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ChIP-exo 方法：以接近碱基对精度鉴定蛋白质-DNA 相互作用

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DOI：

10.3791/55016

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2016年12月23日

 , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

本文内容

摘要

本文介绍了一种实现接近碱基对分辨率的蛋白质-DNA 相互作用研究的实验方案。该方法通过染色质免疫沉淀（ChIP-exo）选择性富集 DNA 片段，并对其进行外切酶处理，随后进行高通量测序。

摘要

染色质免疫沉淀（ChIP）是表观遗传学和基因调控领域中用于分离特定蛋白质-DNA 相互作用的不可或缺的工具。将 ChIP 与高通量测序（ChIP-seq）相结合，常用于确定与染色质相互作用的蛋白质在基因组中的定位。然而，ChIP-seq 受限于相对较低的定位分辨率（数百个碱基对）以及较高的背景信号。ChIP-exo 方法是对 ChIP-seq 的一种改进，显著提升了分辨率并降低了噪声。ChIP-exo 方法的关键特征是在文库构建流程中引入λ外切核酸酶消化，从而有效标记蛋白质-DNA 交联位点左右两侧的 5' DNA 边界。随后对 ChIP-exo 文库进行高通量测序。所得数据可用于深入揭示基因组功能结构的独有信息，并提供超高的分辨率。本文中，我们描述了已针对哺乳动物系统和新一代合成测序平台优化并简化的 ChIP-exo 方法。

引言

染色质免疫沉淀（ChIP）是一种强大的方法，可通过选择性富集与活细胞中特定蛋白质相互作用的DNA片段来研究基因调控机制。随着技术的进步，对ChIP富集DNA片段的检测方法不断发展，从单个基因座的检测（标准ChIP-qPCR），到寡核苷酸微阵列杂交（ChIP-chip），再到高通量测序（ChIP-seq）1。尽管ChIP-seq已得到广泛应用，但染色质的异质性以及非特异性DNA相互作用影响了数据质量，导致假阳性结果和定位不精确。为克服这些局限性，Frank Pugh博士开发了ChIP-exo方法2。ChIP-exo的显著特征在于引入了5'至3'外切核酸酶，从而有效实现转录因子结合位点的“足迹”定位。因此，ChIP-exo方法具有更高的分辨率、更宽的检测动态范围以及更低的背景噪声。

尽管ChIP-exo在技术上比ChIP-seq更难掌握，但由于研究希望利用多种生物系统获得独特的超高分辨率信息，该技术正被广泛采用3-8。事实上，ChIP-exo已成功应用于细菌、酵母、小鼠、大鼠和人类细胞系统。作为原理验证，ChIP-exo最初被用于鉴定少数酵母转录因子的精确结合基序2。该技术还曾在酵母中用于研究转录起始前复合物的组织结构，以及解析多种组蛋白的亚核小体结构9,10。最近，我们利用ChIP-exo解析了人类启动子上相邻的TFIIB和Pol II结合事件，并证明广泛的双向转录来源于不同的起始复合物11。

本文所示工作流程针对哺乳动物ChIP-exo进行了优化和简化图1）。首先，用甲醛处理活体原代细胞或组织培养细胞以固定 体内 通过共价交联固定蛋白质-DNA相互作用。细胞裂解后，染色质被剪切为约100-500个碱基对大小的片段。染色质免疫沉淀（ChIP）随后选择性富集与目标蛋白交联的DNA片段。此时通常构建ChIP-seq文库，该方法固有地将检测分辨率限制在数百个碱基对的平均片段大小范围内。然而，ChIP-exo利用λ外切酶修剪蛋白质-DNA交联位点左右两侧的5'端DNA边界，从而克服了这一限制。随后，从外切酶消化后的DNA构建测序文库，具体步骤如下所述。所获得的嵌套式5'端边界代表一个 在体 蛋白质-DNA 相互作用的足迹图1，步骤14），并通过高通量测序进行检测。尽管ChIP-exo技术比ChIP-seq更为复杂，但大多数步骤之间的转换仅需简单的磁珠洗涤，从而最大限度地减少了样品损失和实验变异性。重要的是，由于ChIP-exo是ChIP-seq的优化版本，任何在ChIP-seq中成功的样品在ChIP-exo中也应能够成功。

该 体内 ChIP-exo 在蛋白质-DNA 相互作用的足迹分析中产生的数据结构与 ChIP-seq 有本质区别。尽管常见的 ChIP-seq 峰识别工具也可应用于 ChIP-exo 数据，但为了获得最精确的峰识别结果，我们推荐使用专门针对 ChIP-exo 数据独特结构设计的生物信息学工具。这些工具包括 Genetrack、GEM、MACE、Peakzilla 和 ExoProfiler 12-15.

