获得性甲状旁腺功能减退症小鼠模型对于研究甲状旁腺功能减退症的新药疗法具有重要意义。本文展示了两种构建此类小鼠模型的方法。GFP-PTX 小鼠是通过在绿色荧光标记的甲状旁腺引导下进行手术切除甲状旁腺而获得的。第二种非手术方法则是基于甲状旁腺特异性表达白喉毒素受体的原理。
本文内容
摘要
摘要
甲状旁腺功能减退症（HP）是一种以甲状旁腺激素（PTH）水平降低为特征的疾病，可导致低钙血症、高磷血症和骨转换率降低。该病最常见的原因是甲状腺手术过程中意外切除了甲状旁腺。目前需要开发针对 HP 的新型疗法，但这些疗法的测试依赖于可靠的获得性 HP 动物模型。
本文展示了两种获得性甲状旁腺功能减退（HP）小鼠模型的建立方法。在GFP-PTX模型中，通过将PTHcre+小鼠与Rosa-mTmGfl/fl 小鼠杂交，获得甲状旁腺特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠（PTHcre-mTmG）。在荧光解剖显微镜下可清晰识别发出绿色荧光的甲状旁腺，从而在20分钟内完成甲状旁腺切除术。经荧光引导手术后，小鼠出现显著低钙血症。与传统的甲状腺-甲状旁腺切除术不同，这种精确的手术方法可完整保留甲状腺组织及其功能。第二种模型无需手术，基于白喉毒素（diphtheria toxin, DT）介导的方法建立。通过将可诱导型DTR小鼠与PTHcre小鼠杂交，获得甲状旁腺特异性表达白喉毒素受体（DT receptor, DTR）的小鼠（PTHcre-iDTR）。此类小鼠的甲状旁腺细胞因而对白喉毒素（DT）敏感，通过系统性注射DT即可选择性破坏甲状旁腺细胞。所获得的低钙血症表型稳定持久。
引言
自1880年Sandström首次对人类及多种其他物种的甲状旁腺进行系统描述以来1，人们对这一小型内分泌器官在人体生理和疾病中重要性的认识不断深入。甲状旁腺分泌甲状旁腺激素（PTH），该激素是钙代谢的主要调节因子。PTH也是磷酸盐稳态和骨转换的重要激素1,2。颈部手术过程中意外切除或损伤甲状旁腺是甲状旁腺功能减退症最常见的病因，该疾病以血钙降低、PTH水平降低和血磷升高为特征1。
为了更好地研究获得性甲状旁腺功能减退症并测试新型疗法，需要可靠且易于获取的小鼠模型。小鼠在研究中被广泛使用，因为该物种拥有多种遗传学工具，可实现复杂的体内机制研究in vivo。然而，尽管手术性甲状旁腺切除术（PTX）可用于大鼠2,3,4,5以及较大的哺乳动物6,7,8，但由于小鼠甲状旁腺体积微小且解剖位置多变，该手术在技术上极具挑战性9。因此，通常在小鼠中实施甲状腺-甲状旁腺联合切除术（TPTX），即一并切除甲状腺和甲状旁腺10。然而，低甲状腺激素水平可能成为实验中的混杂因素，使该模型复杂化。此外，甲状腺内的C细胞（可分泌降钙素，该激素在啮齿类动物钙稳态中具有重要作用）也会在甲状腺切除时一并丧失11。
目前已存在多种低甲状旁腺素血症的遗传性小鼠模型，包括PTH基因敲除小鼠12、GCM2基因敲除小鼠13以及钙敏感受体（CaSR）激活突变的Nuf小鼠14,15。然而，这些遗传缺陷在胚胎发育期间即已存在，因此甲状旁腺功能在胚胎发生过程中便已受损，可能影响骨骼等器官的发育。这与术后获得性低甲状旁腺素血症的患者在成年后才发病的情况形成对比。此外，部分小鼠模型存在早期致死性和生育力下降的问题，进一步限制了其应用12,13,14。
我们开发了两种新的获得性甲状旁腺功能减退小鼠模型。利用基因工程小鼠，其在甲状旁腺中特异性表达绿色荧光蛋白（GFP），可在不切除甲状腺的情况下，通过手术轻松识别并切除甲状旁腺。该小鼠模型通过将PTH-Cre小鼠与ROSAmTmG小鼠杂交获得，其中PTH-Cre小鼠在5.5 kb PTH启动子的调控下表达Cre重组酶16。所获得的PTHcre;mTmG小鼠在甲状旁腺细胞中特异性表达绿色荧光蛋白。第二种小鼠模型同样使用PTH-Cre小鼠，但此次与可诱导的DTR小鼠杂交，以在甲状旁腺中特异性地移除STOP盒，从而在甲状旁腺中特异性表达白喉毒素受体。系统性给予白喉毒素（DT）可破坏甲状旁腺细胞，使动物在无需手术的情况下形成甲状旁腺功能减退状态。
