Method Article

两种技术来创建Hypoparathyroid小鼠:甲状旁腺切除术采用GFP腺和白喉毒素介导甲状旁腺消融

DOI:

10.3791/55010

⸱

March 14th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Endocrine Unit, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2West China School of Stomatology, Sichuan University, 3Department of Oral Medicine, Infection and Immunity, Harvard School of Dental Medicine, 4State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

患有获得性甲状旁腺功能减退症的小鼠可用于研究甲状旁腺功能减退症的新型药物治疗。演示了创建此类小鼠的两种程序。 GFP-PTX 小鼠是通过绿色荧光甲状旁腺引导的甲状旁腺手术切除术产生的。 第二种非手术方法基于甲状旁腺对白喉毒素受体的特异性表达。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

甲状旁腺功能减退症 （HP） 是一种以 PTH 水平低为特征的疾病，可导致低钙血症、高磷血症和低骨转换。该疾病最常见的原因是甲状腺手术期间意外切除甲状旁腺。 需要针对 HP 的新疗法，但测试它们需要可靠的获得性 HP 动物模型。

在这里，我们演示了获得性 HP 的两个小鼠模型的生成。在 GFP-PTX 模型中，通过将 PTHcre + 小鼠与 Rosa-mTmGfl/fl 小鼠杂交，产生在甲状旁腺 （PTHcre-mTmG） 中特异性表达的绿色荧光蛋白 （GFP） 的小鼠。在荧光解剖显微镜下很容易识别绿色荧光甲状旁腺，并在不到 20 分钟的时间内进行甲状旁腺切除术。荧光引导手术后，小鼠出现严重低钙血症。 与传统的甲状腺-甲状旁腺切除术相反，这种精确的手术方法使甲状腺和甲状腺功能完好无损。第二种模型不需要手术，基于白喉毒素方法。 通过在甲状旁腺中特异性表达白喉毒素 （DT） 受体的 PTHcre-iDTR 小鼠是通过将诱导型 DTR 小鼠与 PTHcre 小鼠杂交而产生的。因此，甲状旁腺细胞对白喉毒素 （DT） 敏感，并且可以通过全身注射 DT 来选择性地破坏小鼠。由此产生的低钙血症表型是稳定的。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

自1880年1在人类和其他几个物种由桑德斯特伦甲状旁腺的第一次系统介绍，了解这个小内分泌器官对人类生理和疾病的重要性不断提高。甲状旁腺分泌甲状旁腺激素（PTH），钙代谢的主要调节剂。 PTH也是磷酸盐稳态和骨代谢1,2的重要激素。颈部手术期间甲状旁腺的意外脱落或损坏是甲状旁腺功能减退症的最常见的原因，这种疾病特征在于，低血钙，低PTH，和升高的磷1。

为了更好地研究收购甲状旁腺功能减退和试验新疗法，可靠，方便小鼠模型是必需的。小鼠被广泛用于研究，因为各种各样的遗传工具是一vailable该物种允许复杂的机理研究在体内 。然而，虽然外科甲状旁腺切除（PTX）可以在大鼠2，3，4，5，而较大的哺乳动物6，7，8使用，它在技术上是在因为腺的小尺寸和其可变解剖分布的小鼠非常具有挑战性的9。因此，甲状腺-甲状旁腺切除（TPTX）在小鼠中，其中甲状腺和甲状旁腺除去一起10通常执行的。然而，低甲状腺激素水平在实验中一个潜在的混杂因素，这种模式复杂化。此外，甲状腺内C-细胞，其产生降钙素，激素钙体内平衡的重要的啮齿动物，也失去了在除去日。yroids 11。

甲状旁腺功能低下症的几种遗传小鼠模型存在，其中包括PTH空鼠标12，GCM2空鼠标器13以及NUF鼠标与钙敏感受体（的CaSR）14，15的活化突变。然而，这些遗传缺陷已经胚胎发育过程中存在，和甲状旁腺的功能，因此在胚胎发生期间已经受损。这可能会影响器官的发育，如骨架。这与患者的术后甲状旁腺功能减退症谁掌握疾病以后的生活中。此外，一些这些小鼠模型显示出早期杀伤力和生育能力下降，从而其使用12，13，14进一步复杂化。