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方案

注意：双蒸 H2建议所有缓冲液和反应混合物使用O级或分子生物学级别相当的试剂。

第0天：材料准备与细胞收集

1. 缓冲液制备

  1. 配制裂解缓冲液 1 - 3（表 1 - 3），并在使用前向每种缓冲液 50 ml 中加入 100 µl 完整蛋白酶抑制剂储备液（CPI）。通过将一片试剂溶解于 1 ml 分子生物学级 H2O 中来制备 CPI 储备液。
  2. 配制 ChIP 缓冲液（表 4 - 7）。向封闭缓冲液和 RIPA 缓冲液各 50 ml 中加入 100 µl CPI 储备液。Tris 缓冲液和 ChIP 洗脱缓冲液中不加 CPI。

2. 接头寡核苷酸的退火

注意：特定的寡核苷酸序列可在附加信息部分找到。

  1. 配制接头退火混合液（表8 - 9）。涡旋混匀后短暂离心，收集管内液体。将每种混合液各100 µl分装至0.5 ml离心管中。
  2. 在PCR仪中运行程序（表10）以杂交寡核苷酸。
    将退火后的寡核苷酸储存于-80 °C。

3. 体内 甲醛介导的染色质交联

注意：对于典型的染色质免疫沉淀实验，起始材料应包含约 5000 万个细胞。

  1. 将新鲜的37%无甲醇甲醛原液加入经磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤的细胞培养物中，使终浓度为1%（v/v），充分混匀，并在室温下静置10分钟。
    注意：例如，我们通常将1.4 ml的37%无甲醇甲醛加入到50 ml室温PBS中的细胞内。此外，避免在培养基中进行甲醛交联，因为培养基中的蛋白质会消耗部分甲醛。
  2. 加入2.5 M甘氨酸至终浓度125 mM，以终止交联反应，充分混匀。
  3. 将细胞转移至冰上预冷的50 ml离心管中，在4 °C、1,000 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。
  4. 向细胞沉淀中加入1 ml预冷的1× PBS，用移液器重悬细胞，转移至1.5 ml离心管中。
  5. 在4 °C、2,000 × g条件下离心3分钟，吸除上清液。
  6. 立即用液氮将1.5 ml离心管中的细胞沉淀速冻，并于-80 °C保存。交联后的细胞在-80 °C下可长期稳定保存。

第1天：细胞裂解、超声处理和染色质免疫沉淀

4. 细胞裂解

注意：在所有细胞裂解步骤中，样品必须置于冰上或4 °C环境中，以尽量减少交联逆转。

  1. 短暂融化交联的细胞沉淀。将每份沉淀充分重悬于0.5 ml裂解缓冲液1中，并与4.5 ml裂解缓冲液1混合于15 ml聚苯乙烯管中。
  2. 在4 °C下于摇床上振荡孵育10分钟。在4 °C下以2,000 × g离心4分钟。弃去上清液。
  3. 将每份沉淀充分重悬于0.5 ml裂解缓冲液2中，重悬后加入4.5 ml裂解缓冲液2。
  4. 在4 °C下于摇床上振荡5分钟。在4 °C下以2,000 × g离心5分钟。弃去上清液，并轻轻在纸巾上拍干残留液体。
  5. 将每份沉淀充分重悬于0.5 ml裂解缓冲液3中，重悬后加入1 ml裂解缓冲液3。将核裂解物置于冰上，并立即进行超声处理。

5. 核裂解物的超声处理

注意：在所有超声处理步骤中，样品必须始终置于冰上，以最大限度减少交联逆转。本方案所用超声仪的具体型号见材料表。有关特定超声仪的使用细节及其他仪器的使用指南，请参见附加信息部分。

