ChIP-exo 方法：以接近碱基对精度鉴定蛋白质-DNA 相互作用

摘要

本文介绍了一种实现接近碱基对分辨率的蛋白质-DNA 相互作用研究的实验方案。该方法通过染色质免疫沉淀（ChIP-exo）选择性富集 DNA 片段，并对其进行外切酶处理，随后进行高通量测序。

摘要

染色质免疫沉淀（ChIP）是表观遗传学和基因调控领域中用于分离特定蛋白质-DNA 相互作用的不可或缺的工具。将 ChIP 与高通量测序（ChIP-seq）相结合，常用于确定与染色质相互作用的蛋白质在基因组中的定位。然而，ChIP-seq 受限于相对较低的定位分辨率（数百个碱基对）以及较高的背景信号。ChIP-exo 方法是对 ChIP-seq 的一种改进，显著提升了分辨率并降低了噪声。ChIP-exo 方法的关键特征是在文库构建流程中引入λ外切核酸酶消化，从而有效标记蛋白质-DNA 交联位点左右两侧的 5' DNA 边界。随后对 ChIP-exo 文库进行高通量测序。所得数据可用于深入揭示基因组功能结构的独有信息，并提供超高的分辨率。本文中，我们描述了已针对哺乳动物系统和新一代合成测序平台优化并简化的 ChIP-exo 方法。

引言

染色质免疫沉淀（ChIP）是一种强大的方法，可通过选择性富集与活细胞中特定蛋白质相互作用的DNA片段来研究基因调控机制。随着技术的进步，对ChIP富集DNA片段的检测方法不断发展，从单个基因座的检测（标准ChIP-qPCR），到寡核苷酸微阵列杂交（ChIP-chip），再到高通量测序（ChIP-seq）¹。尽管ChIP-seq已得到广泛应用，但染色质的异质性以及非特异性DNA相互作用影响了数据质量，导致假阳性结果和定位不精确。为克服这些局限性，Frank Pugh博士开发了ChIP-exo方法²。ChIP-exo的显著特征在于引入了5'至3'外切核酸酶，从而有效实现转录因子结合位点的“足迹”定位。因此，ChIP-exo方法具有更高的分辨率、更宽的检测动态范围以及更低的背景噪声。

尽管ChIP-exo在技术上比ChIP-seq更难掌握，但由于研究希望利用多种生物系统获得独特的超高分辨率信息，该技术正被广泛采用^3-8。事实上，ChIP-exo已成功应用于细菌、酵母、小鼠、大鼠和人类细胞系统。作为原理验证，ChIP-exo最初被用于鉴定少数酵母转录因子的精确结合基序²。该技术还曾在酵母中用于研究转录起始前复合物的组织结构，以及解析多种组蛋白的亚核小体结构^9,10。最近，我们利用ChIP-exo解析了人类启动子上相邻的TFIIB和Pol II结合事件，并证明广泛的双向转录来源....

方案

注意：双蒸 H₂建议所有缓冲液和反应混合物使用O级或分子生物学级别相当的试剂。

第0天：材料准备与细胞收集

1. 缓冲液制备

1. 配制裂解缓冲液 1 - 3（表 1 - 3），并在使用前向每种缓冲液 50 ml 中加入 100 µl 完整蛋白酶抑制剂储备液（CPI）。通过将一片试剂溶解于 1 ml 分子生物学级 H₂O 中来制备 CPI 储备液。
2. 配制 ChIP 缓冲液（表 4 - 7）。向封闭缓冲液和 RIPA 缓冲液各 50 ml 中加入 100 µl CPI 储备液。Tris 缓冲液和 ChIP 洗脱缓冲液中不加 CPI。

2. 接头寡核苷酸的退火

注意：特定的寡核苷酸序列可在附加信息部分找到。

1. 配制接头退火混合液（表8 - 9）。涡旋混匀后短暂离心，收集管内液体。将每种混合液各100 µl分装至0.5 ml离心管中。
2. 在PCR仪中运行程序（表10）以杂交寡核苷酸。
   将退火后的寡核苷酸储存于-80 °C。

结果

以下图示展示了本实验方案中 ChIP-exo 协议的代表性结果。与传统 ChIP-seq 方法相比（其酶促步骤较少），ChIP-exo 需要进行十一个依次依赖的酶促反应（图 1）。因此，每一步操作都必须谨慎进行，以确保各反应组分被准确加入相应的反应主混合液中。我们建议根据反应表格建立一个公式化的电子表格，以自动完成反应主混合液的计算，打印生成的表格，并在将各组分加入主混合液后逐一核对确认。

在整个实验流程中，我们采用多种质量控制措施，以确保获得高质量的测序结果（图2）。每个染色质免疫沉淀（ChIP）反应包含三个基本组分：1）来自目标细胞的超声破碎染色质提取物，2）针对目标蛋白的特异性抗体，以及3）用于固定沉淀免疫复合物的Protein G（或Protein A）树脂。获得高质量的超声破碎染色质提取物（图2A）可能具有较大挑战性，因为不同细胞类型和超声设.......