本研究中呈现的两种小鼠模型在为期三个月的观察期内表现出稳定的低钙血症表型。操作步骤简便，表型可重复，且甲状旁腺功能减退小鼠具有较高的存活率17。
方案
本研究已获得麻省总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。在开始实验前，须获得相应的机构动物实验审批。某些技术步骤可能需要根据当地 IACUC 的要求进行调整。
1. GFP-PTX 小鼠
- 获取 PTHcre+ 8至10周龄的小鼠和Rosa-mTmG小鼠用于进一步交配。
- 回交 PTHcre+ 将小鼠（混合129;FVB背景）与C57BL/6小鼠杂交6代，以获得具有C57BL/6背景的小鼠。
- 近交系 PTHcre+ 小鼠以获得 PTHcre+/+ 小鼠17.
注意：进行基因分型时，从尾尖提取DNA并用于PCR。用于检测PTHcre转基因杂合性与纯合性的PCR引物如下：上游引物A，CCTGTCAAGGATGTGGAAGA；下游引物A'，TCAGATCACACCACACAGCA；上游引物B，CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG；下游引物B'，GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT17. - 交叉 PTHcre+/+ 小鼠16 与 Rosa-mTmG 小鼠18当 PTHcre;mTmG 幼鼠 4 周大时断奶。
- 通过腹腔注射三溴乙醇（Avertin，0.6 mg/g 体重）或其他麻醉剂（如氯胺酮/赛拉嗪），对8至10周龄的PTHcre;mTmG小鼠进行麻醉。 根据已批准的方案，术后48小时内每12小时皮下注射0.1 mg/kg的布托啡诺作为镇痛剂。通过脚趾夹捏回缩反射或其他方法确保麻醉深度适宜。将动物置于仰卧位。
- 使用单刃刀片剃除颈部腹侧区域的毛发，以暴露并准备手术区域。用聚维酮碘消毒垫对剃毛后的皮肤进行消毒。
- 用无菌手术巾覆盖动物以减少手术部位的污染，并在手术过程中使用经高压灭菌的显微外科器械。
- 用手术刀在皮肤上做一个2 cm的纵向切口。分离筋膜，并用弯齿镊通过钝性分离将唾液腺推向两侧。
- 在解剖显微镜下，使用卤素光源和4–5倍放大倍数，用尖头镊子剪开并分离气管旁肌肉，暴露气管。
- 识别位于气管两侧的甲状腺右叶和左叶。
- 将光源切换至荧光灯，观察两个发出绿色荧光的甲状旁腺。
注意：通常，两个甲状旁腺位于甲状腺表面或其附近，但偶尔也可位于较远的位置。 - 使用手术镊和剪刀小心地移除绿色的甲状旁腺组织。用无菌纱布止血，并沿气管仔细检查，确保所有绿色组织均已清除。
- 使用6-0聚乳酸羟基乙酸共聚物（polyglactin 910）缝线间断缝合甲状旁腺周围肌肉。使用6-0聚乳酸羟基乙酸共聚物（polyglactin 910）缝线行Halsted缝合法关闭皮肤切口。
- 可选：为小鼠注射无菌生理盐水（0.9% 氯化钠溶液），剂量为 10 µL/g 体重，以补充液体。
- 将术后动物置于单独的笼子中，并放置在温暖的培养箱（37 °C）内以恢复体温。当小鼠苏醒并处于卧位时，在笼底放置颗粒饲料、水及含明胶的食物。
- 术后观察2小时后，将小鼠送回动物房，并遵循当地规定的术后护理要求。