  1. 连接接头序列 在含有核提取物的15 ml聚苯乙烯管中（金属棒不应接触管壁）。
  2. 在冰水浴中对核裂解液进行超声处理，每次15分钟，共2次，中间间隔30秒开启/30秒关闭，使用中等功率。每次仅超声处理两个15 ml离心管。这些条件适用于多种细胞系和原代细胞类型，但如果染色质剪切不完全，可能需要进一步优化。
  3. 为检测超声处理结果，转移 2 x 10 µ将裂解液中的样品分装至1.5 ml离心管中。
    1. 为逆转交联，将前10个 µ10 μL 等分试样 µl TE-RNase A 和 0.2 µ蛋白酶K溶液。37℃孵育 °30 分钟，加入 4 µl 6x 二甲苯 DNA 染料。
    2. 为了保持交联，将第二次的10 µ2 μL 等分试样 µl 6x 二甲苯DNA染料
    3. 将两个样品在1.5%琼脂糖凝胶中以140 V电泳约30–45分钟，直至DNA标记中的溴酚蓝染料迁移至指定位置 ¾ 凝胶的下方位置。
  4. 如果超声处理成功（大部分DNA片段被剪切至100 - 500 bp），则将超声处理后的裂解液转移至含有150的2 ml离心管中 µ10% Triton X-100 溶液1升。涡旋振荡混匀。
  5. 为沉淀不溶性染色质和碎片，在 4 ℃ 下以 20,000 x g 离心超声处理后的核裂解液 10 分钟。 °C.
  6. 将上清液转移至新的 2 ml 离心管中。立即进行 ChIP 实验，或在 -80 ℃ 下保存样品 °C 无限期保存。超声处理后的提取物不应反复冻融超过一次。

6. 抗体与磁珠偶联

注意：切勿涡旋或反复冻融磁珠，因为这会导致磁珠破碎并增加背景信号。

  1. 充分混匀后，将 Y µl 磁珠悬液分装至 1.5 ml 离心管中，其中 Y = 1.1 × 2.5 µl ×（ChIP 样品数量）。2.5 µl 磁珠悬液的结合能力最高可达 13 µg IgG。用 1 ml 封闭缓冲液将磁珠洗涤 3 次。
  2. 为在洗涤后更一致地分装磁珠，使用封闭缓冲液将磁珠重悬于原悬液体积 10 倍的体积中（每 ChIP 25 µl），然后每份 ChIP 样品向 1.5 ml 离心管中分装 25 µl。
  3. 向相应重悬磁珠分装液中加入 5–10 µg 抗体。用封闭缓冲液将终体积调至 250 µl。在 4 °C 条件下于旋转平台上孵育 4 小时（也可选择在 4 °C 过夜孵育 16 小时）。
  4. 吸除上清液。为去除未结合或过量的抗体，用 1 ml 封闭缓冲液洗涤磁珠一次。
  5. 最后一次洗涤后，立即向抗体-磁珠偶联物中加入相当于 5000 万个细胞的超声破碎提取物（约 1.6 ml）。若超声破碎提取物尚未准备好，可将磁珠重悬于 100 µl 封闭缓冲液中直至使用。切记不可让磁珠干燥。

7. 染色质免疫沉淀（ChIP）

  1. 对于每个 ChIP 样本，将 1.5 ml 超声处理后的提取物与抗体-磁珠偶联物加入 1.5 ml 或 2 ml 离心管中混合。
  2. 将离心管置于微型旋转仪上，在 4 ˚C 条件下以转速 9 挡缓慢旋转孵育过夜（约 16 小时）。数分钟后检查，确保样本无泄漏且充分混匀。

第2天：染色质免疫沉淀洗涤及树脂上酶促反应

8. 染色质免疫沉淀洗涤

注意：为尽量减少交叉污染，每次洗涤后需短暂离心离心管。第一次吸液时，每个样品之间需更换吸头。在后续洗涤过程中，只要吸头未接触磁珠，可重复使用同一吸头。有关染色质免疫沉淀（ChIP）洗涤的正确操作步骤，请参见附加信息部分。

  1. 使用微量离心机短暂离心管子（约 500 x g 下离心 3 秒），使液体沉降至管盖，然后将管子置于磁力架上 1 分钟。仍在磁力架上时，吸除上清液。
  2. 向每根管中加入 0.75 ml RIPA 缓冲液。将管子从磁力架上取下，反复倒置数次以混匀。再将管子放回磁力架，吸除上清液。重复此步骤 7 次。
  3. 向每根管中加入 0.75 ml 10 mM Tris HCl（pH 7.5）。将管子从磁力架上取下，反复倒置数次以混匀。再将管子放回磁力架，吸除上清液。重复此步骤 2 次。
  4. 吸除最后一次洗涤液后，进入 polishing 步骤。
    注意：在 9.3、10.3、11.3、12.3、13.3、14.3 和 15.3 节的每次孵育反应后，均需短暂离心管子，置于磁力架上 1 分钟，吸除上清液，并用 0.75 ml RIPA 缓冲液洗涤 2 次，再用 0.75 ml Tris HCl（pH 7.5）洗涤 2 次。

