磁悬浮结合便携式成像与分析用于疾病诊断

摘要

我们介绍了一种磁力悬浮技术，该技术结合了自动化成像与分析功能，既可用于兼容智能手机的设备，也可用于嵌入成像与处理模块的设备。该方法可用于测量细胞的密度分布，并展示了两项生物医学应用：镰状细胞病的诊断，以及白细胞与红细胞的分离。

摘要

目前，许多临床诊断方法复杂、昂贵、效率低下，且全球大量人群难以获得。由于需要专用设备和经过培训的专业人员，许多诊断检测必须在偏远的中心化临床实验室中进行。磁悬浮是一种简单而强大的技术，可应用于悬浮细胞，当细胞悬浮于顺磁性溶液中并置于磁场中时，其位置由磁力与浮力之间的平衡决定。本文介绍了一种用于即时检测（point-of-care diagnostics）的多功能平台技术，该技术结合磁悬浮、显微成像和自动分析，用于测定患者细胞的密度分布，作为一项有价值的诊断指标。我们展示了基于该原理的两种平台：（i）一种与智能手机兼容的版本，利用智能手机内置摄像头对磁场中的细胞进行成像，并通过智能手机应用程序处理图像，测量细胞的密度分布；（ii）一种自包含式版本，采用摄像头模组采集图像，并通过嵌入式处理单元及配套的薄膜晶体管（TFT）屏幕完成测量并显示结果。已验证的应用包括：（i）测量具有疾病表型的细胞群体与健康表型相比的分布变化，该方法已应用于镰状细胞病的诊断；（ii）基于细胞特征性密度差异实现不同类型细胞的分离，该方法已用于将白细胞与红细胞分离，以进行白细胞细胞计数。此类应用以及该便携式、用户友好型平台技术所支持的未来扩展性密度测量，将显著提升即时检测环境下的疾病诊断能力。

引言

本文介绍了一种技术平台和方法，该方法结合磁力悬浮与自动成像及分析技术，通过分析患者细胞的密度分布来评估疾病状况。这种基于密度的细胞分析方法具有广泛适用性，最终可应用于多种疾病的诊断。然而，为了适用于即时检测（point-of-care testing）并在发展中国家推广应用，该技术必须满足低成本、便携性和易用性的要求。设备和耗材应易于获取且价格低廉；样品制备过程需简单，分析过程应实现自动化，尽量减少用户操作和结果解读的参与，同时能够快速获得结果。此外，设备必须结构紧凑、便于携带，以便在临床环境和发展中国家均能有效使用。因此，我们开发了一种设备和方法，将磁力悬浮技术与自动成像及图像分析相结合，实现符合即时检测需求的技术平台，用于获取患者细胞群体密度分布的结果。

即时检测技术相较于当前的临床实验室检测流程具有显著优势。目前可用的技术要么价格过于昂贵，无法由临床医生个人拥有，要么操作过于复杂，难以由医护人员直接实施。许多检测流程需要由经过培训的技术人员执行繁琐耗时的操作步骤。因此，患者样本（如血液或尿液）通常在医生诊所采集后，需转运至远程的集中式检测实验室进行临床检测，医生往往需要数天时间才能获得检测结果。这种情况在某些病例中可能导致治疗延误或并发症，使检测过程变得十分昂贵且低效（给保险支付方带来经济负担），并进一步导致许多诊断技术在资源匮乏地区和发展中国家难以获得。

本文介绍了一种磁力悬浮技术，该技术结合了自动化成像与分析功能，可用于集成成像与处理功能的装置（图1）以及兼容智能手机的装置（图2）。这些基于磁力悬浮的设备代表了一种广泛适用的平台技术，有望应用于多种不同的医学诊断场景。磁力悬浮方法的工作原理基于两种力之间的平衡：磁力与浮力^1,2,3。当颗粒悬浮于顺磁性介质中，并置于两个同极相对的磁体所产生的磁场内时，颗粒会受到指向两磁体中心线方向的磁力作用。浮力则由颗粒相对于悬浮介质的密度差异引起：若颗粒密度小于介质，浮力方向向上；若颗粒密度大于介质，浮力方向向下。在这两种力的作用下，颗粒将在磁场中达到一个平衡悬浮位置，使两力相互抵消；该位置与颗粒密度直接相关，密度较大的颗粒悬浮位置较低，而密度较小的颗粒悬浮位置较高。通过成像模块——可以是内置的智能手机摄像头^4,5,6，也可以是配备放大镜头的独立光学组件^7,8——可观察颗粒的位置。随后，通过智能手机应用程序^4,5,6或嵌入式处理单元^7,8进行图像处理，以量化颗粒的空间分布，从而获得样本群体的密度分布信息。为了分析更大的样本量（例如每毫升仅含少量目标颗粒的情况），可将流动系统直接集成到装置中，使颗粒在流经成像区域时被逐个悬浮并分析（图2）。

