通过注入微珠，该技术可激活蚊虫血淋巴循环系统中的黑色素化反应。解剖后，可通过测量覆盖在微珠表面的黑色素量来评估免疫反应强度。
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摘要
摘要
激活免疫反应是无脊椎动物研究中常用的手段，用于评估免疫的有效性及其作用机制。该方法通过向昆虫体内注射非致病性颗粒来实现，这些颗粒可被免疫系统识别并诱导免疫效应分子的产生。本文重点关注在冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）中激活黑化反应。黑化反应会导致外来颗粒和寄生虫被一层黑色的黑色素包裹。为诱导该反应，使用微毛细玻璃管将微珠接种至蚊子的胸腔内。24小时后，解剖蚊子以回收微珠。利用图像分析软件测定微珠的黑化程度。微珠不具备寄生虫的致病性，也无法逃避或抑制免疫反应。此类注射可用于评估免疫效能，以及免疫激活对其他生活史性状（如繁殖力或寿命）的影响。尽管该方法并不完全等同于直接研究宿主-寄生虫相互作用，但它是一种研究免疫及其进化生态学的有力工具。
引言
昆虫依赖免疫反应来抵御穿透其体壁或中肠上皮的寄生虫和病原体1-34。在蚊子中，这些免疫反应对细菌5、病毒6、丝虫线虫7以及疟原虫1,8,9均具有高效作用。在蚊子中，一种关键的免疫反应是通过黑色素对异物进行包囊10-12。这种包囊过程可发生在中肠或血淋巴循环系统中10-12。该黑色素化反应是前酚氧化酶级联反应的结果10-12，可能导致寄生虫死亡或被吞噬。在成蚊中，由于血细胞数量有限，黑色素化是一种体液免疫反应，例如针对疟原虫或丝虫线虫的反应7。而在其他一些昆虫中，黑色素化则是由血细胞直接聚集在寄生虫周围完成的7。此外，黑色素还对多种其他生理过程至关重要，例如卵的生成和体壁伤口的愈合7。
免疫反应的激活被用作研究多种农业和公共卫生模式系统中昆虫免疫的工具13-18。在非洲疟疾主要传播媒介冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）中，该方法被用于研究宿主与寄生虫之间的相互作用14-16,19。这些技术基于昆虫通过其模式识别受体（PRR）识别寄生虫的能力2。蚊子还可能通过识别病原体相关分子模式（PAMPs）等干扰其生物学过程的其他分子，或因胶原蛋白和核酸释放而识别自身受损细胞。蚊子的免疫细胞（如血细胞）参与这些识别过程20-23。主要的免疫信号通路包括Imd、Toll、JAK/STAT24以及RNA干扰（RNAi）通路25,26。Toll和Imd通路均可影响黑化反应，并与前酚氧化酶级联反应相互作用10-12。
用于诱导黑化反应的标准工具是将微小珠粒接种到蚊虫胸腔血淋巴中。随后可通过解剖蚊虫回收珠粒，并测量其黑色素包被程度19。在大多数研究中，每只蚊虫仅注射一颗珠粒15,16,27，但也可注射多颗珠粒，以研究黑化反应的极限能力19。珠粒需使用注射液（生理盐水）进行注射，以尽量减少对蚊虫生理状态的干扰并防止其脱水15,16,27。在该溶液中添加染料有助于珠粒的筛选。用于回收珠粒的解剖液也含有相同的染料15,16,27。
使用非致病性刺激物接种昆虫的优势在于能够专注于对免疫反应的直接影响。由于不存在寄生虫致病性28、免疫抑制29-31或免疫逃逸31-34所带来的复杂效应，因此可更清晰地观察免疫应答本身。此外，还可研究这些刺激对其他生活史性状（如寿命或繁殖力）的影响。因此，从事进化生态学研究的科研人员可能需要此类工具2,35,36。例如，在饥饿条件下，经免疫挑战的熊蜂寿命会缩短。在不同无脊椎动物模型中均观察到免疫刺激与免疫激活带来的类似负面影响，通常表现为寿命缩短或繁殖成功率降低13,27,37。此类研究可在不同环境条件下开展2,4,38。对于专注于免疫病理学的研究者而言，激活免疫系统同样具有重要意义39,40。