9. 末端修复反应

  1. 完成末端修复主混合液的计算（表11）。在1.5 ml离心管中冰上配制末端修复混合液。用移液器吹打混匀。
  2. 在最后一次ChIP洗涤液吸除后，立即向磁力架上的每个样品树脂中加入50 µl末端修复混合液。在3 x g条件下于30 ˚C在恒温混匀仪中孵育30分钟。 
  3. 按照第8.4节注释中所述吸除最后一次洗涤液后，继续进行A尾加接步骤。

10. A尾反应

  1. 完成A尾修饰主混合液的计算（表12）。在1.5 ml离心管中冰上配制A尾修饰混合液，用移液器混匀。
  2. 在完成末端修复步骤后，立即将50 µl A尾修饰混合液加入仍置于磁力架上的各样品树脂中。在37 ˚C、3 ×g条件下于恒温混匀仪中孵育30分钟。 
  3. 按照第8.4节注释中所述，吸除最后一次洗涤液后，继续进行P7接头连接步骤。

11. P7 接头连接反应

  1. 填写连接反应主混合液的计算（表13）。在1.5 ml离心管中冰上配制连接混合液，用移液器吹打混匀。
  2. 在A尾修饰步骤完成后，立即将48 µl P7连接主混合液和2 µl不同的接头索引（Adapter Index）加入仍置于磁力架上的各样品树脂中。在25 ˚C下，于恒温混匀仪中以3 ×g的转速孵育2小时。 
    注意：为每个样品使用不同的索引可使单个流动池中测序的样品数量增加。
  3. 在按照第8.4节注释中所述吸除最后一次洗涤液后，继续进行Φ29切口修复步骤。

12. Phi-29 切口修复反应

  1. 填写Φ-29预混液的计算（表14）。在1.5 ml离心管中冰上配制Φ-29预混液，用移液器混匀。
  2. 在完成P7连接步骤后，立即向仍置于磁力架上的每个样品树脂中加入50 µl Φ-29预混液。在30 ˚C下，以3 × g转速在恒温混匀仪中孵育20分钟。 
  3. 按照第8.4节注释中所述，吸除最后一次洗涤液后，继续进行激酶反应。

13. 激酶反应

  1. 填写激酶主混合物的计算（表15）。在冰上1.5 ml离心管中配制激酶混合物。用移液器混匀。
  2. 在Φ-29反应步骤结束后立即向仍置于磁力架上的每个样品树脂中加入50 µl激酶混合物。在37 ˚C下，以3 × g转速在恒温混匀仪中孵育20分钟。
  3. 在按第8.4节后注释所述吸除最后一次洗涤液后，继续进行Lambda外切酶反应。

14. λ外切酶反应

  1. 填写λ外切酶主混合物的计算（表16）。在冰上将λ外切酶混合物加入1.5 ml离心管中，并用移液器混匀。
  2. 在激酶步骤完成后，立即将50 µl λ外切酶混合物加入仍置于磁力架上的每个样品树脂中。在37 ˚C下，以3 ×g的转速在恒温混匀仪中孵育30分钟。
  3. 在按照第8.4节后注释所述吸除最后一次洗涤液后，继续进行RecJf反应。

15. RecJf 核酸酶反应

  1. 填写RecJf主混合液的计算（表17）。在冰上用1.5 ml离心管配制RecJf混合液，用移液器混匀。
  2. 在完成Lambda外切酶处理步骤后，立即向仍置于磁力架上的每个样品树脂中加入50 µl RecJf混合液。在37 ˚C下，以3 × g转速在恒温混匀仪中孵育30分钟。
  3. 按照第8.4节注释中所述，吸除最后一次洗涤液后，继续进行ChIP洗脱步骤。

16. 洗脱与交联逆转

  1. 配制主混合液：样本数 × 1.1 × (200 µl ChIP 洗脱缓冲液 + 1 µl 20 mg/ml 蛋白酶K）于1.5 ml离心管中。加入200 µ向每个样品树脂中加入l ChIP洗脱缓冲液+蛋白酶K主混合液。
  2. 在 65 °C、3 × g 条件下孵育样品过夜（约 16 小时） ˚在温控混匀仪中 使用加热盖以防止冷凝。