- 甲状旁腺切除术后3天，采集10 µL尾部血液，测定血液离子化钙浓度++ 使用血气分析仪等分析设备++/pH分析仪。成功的甲状旁腺切除术可使血液离子化Ca++ 等于或低于假手术对照组小鼠的-2SD（在我们的实验中，n = 30，为1.20 mmol/L）。
2. PTH-cre-iDTR 小鼠
- 获取 8 - 10 周龄的 PTHcre+ 和 DTRfl/fl 小鼠用于交配。
- 将 PTHcre 小鼠（混合 129;FVB 背景）与 C57BL/6 小鼠回交 6 代，以获得具有 C57BL/6 背景的小鼠。
- 近交 PTHcre+（C57BL/6 背景）小鼠，以获得 PTHcre+/+ 小鼠17。
注：进行基因型鉴定时，提取小鼠尾尖 DNA 并用于 PCR。基因型鉴定引物：正向引物 A，CCTGTCAAGGATGTGGAAGA；反向引物 A'，TCAGATCACACCACACAGCA；正向引物 B，CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG；反向引物 B'，GATAATCGCGAACATCTFCAGGTT17。 - 将 PTHcre+/+ 小鼠16 与 DTRfl/fl 小鼠19 交配，以获得 PTHcre-iDTR 小鼠。
- 通过将白喉毒素粉末用无菌生理盐水稀释至浓度为 0.5 µg/mL 来制备 DT 溶液。经无菌过滤后，分装并储存在 -80 °C。
- 选择 8 - 10 周龄的 PTHcre-iDTR 小鼠进行注射实验。将 DT 分装液解冻至室温后，按每克体重 5 µg/kg（10 µL/g）经腹腔注射给药。为达到最大效率并减少毒性，DT 给药在间隔 3 天的情况下重复进行，共注射 2 次17。
- 第二次注射后 3 天，从小鼠尾部采集每只 PTHcre-iDTR/PTHcre-iDTR-mTmG 小鼠 10 µL 血液，使用血气分析仪 Ca++/pH 分析仪测定血液 Ca++ 浓度。
注：我们将血液离子化 Ca++ 浓度低于 1.18 mmol/L 的小鼠定义为甲状旁腺功能低下小鼠，该值相当于溶剂对照注射小鼠平均值以下 2SD（n = 22）。
结果
甲状旁腺的位置
首先，我们在荧光解剖显微镜下观察并记录了54只PTHcre-mTmG小鼠甲状旁腺的分布情况。74%（40/54）的小鼠具有两个绿色的甲状旁腺（图1A, C, E），26%（14/54）的小鼠存在额外的第三个甲状旁腺（图1B, D, F）。未观察到仅有一个甲状旁腺或超过三个甲状旁腺的小鼠。通常，甲状旁腺位于甲状腺上缘附近（58%，71/122；图1A(1,2)，B(1,2)，C(2)，D(1,2)，E(2)，F(3)）；27%（33/122）的甲状旁腺位于甲状腺下缘附近（图1C(1)，D(3)，F(1)）；13%（16/122）则远离甲状腺（图1B(3)，E(1)，F(2)）。我们的发现与先前关于甲状旁腺位置变异的研究结果一致，并进一步扩展了相关认识20。
GFP-PTX 小鼠
从麻醉到关闭皮肤切口的整个手术过程，每只小鼠大约需要20分钟。术后小鼠在3个月观察期内的存活率为96.3%（53/55）。92.4%（49/53）的GFP-PTX小鼠其电离钙水平低于假手术对照组小鼠均值2个标准差或更低。GFP-PTX小鼠的甲状旁腺功能减退表型（低钙血症、PTH水平降低和血清磷酸盐升高）在整个3个月的观察期内保持稳定。重要的是，术后3个月，手术组小鼠的甲状腺功能与假手术动物相比无显著差异（TSH = 42 ± 24 vs. 30 ± 15 mU/L，p = 0.171；T4 = 3.0 ± 0.6 vs. 3.1 ± 0.9 µg/dL，p = 0.707（图2））。
PTH-cre-iDTR 小鼠
注射白喉毒素的 PTH-Cre-iDTR 小鼠出现甲状旁腺功能减退（血液游离钙降低、血磷升高，甲状旁腺激素水平不恰当地处于低正常范围）。我们此前曾报道，少数 PTH 阳性细胞可逃逸白喉毒素介导的消融，这可以解释这些小鼠体内可检测到的循环 PTH 水平，因而其表型相对较轻17。