本方案基于利用蚊虫接种珠粒以诱导黑化反应，并直接测定黑色素的含量。这使得能够在不同实验条件下对黑化反应进行定性和定量研究。该工具还可拓展用于刺激其他免疫反应，例如对热灭活细菌的抗菌反应41。此外，该方法也可在多种生态条件下开展。
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方案
1. 注射与解剖用生理盐水溶液
- 通过将 NaCl、KCl 和 CaCl2 加入蒸馏水中，配制含有 1.3 mM NaCl、0.5 mM KCl 和 0.2 mM CaCl2、pH = 6.8 的生理盐水溶液。
- 将 1 ml 0.1% 甲基绿溶液加入 99 ml 生理盐水溶液中，以染色透明微珠。此为 0.001% 甲基绿“注射溶液"。
- 然后，将 5 ml 0.1% 甲基绿溶液加入 45 ml 生理盐水溶液中。此 0.01% 甲基绿“解剖溶液”中甲基绿浓度高 10 倍，有助于微珠的染色及其在解剖过程中的观察。
注意：如有需要，对缓冲液进行过滤除菌。
2. 毛细管制备
- 加热拉制微毛细玻璃管，使其形成非常细的尖端，尖端直径略大于最小珠子（φ = 40 µm）42。
- 使用镊子折断尖端或锯掉尖端，打开并调节每根毛细管。
3. 蚊虫饲养
- 在 26 ± 1 °C、70 ± 5% 相对湿度及 12:12 小时光暗循环条件下饲养 A. gambiae。保留成年雌蚊，并提供 10% 的糖溶液供其取食。
4. 使用毛细管进行微珠筛选
- 取0.009 g带负电荷的微珠（直径40-120 µm）放入5 cm的培养皿中，并提前30分钟加入5 ml注射溶液。
注意：目的是让染料对微珠染色，以便更易于挑选用于注射的微珠。若微珠未提供于无菌瓶中，则需进行高压灭菌处理。 - 将毛细管安装至毛细管移液球中，在双目显微镜下，从0.1 µl生理盐水溶液中肉眼挑选最小的微珠。
注意：若需同时接种多个微珠，请从总体积0.1 µl中选取三个微珠。
5. 蚊虫处理与接种
- 使用昆虫吸虫器，将每只蚊子放入一个50 ml的离心管中。
- 将离心管置于碎冰中短暂冷却每只蚊子（2-5分钟）。
- 在双目解剖显微镜下，将一只蚊子置于其右侧。
- 在体视显微镜下，用毛细管从蚊子胸部腔体左侧垂直刺穿外骨骼，牢固穿刺后注入液体和微珠。
注意：操作时应尽量使毛细管与蚊子身体保持垂直，以避免损伤飞行肌。 - 移除毛细管。
- 使用轻型昆虫镊子，将每只雌蚊单独放入一个180 ml的塑料杯中，杯口用蚊帐覆盖；提供10%的糖溶液供其取食。
注意：操作糖溶液时需格外小心，以免蚊子被糖液滴粘住。
6. 蚊子解剖与微珠摄影
- 接种后24小时检查蚊子是否存活。如果存活，检查其状态，并仅保留能够飞行的蚊子。
- 将这些蚊子在-20 °C下冷冻。
注意：如有需要，可在解剖前保存数天至数月。 - 在32倍放大倍率的双目显微镜下，使用镊子去除蚊子的翅膀。用透明胶带将翅膀固定在玻璃载片上，并记录每只蚊子对应的编号。
- 将玻璃载片放入扫描仪，以1,200 dpi的分辨率进行扫描。
注意：确保每只蚊子的编号清晰可读。 - 在玻璃载片上，于解剖液中使用镊子将胸部与头部和腹部分离。
- 用镊子打开胸部以取出小珠。
注意：未移向腹部、彼此不接触且大多数在血淋巴中自由漂浮的小珠。操作时需小心，避免用镊子压碎小珠，因为未黑化的小珠可能难以找到。等待1至5分钟，使小珠显色。 - 在拍照前，将小珠转移至玻璃载片上的一滴解剖液中。
注意：无需清洗小珠。 - 使用配备相机的显微镜，在标准光照条件下以400倍放大倍率拍摄每颗小珠的数字图像。
注意：不同图像之间不得更改照明条件，以便进行比较。
7. 图像分析：微珠黑色素化
- 打开图像分析软件。点击 "文件"，然后点击 "打开" 以查找一张微珠图像。
- 点击 "分析"。点击 "设置测量值"。在 "设置测量值" 窗口中勾选 "平均灰度值" 选项。
- 点击圆形选择工具图标。选择微珠的边缘区域；选择时应保持在微珠内部，避免包含其周围的发光晕圈。