第3天：DNA提取与接头连接

17. 洗脱与交联逆转（续）

  1. 在 65 ˚C 下过夜孵育后，短暂离心样品以收集冷凝液。将样品置于磁力架上 1 分钟。
  2. 将 200 µl 上清液转移至含有 200 µl TE 缓冲液（pH 7.5）的新 1.5 ml 离心管中。

18. 苯酚-氯仿-异戊醇（PCIAA）抽提

  1. 向每个样品中加入 400 µl 苯酚-氯仿-异戊醇，涡旋振荡 20 秒以充分混匀。
  2. 在室温（RT）下以 20,000 × g 离心 10 分钟。小心转移上层水相 325 µl 至新管中。
    注意：注意避免将有机相（下层）转移至新管中。
  3. 向每个样品中加入 1/10 体积的 3 M NaOAc（pH 5.5）和 1 µl 20 mg/ml 甘油原蛋白。若处理多个样品，可预先配制主混合液。
  4. 向每个样品中加入 3 倍体积的预冷 100% 乙醇。 涡旋振荡混匀，于 -80 ˚C 孵育 15 分钟。
  5. 在 4 ˚C 下以 20,000 × g 离心 15 分钟。 小心弃去上清液，注意勿扰动沉淀。
  6. 轻柔加入 500 µl 新鲜配制的预冷 70% 乙醇，注意勿扰动沉淀。在 4 ˚C 下以 20,000 × g 离心 5 分钟，小心弃去上清液。
  7. 在 45 ˚C 下使用真空浓缩仪干燥沉淀约 20 分钟（或直至完全干燥）。
    注意：本步骤为实验流程中的暂停点。干燥后的 DNA 沉淀可于 -20 ˚C 保存。
  8. 用 10 µl ddH2O 重悬沉淀。即使无法观察到干燥沉淀，也需反复吹打 DNA 沉淀所在区域。
  9. 根据样品数量，将每个样品的 10 µl 转移至新的 0.3 ml PCR 管或 8 连排管中。

19. P7 引物延伸反应

  1. 填写P7引物延伸主混合液的计算（表18）。在冰上将延伸混合液配制于1.5 ml离心管中，用移液器混匀。
  2. 向每份10 µl样品中加入10 µl延伸混合液（不含Φ-29 DNA聚合酶），用移液器混匀。
  3. 将样品放入热循环仪中，运行程序（表19），使引物与模板退火，直至程序中的30 ˚C“保持”步骤。
  4. 在程序的30 ˚C“保持”步骤期间，向每个反应中加入1 µl Φ-29 DNA聚合酶，用移液器混匀，然后继续运行程序的剩余部分（表19）。

20. A尾反应

  1. 完成A尾修饰主混合液的计算（表20）。在1.5 ml离心管中冰上配制A尾修饰混合液，用移液器混匀。
  2. 向每个样本中加入10 µl A尾修饰混合液，用移液器混匀。
  3. 在热循环仪中，37 ˚C孵育30分钟，随后75 ˚C加热失活20分钟。

21. P5 适配子连接反应

  1. 填写P5接头连接 主混合物的计算（表21）。在1.5 ml离心管中冰上配制连接混合液，用移液器混匀。
  2. 向每个样品中加入20 µl P5连接混合液，用移液器混匀。
  3. 在PCR仪中，将样品于25 ˚C孵育2小时。

22. 磁珠纯化

注意：有关磁珠纯化的制造商信息，请参见材料部分。

  1. 将每个50 µl样品转移至新的1.5 ml离心管中。
  2. 在室温下，将纯化磁珠置于微型离心管旋转仪上，以15档速度重悬15分钟。移液前切勿让磁珠沉降。
  3. 向样品中加入60 µl纯化磁珠（纯化磁珠与样品体积比为1.2:1，此比例至关重要，可有效去除短于200个碱基对的DNA片段）。用移液器吹打混匀20秒。
  4. 在室温下，将纯化磁珠置于微型离心管旋转仪上，以15档速度重悬3分钟。短暂离心。
  5. 将离心管置于磁力架上静置1分钟。用移液器小心吸除并弃去上清液。
    注意：此步骤中切勿使用真空抽吸，以免吸走纯化磁珠。
  6. 将样品置于磁力架上时，向每个样品中加入400 µl新鲜配制的室温70%乙醇。切勿混匀。吸除上清液。重复此步骤两次。
  7. 在室温下干燥纯化磁珠10分钟。当磁珠完全干燥时，其颜色将由深变浅呈浅棕色，且树脂沉淀物表面可见细小裂纹。
  8. 为洗脱DNA，向磁珠中加入40 µl 10 mM Tris缓冲液（pH 7.5）。充分吹打混匀20秒。
  9. 将样品置于磁力架上静置1分钟。缓慢吸取36 µl洗脱液，并直接转移至0.3 ml PCR管中。
  10. 立即进行PCR反应，或将洗脱液于-20 ˚C保存。