图1：自包含式磁悬浮平台。（a）紧凑型磁悬浮装置，包含磁聚焦模块、成像组件（发光二极管（LED）、光学镜头和相机检测器）以及带显示屏的处理单元。（b）样品插入区域两磁体之间横截面上的磁场强度分布。磁场强度在磁体表面最大，并在两磁体中心线处趋近于零。（c）处于磁场中的颗粒（如细胞）受到多种力的作用：朝向磁体中心线的磁力（F_m），其大小随颗粒位置变化；重力（F_g'），取决于颗粒密度相对于悬浮介质的密度；以及阻碍颗粒运动的阻力（F_d）。经Yenilmez 等⁸许可转载。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：兼容智能手机的流体辅助磁悬浮平台 (a-c前方a），侧面（b）和背部（c磁悬浮装置的视图（d设备的组成部分包括：1）磁力悬浮模块，包含永磁体、放大透镜、LED 及光线扩散器，2）智能手机外壳，3）电子元件，包含微控制器、泵驱动器和蓝牙接收器，4）微泵固定座，5）可调节孔径，6）废液管固定座，7）电池固定座，8）样品固定座，9）兼具支架与盖子功能的双用途结构。e) 流路示意图，显示样品在磁场中被泵送的过程。f磁力悬浮模块的横截面示意图，显示颗粒在泵送通过磁场时会根据其密度不同而排列；密度较低的颗粒（如颗粒1）将达到比密度较高的颗粒（如颗粒2）更高的悬浮高度。经Amin许可转载。 等¹ 请点击此处以查看此图的放大版本。

本系统中用于密度分布分析的任何样本，其最低要求包括：能够获得尺寸大于约5 µm且小于约250 µm的细胞或颗粒悬浮液（以满足成像和图像处理需求），以及该样本能够与顺磁性溶液（如本研究中使用的钆布醇）混合。在疾病诊断方面，适用的应用场景包括：（i）目标细胞在患病状态下其固有密度与健康对照相比发生改变；（ii）通过添加试剂或采用其他处理方式在短时间孵育后可诱导细胞产生密度变化；或（iii）在单个样本中需识别不同类型的细胞，且这些细胞类型本身（或 通过 某些处理）具有独特的特征密度。

镰状细胞病是一种遗传性疾病，会导致患者红细胞（RBCs）产生一种突变形式的血红蛋白HbS，从而引发间歇性血管阻塞事件和慢性溶血性贫血⁹。该病通常通过血红蛋白等电聚焦、高效液相色谱（HPLC）分离或血红蛋白电泳进行诊断，这些方法准确性高，但由于不适合即时检测环境，必须在临床检验实验室中进行。已有研究提出基于溶解度和纸质的镰状细胞病检测方法，但通常需要用户主观判读，并需进一步的确证检测。本文中，我们采用基于密度的方法来识别镰状红细胞，这类红细胞的密度高于非镰状细胞病个体的红细胞。其机制涉及突变型血红蛋白HbS的聚合，导致在缺氧条件下，镰状细胞病红细胞发生脱水，从而密度升高^10,11,12,13。

这种基于密度的方法也可用于根据密度差异分离不同类型的细胞：白细胞（WBCs）和红细胞（RBCs）⁷。白细胞通常负责抵御机体感染。通过白细胞细胞计数可定量血液中这些细胞的数量，是一种有用的诊断工具。白细胞计数高于正常值（通常认为超过每微升11,000个细胞）可能提示存在感染、免疫系统疾病或白血病。白细胞计数低于正常范围（约每微升3,500个细胞）可能由自身免疫性疾病或损伤骨髓的疾病引起。与替代技术不同，本文所述方法无需溶血或染色即可识别白细胞。该基于细胞的检测方法利用了这两类细胞固有的独特密度差异进行分离，据此前通过密度梯度离心法测定，白细胞群体的密度低于红细胞群体的密度^1,5,8。

与在偏远地区进行的其他检测方法相比，该检测具有快速的特点：样本制备简单（图3），设备可在10至15分钟内完成细胞分离，且成像与分析过程自动化，耗时不足1分钟。因此，该设备能够快速返回检测结果，有助于更好地指导临床决策，使治疗得以立即实施，从而缓解患者的生理和心理痛苦，并降低因医疗延误带来的并发症风险。由于样本制备简便，且成像与分析过程自动化，仅需最少的用户操作或结果判读，该技术可在临床环境中现场实施。此外，该设备采用永磁体进行样本分析，并利用智能手机或简单的电子元件进行成像和图像处理，因此与一些复杂的检测方法相比，设备本身及单次检测的成本均显著降低。