我们开发了两个新的鼠标Models用于收购甲状旁腺功能减退。使用遗传工程小鼠表达GFP特意在甲状旁腺允许甲状旁腺可以很容易地确定用于手术切除不去除甲状腺。被穿越PTH-Cre的鼠标，其中5.5 kb的PTH子16与ROSA mTmG鼠标控制下表达Cre重组酶生成此鼠标。由此产生的PTHcre; mTmG小鼠甲状旁腺细胞中特异性表达绿色荧光蛋白。第二小鼠模型使用相同的PTH-Cre的，此时从诱导DTR鼠标在甲状旁腺除去一个STOP盒，导致白喉毒素受体的表达特异性。 DT的全身给药破坏甲状旁腺细胞，使动物hypoparathyroid无需手术。

在这项研究中提出了两种小鼠模型表明在三个月的观察围稳定的低血钙型OD。这些程序很容易执行，表型是可重复的，而hypoparathyroid小鼠表现出成活率高17。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究已获得马萨诸塞州总医院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）。获得开始前这个动物研究适当的机构批准。一些技术可能必须根据当地IACUC要求调整。

1. GFP-PTX小鼠

  1. 获取PTHcre +小鼠和罗莎- mTmG小鼠8 - 10周龄进一步交配。
  2. 回交的PTHcre +小鼠（混合129; FVB背景）与C57BL / 6小鼠为6代以获得具有C57BL / 6背景的小鼠。
  3. 近交PTHcre +小鼠获得PTHcre + / +小鼠17。
    注:要执行的基因分型，从尾尖提取的DNA，并用它进行PCR。 PCR引物检查合度和PTHcre转基因纯合如下:正向引物A，CCTGTCAAGGATGTGGAAGA，反向引物A'，TCAGATCACACCACACAGCA，女orward引物B，CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG，反向引物B'，GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17。
  4. 十字PTHcre + / +罗莎- mTmG小鼠18只16。断奶PTHcre; mTmG幼崽当4周龄。
  5. 在0.6毫克/克体重由三溴腹腔注射（阿佛丁）mTmG小鼠，或其它试剂如氯胺酮/甲苯噻嗪; 10周龄PTHcre - 麻醉8。根据批准的协议使用丁丙诺啡0.1毫克/千克SC每12小时作为镇痛48小时手术后。确保在脚趾捏撤回反射或其他方式的麻醉深度适当。将动物在仰卧位。
  6. 扩展和使用单刃刀片剃须对皮肤准备腹侧颈部区域。消毒用碘伏消炎片剃光皮肤。
  7. 覆盖用无菌手术单的动物，以减少外科手术部位的污染，并使用高压灭菌麦克风rosurgical仪器为外科手术。
  8. 切开皮肤中的2厘米的纵向切口用外科手术刀。解剖筋膜钝性分离与弧形的锯齿钳推唾液腺到了一边。
  9. 在使用卤素灯和4解剖显微镜 - 放大5倍，切割和分离使用锋利的钳提示气管旁肌肉，暴露气管。
  10. 确定与旁边的气管左，右叶甲状腺。
  11. 切换光源的荧光灯和可视化的两个绿色-荧光甲状旁腺。
    注意:通常情况下，这两个甲状旁腺位于或甲状腺的表面附近，但偶尔，它们位于更远。
  12. 小心取出手术使用镊子和剪刀绿色甲状旁腺。用无菌纱布止血，并沿气管仔细检查，确保所有绿色组织已被删除。
  13. 通过使用6-0聚乳糖910缝线间断缝合关闭气管旁肌肉。通过使用6-0聚乳糖910缝线缝合霍尔斯特德关闭皮肤切口。
  14. 可选:注入10微升/ g体重的无菌正常0.9％氯化钠溶液的小鼠补液。
  15. 放置术后动物的单独笼子上为体温恢复温暖培养箱中（37℃）。一旦老鼠是清醒的，并在卧位，把颗粒饲料和水用在笼底一些明胶的食品。
  16. 经过2小时的手术后的观察期，返回鼠标的动物设施，并按照术后护理当地的要求。
  17. 甲状旁腺切除后第3天，得到10μL的尾血，并测量血液使用分析器电离的Ca ++诸如血液气体系统的Ca ++ / PH值分析仪。血甲状旁腺切除成功的结果电离钙++等于或大于假手术CON的-2SD低控制小鼠（1.20毫摩尔/升在我们的N = 30的实验）。