第4天：PCR与凝胶分析

23. 聚合酶链式反应

  1. 完成PCR主混合液的计算（表22）。配制PCR混合液。用移液器轻轻混匀，避免产生气泡。
  2. 向每份36 µl的DNA样本中加入14 µl PCR混合液。轻轻移液混匀。将样本置于冰上，待准备放入热循环仪时再取出。
  3. 设置阳性PCR对照，加入一份先前制备好的文库；设置阴性PCR对照，加入水。使用PCR程序（表23）在热循环仪中运行样本。

24. 凝胶制备、DNA 切胶与可视化

  1. 彻底清洁并用去离子水冲洗合适大小的电泳槽。制备含0.5 mg/ml溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶，使用可容纳60 μl样品的厚壁宽孔梳子 µ1.
    注意：溴化乙锭（EtBr）为致癌物，必须小心操作。
  2. 短暂离心PCR样本管以收集冷凝液。
  3. 向合并后的样品中加入1/5体积的6x 二甲苯DNA染料。DNA染料中不要使用溴酚蓝，因为它与样品DNA的迁移位置相同。
  4. 将整个样品加入每个孔中，建议样品之间留有空孔。
    注意：具有相同索引的文库不得在同一块凝胶中进行电泳。
  5. 加入 7 µl 在样品两侧上样100 bp DNA标记。以140 V电压电泳约30-45分钟，直至标记中的溴酚蓝染料迁移至适当位置 ¾ 凝胶的下方远处
  6. 在低紫外光设置的凝胶成像仪上观察并成像凝胶。切下含有 200 - 500 bp DNA 片段的琼脂糖凝胶区域。务必小心避免切出在 125 bp 处迁移的接头二聚体条带。
  7. 将每块切下的凝胶条放入一个15 ml离心管中。记录每块凝胶条的净重，并将该重量直接写在管壁上。
  8. 对切下的凝胶进行成像、保存并加注释，以确认所选片段大小范围正确。

25. 凝胶纯化

  1. 根据制造商说明书纯化切下的凝胶片段中的DNA，但需进行以下修改。
  2. 将凝胶片段置于摇床平台上室温振荡溶解，大约需要20分钟。
  3. 为获得高纯度DNA，在溶解后的凝胶溶液通过柱子后，用0.5 ml Buffer QG洗涤柱子。
  4. 用Buffer PE洗涤后，将柱子在室温静置2–5分钟，然后在室温下以13,000 × g离心1分钟。
  5. 为预留PCR反应主混合液的空间，用40 µl EB缓冲液将样品洗脱至新的1.5 ml离心管中。

26. DNA 定量

  1. 根据制造商的说明（表24）准备样品，并使用光学管在指定仪器中测定样品。
  2. 一旦完成ChIP-exo文库的定量，应将其提交至采用边合成边测序化学法16的测序平台进行测序，该平台需与本方案中使用的DNA接头兼容。
    注意：通常2 µl样品足以用于定量，但如果样品浓度较低，可能需要更多体积。DNA产量通常在50至200 ng之间。
  3. 定量完成后，将样品储存在-20 ˚C条件下。

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结果

以下图示展示了本实验方案中 ChIP-exo 协议的代表性结果。与传统 ChIP-seq 方法相比（其酶促步骤较少），ChIP-exo 需要进行十一个依次依赖的酶促反应（图 1）。因此，每一步操作都必须谨慎进行，以确保各反应组分被准确加入相应的反应主混合液中。我们建议根据反应表格建立一个公式化的电子表格，以自动完成反应主混合液的计算，打印生成的表格，并在将各组分加入主混合液后逐一核对确认。

在整个实验流程中，我们采用多种质量控制措施，以确保获得高质量的测序结果（图2）。每个染色质免疫沉淀（ChIP）反应包含三个基本组分：1）来自目标细胞的超声破碎染色质提取物，2）针对目标蛋白的特异性抗体，以及3）用于固定沉淀免疫复合物的Protein G（或Protein A）树脂。获得高质量的超声破碎染色质提取物（图2A）可能具有较大挑战性，因为不同细胞类型和超声设...