讨论

我们提出一种功能基因组学方案，可无偏倚地以接近碱基对分辨率在全基因组范围内精确确定染色质相互作用蛋白的结合位置。实现接近碱基对分辨率定位的最关键步骤是在免疫沉淀物仍结合于磁性树脂时，对ChIP富集的DNA进行外切核酸酶处理。理论上，蛋白质复合物可能阻碍 体内 任意亚基的足迹分析（footprinting）例如， 染色质重塑复合物或核小体核心颗粒）。然而，如先前所报道的那样 ¹⁰由于甲醛是一种效率较低的交联剂，因此在同一细胞的同一基因位点处，复合物的多个亚基同时与DNA以及彼此之间发生交联的可能性会逐渐降低。因此， 体内 利用ChIP-exo技术，可以对蛋白质复合物中的各个亚基（例如核小体中的单个组蛋白亚基）进行足迹分析。

ChIP-exo 最显著的优势是其接近碱基对水平的分辨率和低背景信号。这种超高分辨率使得在全基因组范围内获得详细的结构和空间信息成为可能，而这是目前其他任何方法都无法实现的。另一方面，ChIP-exo 的主要局限性在于它是一种技术上较难掌握的分子生物学方法。此外，ChIP 步骤的一般性局限.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
37% 甲醛，无甲醇，10 x 10 ml 安瓿瓶	ThermoFisher Scientific	28908	第 3 节
完全蛋白酶抑制剂混合物（CPI）	Roche Life Science	11873580001	第 4、8 节
Bioruptor 超声破碎仪	Diagenode	UCD200	第 5 节
15 ml 聚苯乙烯管	BD Falcon	352095	第 5 节
MagSepharose Protein G Xtra 磁珠	GE Healthcare	28-9670-66	第 6 节
DynaMag-1.5 ml 侧置磁力架	Invitrogen	12321D	第 6–17、22 节
微型管旋转仪	Fisher Scientific	05-450-127	第 7、22 节
T4 DNA 聚合酶	New England BioLabs	M0203	第 9 节
DNA 聚合酶 I，Klenow	New England BioLabs	M0210	第 9 节
10x NEBuffer 2（10x 反应缓冲液 2）	New England BioLabs	B7002	第 9–11、13、15、20 节
Thermomixer C	Eppendorf	5382	第 9–16 节
ATP	Roche Life Science	010419979001	第 9、11、13 节
dNTPs	New England BioLabs	N0447	第 9、12、19、23 节
T4 多核苷酸激酶	New England BioLabs	M0201	第 9、13 节
dATP	New England BioLabs	N0440	第 10、20 节
Klenow 3'-5' 外切酶缺陷型	New England BioLabs	M0212	第 10、20 节
T4 DNA 连接酶	New England BioLabs	M0202	第 11、21 节
Φ-29 DNA 聚合酶	New England BioLabs	M0269	第 12、19 节
10x Φ-29 缓冲液	New England BioLabs	B0269	第 12、19 节
λ 外切核酸酶	New England BioLabs	M0262	第 14 节
10x λ 缓冲液	New England BioLabs	B0262	第 14 节
RecJf 外切核酸酶	New England BioLabs	M0264	第 15 节
蛋白酶 K	Roche Life Science	03115828001	第 16 节
糖原	Roche Life Science	010901393001	第 18 节
10x T4 连接酶缓冲液	New England BioLabs	B0202	第 21 节
AMPure XP（纯化）磁珠	Beckman Coulter	A63881	第 22 节
Q5 Hot Start DNA 聚合酶	New England BioLabs	M0493	第 23 节
5x Q5 缓冲液（5x PCR 缓冲液）	New England BioLabs	B9027	第 23 节
QIAquick 凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704	第 25 节
Qubit 荧光计	Invitrogen	Q33216	第 26 节
光学透明 Qubit 管	Invitrogen	Q32856	第 26 节
Qubit dsDNA 高灵敏度检测试剂盒	Invitrogen	Q32851	第 26 节