2. PTH-CRE-IDTR小鼠

  1. 获得8 PTHcre +和DTR FL / FL小鼠- 10周龄进行交配。
  2. 回交的PTHcre小鼠（混合129; FVB背景）与C57BL / 6小鼠为6代以获得具有C57BL / 6背景的小鼠。
  3. 近亲繁殖的PTHcre +（C57BL / 6背景）小鼠获得PTHcre + / +小鼠17。
    注:要执行基因分型，提取及用于PCR小鼠尾巴尖端的DNA。基因分型引物:正向引物A，CCTGTCAAGGATGTGGAAGA，反向引物A'，TCAGATCACACCACACAGCA，正向引物B，CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG，反向引物B'，GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17。
  4. 交配PTHcre + / +小鼠16与DTR FL / FL小鼠19获得PTHcre-IDTR的小鼠。
  5. 通过稀释diphtheri准备DT解决方案毒素粉末用无菌生理盐水至0.5微克/毫升的浓度。无菌过滤，并储存等分在-80℃。
  6. 选择8 - 注射实验10周龄PTHcre-IDTR小鼠。解冻DT等分至室温，辖DT腹膜内以5微克/千克（10μL/ g）的动物的体重。对于最高效率和最低毒性，DT管理重复在为期3天的间隔17，共2次注射。
  7. 第二次注射后3天，通过各个PTHcre-IDTR / PTHcre-IDTR-mTmG鼠标10μL尾血，测量血液中的Ca ++使用血液气体系统的Ca ++ / pH分析仪。
    注意:我们定义与小鼠血液钙离子++低于1.18毫摩尔/升作为hypoparathyroid小鼠，这相当于车辆注射的对照小鼠（n = 22）的平均低于2SD。

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

甲状旁腺的位置

首先，我们记录54 PTHcre-mTmG小鼠的甲状旁腺的分布在荧光解剖显微镜下观察。 74％（五十四分之四十○）小鼠的两个绿色甲状旁腺（ 图1A，C，E），26％（14/54）的小鼠具有一个附加的第三甲状旁腺（ 图1B，D，F）。没有观察到小鼠与单个腺或三个以上的腺体。一般，甲状旁腺分别位于甲状腺（58％，122分之71的上边界附近; 图1A（1,2），B（1,2），C（2），D（1,2） 中 ，E （2），F（3））。 27％（122分之33）腺体位于甲状腺的下边界附近（ 图1C（1），D（3），F（1）），和13％（122分之16）位于从第t远hyroid腺（ 图1B（3）中 ，E（1），F（2））。我们的研究结果是一致和延伸变甲状旁腺20的位置的先前的发现。

GFP-PTX小鼠

从麻醉整个手术闭合皮肤切口把每只小鼠大约20分钟。超过3个月的观察期手术后的小鼠的存活率为96.3％（53/55）。 92.4％（49/53）的GFP-PTX小鼠表现出了分别为假手术对照组小鼠或更低的平均2 SD下面离子钙水平。在GFP-PTX小鼠（低钙血症，低PTH和血清磷酸盐升高）的hypoparathyroid表型是对3个月的整个观察时间是稳定的。重要的是，甲状腺功能不是来自假手术的动物不同后3个月手术（TSH = 42±24对30±15 MU / L，P = 0.171; T 4 = 30.0±0.6与3.1±0.9微克/分升，p值= 0.707（ 图2）。

PTH-CRE-IDTR小鼠

DT注射PTH-Cre的小鼠IDTR开发甲状旁腺功能减退（低血离子钙，血磷升高，以及不适当的低正常PTH水平）。我们以前曾报道，少数的PTH阳性细胞逃避白喉毒素的消融，解释了可测量的循环PTH和因此这些小鼠17的稍温和的表型。

甲状旁腺功能低下症的GFP-PTX老鼠和PTH-CRE-IDTR小鼠

在GFP-PTX的小鼠中观察到手术后第3天的血液的Ca显著减少++和血清PTH水平相比，在假手术的小鼠中发现（钙+ = 1.05±0.40 对水平图3A，从许可（参考第17再版））。后3天的间隔，剂量和给药方案进行优化以使用DT的量最少，得到最大hypoparathyroid表型2注射5微克/千克的DT，对DT注入相比PTH-CRE-IDTR小鼠显示显著低钙血症，减少的PTH车辆控制小鼠，这持续了九十天观察期（CA ++ = 1.10±0.07毫摩尔/ L 比 1.26±0.05毫摩尔/ L，p <0.05; PTH = 218±156皮克/毫升与 572±164皮克/毫升，p <0.05）（ 图3B，许可转载自（参考＃17））。