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讨论

我们提出一种功能基因组学方案，可无偏倚地以接近碱基对分辨率在全基因组范围内精确确定染色质相互作用蛋白的结合位置。实现接近碱基对分辨率定位的最关键步骤是在免疫沉淀物仍结合于磁性树脂时，对ChIP富集的DNA进行外切核酸酶处理。理论上，蛋白质复合物可能阻碍 体内 任意亚基的足迹分析（footprinting）例如， 染色质重塑复合物或核小体核心颗粒）。然而，如先前所报道的那样 10由于甲醛是一种效率较低的交联剂，因此在同一细胞的同一基因位点处，复合物的多个亚基同时与DNA以及彼此之间发生交联的可能性会逐渐降低。因此， 体内 利用ChIP-exo技术，可以对蛋白质复合物中的各个亚基（例如核小体中的单个组蛋白亚基）进行足迹分析。

ChIP-exo 最显著的优势是其接近碱基对水平的分辨率和低背景信号。这种超高分辨率使得在全基因组范围内获得详细的结构和空间信息成为可能，而这是目前其他任何方法都无法实现的。另一方面，ChIP-exo 的主要局限性在于它是一种技术上较难掌握的分子生物学方法。此外，ChIP 步骤的一般性局限...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Venters实验室以及分子生理学与生物物理学系成员提供的有益讨论。特别感谢Frank Pugh在我作为博士后研究员期间给予的指导、 mentorship 以及关于ChIP-exo技术细节的许多富有洞见的讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
37% 甲醛，无甲醇，10 x 10 ml 安瓿瓶ThermoFisher Scientific28908第 3 节
完全蛋白酶抑制剂混合物（CPI）Roche Life Science11873580001第 4、8 节
Bioruptor 超声破碎仪DiagenodeUCD200第 5 节
15 ml 聚苯乙烯管BD Falcon352095第 5 节
MagSepharose Protein G Xtra 磁珠GE Healthcare28-9670-66第 6 节
DynaMag-1.5 ml 侧置磁力架Invitrogen12321D第 6–17、22 节
微型管旋转仪Fisher Scientific05-450-127第 7、22 节
T4 DNA 聚合酶New England BioLabsM0203第 9 节
DNA 聚合酶 I，KlenowNew England BioLabsM0210第 9 节
10x NEBuffer 2（10x 反应缓冲液 2）New England BioLabsB7002第 9–11、13、15、20 节
Thermomixer CEppendorf5382第 9–16 节
ATPRoche Life Science010419979001第 9、11、13 节
dNTPsNew England BioLabsN0447第 9、12、19、23 节
T4 多核苷酸激酶New England BioLabsM0201第 9、13 节
dATPNew England BioLabsN0440第 10、20 节
Klenow 3'-5' 外切酶缺陷型New England BioLabsM0212第 10、20 节
T4 DNA 连接酶 New England BioLabsM0202第 11、21 节
Φ-29 DNA 聚合酶New England BioLabsM0269第 12、19 节
10x Φ-29 缓冲液New England BioLabsB0269第 12、19 节
λ 外切核酸酶New England BioLabsM0262第 14 节
10x λ 缓冲液New England BioLabsB0262第 14 节
RecJf 外切核酸酶New England BioLabsM0264第 15 节
蛋白酶 KRoche Life Science03115828001第 16 节
糖原Roche Life Science010901393001第 18 节
10x T4 连接酶缓冲液New England BioLabsB0202第 21 节
AMPure XP（纯化）磁珠 Beckman CoulterA63881第 22 节
Q5 Hot Start DNA 聚合酶 New England BioLabsM0493第 23 节
5x Q5 缓冲液（5x PCR 缓冲液）New England BioLabsB9027第 23 节
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28704第 25 节
Qubit 荧光计InvitrogenQ33216第 26 节
光学透明 Qubit 管 InvitrogenQ32856第 26 节
Qubit dsDNA 高灵敏度检测试剂盒InvitrogenQ32851第 26 节

参考文献

  1. Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
  2. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
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  4. Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
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  18. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
  19. Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147(2013).
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