GFP-PTX 小鼠和 PTH-cre-iDTR 小鼠中的甲状旁腺功能减退症
血钙水平显著降低++ 与假手术小鼠（Ca）相比，GFP-PTX小鼠术后3天观察到血清PTH水平的变化++ = 1.05 ± 0.40 与 1.30 ± 0.03 mmol/L，p < 0.05；PTH=32 ± 22 对比 580 ± 137 pg/mL，p < 0.05）。甲状旁腺功能减退表型在为期3个月的观察期内保持稳定（图 3A，经（参考文献17）许可重印。在两次注射后 5 µg/kg 每隔3天注射一次DT，该剂量和给药方案经过优化，旨在使用最少的DT剂量以获得最大程度的低甲状旁腺表型。与对照组小鼠相比，注射DT的PTH-cre-iDTR小鼠表现出显著的低钙血症和PTH水平降低，且该表型在90天的观察期内持续存在（Ca++ = 1.10 ± 0.07 mmol/L 与 1.26 ± 0.05 mmol/L，p < 0.05；PTH = 218 ± 156 pg/mL 与 572 ± 164 pg/mL，p < 0.05) (图3B，经（参考文献17）许可转载。
图1： 在荧光解剖显微镜下观察54只PTHcre-mTmG小鼠甲状旁腺不同位置的代表性图像。 小鼠具有两个 (A, C, E) 或三个 (B, D, F) 绿色的甲状旁腺。大多数甲状旁腺位于甲状腺上缘附近 (A(1,2), B(1,2), C(2), D(1,2), E(2), F(3)，或位于甲状腺下缘附近 (C(1), D(3), F(1))。在少数情况下，部分甲状旁腺位置异位 (B(3), E(1), F(2))。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： GFP-PTX小鼠的TSH和T4水平。 GFP-PTX手术3个月后，采集血清用于检测TSH和T4水平。GFP-PTX小鼠的TSH浓度（42 ± 24 mU/L）(A) 和T4浓度（3.0 ± 0.6 μg/dL）(B) 与对照组小鼠相比无显著差异（TSH = 30 ± 15 mU/L，p = 0.171，n = 11；T4 = 3.1 ± 0.9 μg/dL，p = 0.707，n = 11）。请点击此处查看此图的放大版本。
图3： 血液钙++ GFP-PTX 小鼠与注射 DT 的 PTH-cre-iDTR 小鼠中的 PTH 水平。 GFP-PTX 小鼠 （A） 以及注射了DT的PTH-cre-iDTR小鼠 （B） 在为期3个月的观察期内表现出稳定的低钙血症和降低的甲状旁腺激素水平（N = 6 - 8，***p < 0.001）（经参考文献#17许可重印）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
我们展示了利用甲状旁腺特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠进行GFP引导的甲状旁腺切除术的技术。在PTHcre;mTmG小鼠中，双重荧光（Cre表达细胞中的绿色GFP和非Cre表达细胞中的红色Tomato）使我们能够清晰识别并精确切除所有甲状旁腺，同时保留甲状腺。尽管我们更倾向于使用具有红色非甲状旁腺组织荧光标记能力的双重荧光mTmG小鼠，但本操作方法同样适用于单荧光小鼠，例如番茄红荧光小鼠（B6.Cg-Ct(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J）。该手术操作相对简便，每只小鼠约需20分钟，可成功建立严重且持续的低甲状旁腺素表型。