方案

伦理声明：所有涉及人血样本的操作均按照机构规定进行。所有方案均经过机构审查委员会审核并批准。所有参与者均签署了知情同意书。

1. 镰状细胞病诊断的样本制备^5,8

1. 在汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中配制浓度为 50 mM 的钆布醇溶液。
2. 将焦亚硫酸钠溶解于钆溶液中，使其终浓度为 10 mM。
   注意：焦亚硫酸钠吸入后有毒，对皮肤和组织有强烈刺激性。与水混合后呈腐蚀性酸性。高温加热时可能分解，释放出有毒的硫和钠氧化物烟雾。
3. 通过指尖采血或静脉穿刺获取血液样本。
   1. 使用带有洁净一次性采血针的采血笔进行采血。在穿刺部位附近施加压力，并在用移液器采集血液前，将形成的血滴擦拭三至四次；注意不要通过挤压组织“挤奶”式采血，以免组织液混入样本造成污染。
   2. 或者，采用标准静脉穿刺程序进行采血¹⁴。
      注意：若样本需保存数小时以上，应将血液收集至含有抗凝剂（如 EDTA）的真空采血管中。
4. 将少于 1 µL 的血液加入 100 µL 钆-焦亚硫酸钠溶液中。

2. 白细胞计数的样本制备⁷

1. 通过指尖采血或静脉穿刺获取血样，方法见第1节。
2. 可选：使用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞。将5 µL血液移入500 µL红细胞裂解缓冲液中，室温孵育3–5分钟。
   注意：此步骤可用于确认分离出的白细胞群体的悬浮位置范围。然而，该步骤并非必需，因为本文展示的结果表明，红细胞的悬浮位置明显低于白细胞。
3. 将全血用含25 mM Gd的HBSS溶液稀释1:1,000
   注意：若已进行细胞裂解，则将裂解后的样本按9:1的比例与250 mM Gd溶液混合（即9份裂解样本:1份250 mM Gd溶液），以获得含25 mM Gd的样本。

3. 使用磁悬浮平台分析样品^4,5,6,7,8

1. 启动磁悬浮装置：
   1. 对于独立式装置，将设备插入电源，待其通电启动后，放置在平坦、水平的表面上。
   2. 对于兼容智能手机的版本，启动智能手机应用程序，向左滑动进入图像采集模式，并将装置放置在平坦、水平的表面上。
2. 进行静态磁悬浮操作：
   1. 通过将方形玻璃微毛细管的一端浸入已制备的样品溶液中，利用毛细作用使样品自动填充至毛细管内。
   2. 将毛细管一端缓慢插入封口剂中，以密封管口。
   3. 将毛细管插入磁悬浮装置的两磁铁之间，使仅有约1 cm的管段外露（样品制备示意图请参见图3）。
      注意：此步骤在兼容智能手机的装置和独立式装置中均相同。
   4. 静置10分钟，期间避免扰动装置或毛细管。
3. 进行流动辅助磁悬浮操作：
   1. 将样品加载至样品管中。
   2. 将进样管路连接样品容器与微毛细管，同时将出样管路连接微毛细管与废液容器。
   3. 设置LED光照强度及流速参数。
4. 确认视野中可见细胞后，按下采集按钮以获取图像（独立式装置上为按钮3，智能手机应用程序中为屏幕底部的相机按钮）。
   注意：若使用U盘存储图像，请预先创建名为“images”的文件夹并将U盘插入设备，再开启电源。若无外部存储设备，图像将暂存于设备内部存储器中，可后续导出。
   注意：为降低异常结果风险，可在每次成像之间将毛细管前后移动约½ cm，采集并分析多张图像。
   注意：若用户界面检测并提示视野内细胞数量过高或过低，可适当将毛细管向内或向外调节，或重新制备样品。
5. 取出样品，并根据所在机构或当地的法规要求进行废弃处理。毛细管应作为锐器处置。

图3：样本制备与用户界面。（a）样本制备过程包括刺破受试者手指、形成血滴、将血滴转移至样本检测溶液中、振荡混合样本并通过毛细作用将样本吸入毛细管，最后将样本插入磁悬浮装置中。（b）这些样本制备步骤也会显示在设备屏幕上，以指导用户完成样本制备。（c）该设备包含四个按钮：用于放大样本图像以便通过调节旋钮正确对焦的按钮；用于获取单次测量结果的按钮（设置5秒延迟，以便用户插入样本）；用于进行延时测量的按钮（每5秒拍摄一张图像，共拍摄6张）；以及使用完毕后关闭设备的按钮。经Yenilmez 等 ⁸许可转载。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 图像分析^4,5,6,7,8

