注射失败的胚胎，并将其排除在评分之外。最后需要指出的是，卵黄囊微环境在一定程度上是人为的，因为在小鼠或人类中并不存在与之对应的原发部位。

旨在预测癌症转移的各种模型系统均有其优势与局限性，斑马鱼外渗实验也不例外。其主要优势在于，该实验能够在具有功能性的循环系统中评估癌细胞的血管侵袭能力，且仅需数天即可回答实验问题。鉴于其快速的实验周期，该系统不仅可用于研究已建立的细胞系的侵袭行为，还可用于分析来自癌症患者的新鲜分离样本。其主要局限性在于，该模型仅聚焦于血管侵袭过程，因而忽略了转移级联反应中最早期和最晚期的事件。此外，注入斑马鱼胚胎中的人类癌细胞显然并非处于同基因型环境中，因此可能在一定程度上缺失了与间质之间的相互作用。尽管存在这些局限性，斑马鱼胚胎模型在基础与转化癌症研究中仍具有应有地位；我们已利用该模型证实Hippo信号通路26和角蛋白相关蛋白5-532在癌细胞血管侵袭能力中发挥重要作用。因此，该模型有望助力研究晚期癌症关键的转移特征之一。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢乔治城大学显微成像中心的 Peter Johnson 在斑马鱼胚胎成像方面提供的帮助。显微成像共享资源平台和斑马鱼共享资源平台部分由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助项目 P30-CA051008 支持。本研究还得到了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所项目 CA71508（AW）和 CA177466（AW）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTALife Technologies25300-054
100 mm 培养皿康宁公司3160-100
5 3/4" 一次性巴斯德吸管，硼硅酸盐玻璃Fisher Brand13-678-20B
60 mm 培养皿康宁公司3160-60
低熔点琼脂糖FisherBP165-25
琼脂糖，分子生物学级别BiolineBIO-41026
毛细玻璃管，标准型，1.2 mm × 0.68 mm，4"A-M Systems, Inc627000
David Kopf 700C 垂直拉针仪霍夫斯特拉团队3600
DMEMLife Technologies11995-065
电极储存罐，1.0 mm世界精密仪器公司E210
盐酸三卡因甲磺酸盐（Tricaine，MS-222）FlukaA5040
睫毛刷Ted Pella, Inc113
胎牛血清，热灭活Omega ScientificFB-12
Fisherbrand 移液管赛默飞世尔科技13-711-7M
凝胶上样移液器吸头Fisher Brand02-707-181
玻璃底培养皿（12.0 mm）赛默飞世尔科技150680
玻璃凹片载玻片VWR470005-634
Instant Ocean 盐，海盐PentairIS50
乳胶橡胶吸头，2 ml，每包72个Heathrow ScientificHS20622B
SP8 共聚焦显微镜Leica
显微操作仪Narishige
Eclipse E600尼康
PBSLife Technologies10010-023
青霉素G钾Fisher BiotechBP914-100
培养皿，100 mm × 15 mmFisher Brand FB0875713
Picospritzer IIGeneral Valve Corporation
RPMI 1640培养基 Life Technologies11875-093
硫酸链霉素Fisher BiotechBP910-50
Vybrant DiI赛默飞世尔科技V22885
Vybrant DiO赛默飞世尔科技V22886
斑马鱼 乔治城斑马鱼共享资源中心
细胞系在DMEM + 10% FBS中培养，BT-474和HCC1806细胞除外，后者在RPMI + 10% FBS中培养。

参考文献

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