- 点击 "分析" 菜单。点击 "测量"。获取微珠截面区域的平均灰度值及其大小。
- 为获得每个微珠的黑色素化值，请使用计算器或计算器软件执行以下操作："256 - 平均灰度值"。黑色素化测量值范围为 0 至 256，其中 0 代表完全白色的图像。
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结果
不同蚊子对珠子的黑色素沉积程度存在差异，一些珠子的黑色素覆盖较少（图1）。实际上，部分珠子因未发生黑色素化而保持蓝色，而另一些珠子则完全变暗（图1）。通过线性插值法将黑色素化值标准化为0至100之间的数值（0对应蓝色且未黑色素化的珠子，100对应深色且高度黑色素化的珠子）（图2a 和 图2b）。这些数值反映了珠子黑色素化的程度，从而指示了免疫反应的强度。
我们可以通过比较珠子的黑色素化值来相互比较它们。黑色素化反应通常遵循正态分布，这使得可以进行经典的统计分析，如方差分析（ANOVA）或正态广义线性模型（Gaussian glm）。
我们研究了在蚊子体内同时接种的微珠数量对黑化反应变化的影响。目的是...
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讨论
该注射技术可用于刺激并研究蚊子的黑化反应。例如，本文中我们研究了免疫刺激物剂量的影响。
该实验的关键步骤是正确地接种蚊子。若对飞行肌或蚊子本身造成过度损伤，可能会导致蚊子无法吸血，或在解剖前死亡。第二个关键步骤是将蚊子置于冰上足够长的时间以使其昏迷，但不能致死。使用较小的容器可加快这一过程，因为它能促进蚊子与冰的紧密接触。最后，在解剖过程中需格外小心，否则镊子可能弄碎微珠。嵌入蚊子组织中的微珠可能需要更长时间才能被解剖液染色。
使用多种类型的珠子（如中性、带正电或带负电的珠子，或玻璃珠）会产生不同的结果，因为它们的黑化程度可能不一致27,43。事实上，与中性珠子相比，带负电的珠子在蚊子之间的黑化反应中表现出更高的变异性27。而玻璃珠在蚊子体内呈惰性，完全不会引发黑化反应27。因此，可能更倾向于使用带负电的珠子，但不同珠子之间的比较也具有研究意义。然而，根据珠子类型的不同，注射液和解剖液中可能需要使用不同的染料；例如，使用玻璃珠时应采用甲苯胺蓝（cresyl vi...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究得到了纳沙泰尔大学资助。我们感谢所有帮助改进该技术的学生，特别是我们的同事凯文·蒂文（Kevin Thievent）。我们还要感谢托马斯实验室（Thomas Lab）的成员们提供实验室资源。感谢珍妮特·蒂普尔（Janet Teeple）在蚊虫饲养方面提供的帮助。此外，我们感谢普·贝克教授（Pr. Tom Baker）实验室的洛伊尔·霍尔（Loyal Hall）在制备微毛细玻璃管过程中提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 微毛细玻璃管 GB120TF-10 | science-products.com | GB120TF-10 | http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html |
| Microcaps 毛细移液管吸头 | Drumond | 1-000-9000 | |
| 带负电荷的 Sephadex CM C-25 微球 | Sigma-Aldrich, Steinheim, 德国 | C25120 SIGMA | 需少量即可启动 |
| 甲基绿 | Sigma-Aldrich | 323829 ALDRICH | 需少量即可启动 |
| ImageJ 软件 | 开源 | 版本 1.47f7 或更高版本 |
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