figure-results-1
图1: （A，C，E）或三个（B，D，F）绿色甲状旁腺。最甲状旁腺分别位于上缘附近（A（1,2），B（1,2），C（2），D（1,2），E（2），F（3）或邻近的下缘（C（1），D（3），F（1）），在极少数情况下，有的被位于异位甲状腺（B（3），E（1），F（2））。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-2
图2:TSH 和GFP-PTX小鼠T4水平。 GFP-PTX 3个月后，对TSH和T4 measurem得到血清经济需求测试。 GFP-PTX的小鼠表现出TSH浓度（42±24亩/ L）（A）和T4浓度（3.0±0.6微克/分升），（B）这不是从控制小鼠（TSH = 30±15亩/ L，P不同= 0.171，N = 11，T 4 = 3.1±0.9，p值= 0.707，N = 11）。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-3
图3: 血Ca ++和PTH水平的GFP-PTX老鼠和DT注射PTH-CRE-IDTR小鼠。两者的GFP-PTX小鼠（A）和DT注射PTH-CRE-IDTR小鼠（B）表现出稳定的低血钙症和超过3个月的观察期降低PTH水平（N = 6 - 8，*** P <0.001）（重新印刷从参考＃17）权限。ES / ftp_upload / 55010 / 55010fig3large.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们使用转基因小鼠与甲状旁腺GFP表达选择性证明GFP引导下甲状旁腺切除的技术。在PTHcre; mTmG小鼠，双荧光（以Cre重组酶表达的细胞和红番茄非酶Cre绿色GFP表达的细胞），使我们能够清楚地识别，并精确地去除所有甲状旁腺无需拆卸甲状腺。而我们优选使用双荧光mTmG小鼠用于识别荧光红色非甲状旁腺组织的能力，我们的程序也应该工作以及使用单个荧光动物，如番茄红（B6.Cg-CT（ROSA）26Sortm14（ CAG-tdTomato）HZE / J）鼠标。程序比较容易进行，需要每鼠约20分钟，并且在严重和持续hypoparathyroid表型结果。

此外，GFP阳性甲状旁腺的另一优点是易于检测异常甲状旁腺的。我们的研究表明在大约B6小鼠（ 图1），这是由绿色荧光在我们的小鼠模型容易地检测的四分之一甲状旁腺的错误定位。相反甲状腺-甲状旁腺，我们的技术避免了与随后需要甲状腺激素替代和去除降钙素产甲状腺C细胞的未知作用除去甲状腺。荧光标记的甲状旁腺可也用于需要甲状旁腺的隔离其他调查。这种模式的限制包括对手术的要求。基本显微技术和用荧光光源解剖显微镜是必需的。

论证产生hypoparathyroid小鼠，消除对手术的需要的第二种技术。白喉毒素治疗PTHcre-IDTR小鼠表现出温和的甲状旁腺功能低下型，而仅仅需要腹腔注射DT到鼠标。关键部分FO- [R产生这种模式剂量的优化给药方案。高剂量的DT导致毒性，但低剂量降低了该方法的功效。我们确定，在5微克/公斤，给予2次注射剂量团相隔3天，导致无/死亡率最低可靠和稳定的低钙血症。

最终，我们希望这两种方法提供了获得有用的甲状旁腺功能低下症小鼠模型。使用一种新的长效PTH，我们报道在确定甲状旁腺功能低下症17的新药物的疗效在第一次使用这两种模式的。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提交人声明，他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作是由美国国立卫生研究院支持的授予口腔疾病公开赛资金SKLOD2015OF01（RB）的R01-DK100584和中国国家重点实验室。我们感谢文平赵，佐藤忠利和凯利劳特寻求帮助。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ROSAmT/mG小鼠杰克逊实验室7676
PTH-Cre 小鼠杰克逊实验室5989
iDTRmice杰克逊实验室7900
6-0 聚乳酸 910 针缝合Ethicon， IncJ510G
安全单刃剃须刀片美国安全剃须刀公司66-0089
一次性手术刀羽毛安全剃须刀有限公司72042-11
聚维酮碘制备垫Dynarex Corporation1108
层纱布Busse。IncBHD707
0.9% 氯化钠溶液HOSPIRA Worldwide， Inc07983-09
1 mL 29 G 胰岛素注射器BECTON DICKINSON329622
手术切口垂纱3M6640EZ
Dumstar Biology 镊子Roboz Surgical Instrument Co.， IncRS-4984
显微解剖弹簧剪刀RobozSurgical Instrument Co.， IncRS-5605
持针MILTEX.，IncV98-42
2,2,2-三溴甲醇Sigma-AldrichT48402
2-甲基-2-丁醇Sigma-Aldrich152463用于溶解 2,2,2-三溴甲醇
白喉毒素粉末Sigma-AldrichD0564溶于 0.9% 氯化钠溶液中，浓度为 1 mg/mL，作为 -80 ° 中的储备液;C
多盖血液采集 毛细管Siemens Healthcare Diagnostics Ltd855578用于使用 RapidLab 348 进行 iCa2+ 分析中的血液 Ca2+/pH 分析仪
RapidLab 348 Ca2+/pH 分析仪用于iCa2+ 分析
线 器