此外，GFP阳性甲状旁腺的另一个优势在于易于检测异位的甲状旁腺。我们的研究表明，约四分之一的B6小鼠存在甲状旁腺错位现象（图1），在本小鼠模型中，这些错位的腺体可通过绿色荧光轻松识别。与甲状腺-甲状旁腺切除术不同，本技术避免了甲状腺的切除，从而无需后续的甲状腺激素替代治疗，也避免了因切除产生降钙素的甲状腺C细胞所带来的未知影响。荧光标记的甲状旁腺还可用于其他需要分离甲状旁腺的研究。该模型的局限性在于需要进行手术操作，且要求具备基本的显微外科技能，以及配备荧光光源的解剖显微镜。
本文展示了一种无需手术即可生成甲状旁腺功能减退小鼠的第二种技术。经白喉毒素处理的PTHcre-iDTR小鼠表现出较轻的甲状旁腺功能减退表型，仅需向小鼠腹腔注射白喉毒素（DT）即可。构建该模型的关键在于优化剂量和给药方案。高剂量DT会导致毒性，而低剂量则会降低该方法的有效性。我们确定，以5 µg/kg剂量间隔3天注射两次的方案，可稳定、可靠地诱导低钙血症，且死亡率极低或无死亡。
最终，我们希望这两种方法能为获得性甲状旁腺功能减退症提供有用的 小鼠模型。利用一种新型长效甲状旁腺激素（PTH），我们首次报道了在这两种模型中评估新型甲状旁腺功能减退症治疗药物有效性的研究17。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01-DK100584和中国口腔疾病研究国家重点实验室开放基金SKLOD2015OF01（RB）支持。我们感谢Wenping Zhao、Tadatoshi Sato和Kelly Lauter提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ROSAmT/mG 小鼠 | 杰克逊实验室 | 7676 | |
| PTH-Cre 小鼠 | 杰克逊实验室 | 5989 | |
| iDTR 小鼠 | 杰克逊实验室 | 7900 | |
| 带针 6-0 聚乳酸羟乙酸共聚物 910 缝合线 | 爱惜康公司 | J510G | |
| 安全单刃剃须刀片 | 美国安全剃须刀公司 | 66-0089 | |
| 一次性手术刀 | 羽安全剃须刀有限公司 | 72042-11 | |
| 聚维酮碘消毒垫 | Dynarex 公司 | 1108 | |
| 多层纱布 | 布塞公司 | BHD707 | |
| 0.9% 氯化钠溶液 | 辉瑞全球公司 | 07983-09 | |
| 1 mL 29 G 胰岛素注射器 | 贝克顿·迪金森公司 | 329622 | |
| 手术切口巾 | 3M 公司 | 6640EZ | |
| Dumstar 生物镊 | Roboz 外科器械公司 | RS-4984 | |
| 显微解剖弹簧剪 | Roboz 外科器械公司 | RS-5605 | |
| 持针器 | MILTEX 公司 | V98-42 | |
| 2,2,2-三溴乙醇 | Sigma-Aldrich 公司 | T48402 | |
| 2-甲基-2-丁醇 | Sigma-Aldrich 公司 | 152463 | 用于溶解 2,2,2-三溴乙醇 |
| 白喉毒素粉末 | Sigma-Aldrich 公司 | D0564 | 用 0.9% 氯化钠溶液溶解至 1 mg/mL 作为储备液，于 -80 °C 保存 |
| Multicap 血液采集毛细管 | 西门子医疗诊断有限公司 | 855578 | 用于 RapidLab 348 Ca2+/pH 分析仪进行游离钙离子浓度（iCa2+）分析时采集血液 |
| RapidLab 348 Ca2+/pH 分析仪 | 西门子医疗 | 用于游离钙离子浓度（iCa2+）分析 |
参考文献
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重印与许可