1. 运行设备附带的图像分析软件，选择适用于相应样本的分析模式（细胞分布或细胞类型分离）。
   注意：对于独立式设备，分析将自动完成，并在图形用户界面上显示结果。对于兼容智能手机的设备，需进入手机相册，选择待分析的视频文件以进行分析。
2. 观察并记录屏幕上显示的分析结果。
   注意：在进行细胞分布分析（如镰状细胞病诊断）时，输出结果为细胞群体的限制宽度。
   注意：在进行细胞类型分离分析（如白细胞识别）时，输出结果为已标识出白细胞群体的图像。为计算每微升中的细胞数量，需将每幅图像中白细胞的平均数量乘以2,000。例如，若观察到5个白细胞，则表示白细胞浓度为10,000 WBCs/µL。正常参考范围通常为3,500 - 11,000 WBCs/µL。
3. 将样本管在设备中前后移动约½ cm，重新捕获另一幅图像并按上述方法进行分析，重复该过程。
   注意：建议每个样本重复分析5至6次，以避免误差。

结果

对于用于镰状细胞病诊断的细胞密度分布分析，其目的是确定细胞群体分布宽度。无镰状细胞病患者的血细胞将局限于可预测的分布宽度内。而镰状细胞病患者的细胞则分布在更宽的范围内，且细胞分布呈负偏态（见图4）。针对特定应用，可在对照样本与健康样本的分布宽度之间设定阈值，作为区分“健康”与“疾病阳性”的 cutoff 值^5,8。

图 4： 利用磁力悬浮分析血液样本中红细胞密度分布以评估镰状...

讨论

实验方案中的关键步骤
此过程中的关键因素包括磁铁的正确对齐。如果装置内的磁铁发生移位或分离程度超过正常范围，则可能影响实验结果。为控制该故障或过程中其他潜在问题，可定期使用密度受控的颗粒（如聚苯乙烯微球）来监测随时间发生的变化。此外，悬浮时间至关重要，需给予足够时间使细胞达到平衡状态。对于红细胞，10 分钟足以使所有细胞达到平衡。但需注意，较小的颗粒或细胞可能需要更长时间才能达到平衡。可通过每 5 秒拍摄一次延时图像，并绘制限制宽度随时间变化的曲线来评估这一过程；当限制宽度的变化可忽略不计时，即可判定为达到平衡状态。

该方案中的其他关键步骤包括精确浓度的钆溶液的配制，因为这会显著影响样品的悬浮高度。钆溶液可预先配制并使用储备液，但必须妥善密封，以避免溶液蒸发导致浓度意外升高。此外，必须注意维持所用细胞的健康状态。对于通过指尖采血获取的人血，应在采血后一小时内使用，并通过储存于密封容器中防止干燥。对于通过静脉穿刺获取的人血，样品应加入抗凝剂（本实验使用了常见的抗凝剂乙二胺四乙酸（EDTA））并在4 °C下保存不超过一周。对于贴壁细胞系，在胰酶消化前应彻底清洗去除死细胞，并...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
加达维（Gadavist，Bayer）	杰斐逊医学与影像公司（Jefferson Medical and Imaging）	2068062	加达维（Gadavist）含有1M钆布醇（gadobutrol），为钆的螯合物。我们购买了每盒15支的2 ml小瓶装产品。
方形玻璃毛细管	Vitrocom	8270	长度50 mm已足够
焦亚硫酸钠	Sigma-Aldrich	S9000	化学式：Na2S2O5
徕卡显微系统冷冻密封管密封剂（Leica Microsystems Critoseal tube sealant）	费舍尔科技公司（Fisher Scientific）	02-676-20
汉克平衡盐溶液（Hank's Balanced Salt Solution）	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
胰蛋白酶-EDTA（Trypsin-EDTA）	Sigma-Aldrich	T4049	也可使用针对所用细胞类型推荐的其他试剂
MICROLET 2 可调采血针装置	沃尔格林（Walgreens）	246567	只要按照生物安全规程使用，任何采血针装置均可接受
Microlet 采血针头	沃尔格林（Walgreens）	667474	必须为一次性使用，不得重复使用
豪斯亮线相位血细胞计数板（Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer）	费舍尔科技公司（Fisher Scientific）	02-671-6	也可使用任何其他偏好的细胞计数方法
ACK裂解缓冲液（ACK Lysing Buffer）	赛默飞世尔科技（ThermoFisher）	A1049201