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brandi, M. L., Brown, E. M. Hypoparathyroidism. , Springer. (2015).
  2. van Abel, M. Coordinated control of renal Ca(2+) transport proteins by parathyroid hormone. Kidney Int. 68, 1708-1721 (2005).
  3. Sebastian, E. M., Suva, L. J., Friedman, P. A. Differential effects of intermittent PTH(1-34) and PTH(7-34) on bone microarchitecture and aortic calcification in experimental renal failure. Bone. 43, 1022-1030 (2008).
  4. Rodriguez-Ortiz, M. E. Calcium deficiency reduces circulating levels of FGF23. J Am Soc Nephrol. 23, 1190-1197 (2012).
  5. Liao, H. W. Relationship between Fibroblast Growth Factor 23 and Biochemical and Bone Histomorphometric Alterations in a Chronic Kidney Disease Rat Model Undergoing Parathyroidectomy. PloS one. 10, e0133278(2015).
  6. Fox, J., Care, A. D. Effect of low calcium and low phosphorus diets on the intestinal absorption of water in intact and parathyroidectomized pigs. Calcif Tissue Int. 31, 253-255 (1980).
  7. Finco, D. R., Brown, S. A., Ferguson, D. C., Crowell, W. A. Selective parathyroidectomy of the dog. Can J Vet Res. 57, 288-292 (1993).
  8. Can, I. Parathyroid allotransplantation in rabbits without cultivation. Int J Clin Exp Med. 7, 280-284 (2014).
  9. Dunn, T. B. Melanoblasts in the stroma of the parathyroid glands of strain C58 mice. j Natl Cancer Inst. 10, 725-733 (1949).
  10. CRIVER. , Available from: http://www.criver.com/products-services/basic-research/rodent-surgery/soft-tissue-procedures (2010).
  11. Sakai, A. Osteoclast development in immobilized bone is suppressed by parathyroidectomy in mice. J Bone Miner Metab. 23, 8-14 (2005).
  12. Miao, D. Skeletal abnormalities in Pth-null mice are influenced by dietary calcium. Endocrinology. 145, 2046-2053 (2004).
  13. Gunther, T. Genetic ablation of parathyroid glands reveals another source of parathyroid hormone. Nature. 406, 199-203 (2000).
  14. Hough, T. A. Activating calcium-sensing receptor mutation in the mouse is associated with cataracts and ectopic calcification. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13566-13571 (2004).
  15. Hannan, F. M. The Calcilytic Agent NPS 2143 Rectifies Hypocalcemia in a Mouse Model With an Activating Calcium-Sensing Receptor (CaSR) Mutation: Relevance to Autosomal Dominant Hypocalcemia Type 1 (ADH1). Endocrinology. 156, 3114-3121 (2015).
  16. Libutti, S. K. Parathyroid gland-specific deletion of the mouse Men1 gene results in parathyroid neoplasia and hypercalcemic hyperparathyroidism. Cancer Res. 63, 8022-8028 (2003).
  17. Bi, R. Diphtheria Toxin- and GFP-Based Mouse Models of Acquired Hypoparathyroidism and Treatment with a Long-Acting Parathyroid Hormone Analog. J Bone Miner Res. , (2015).
  18. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  19. Buch, T. A Cre-inducible diphtheria toxin receptor mediates cell lineage ablation after toxin administration. Nat Methods. 2, 419-426 (2005).
  20. Dunn, T. B. Melanoblasts in the stroma of the parathyroid glands of strain C58 mice. J Natl Cancer Inst. 10, 725-733 (1949).

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