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方法文章

扫描电镜（SEM）用于难处理的植物、卵菌和真菌样品的实验方案

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DOI：

10.3791/55031

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2017年2月3日

 ,  ,  ,  , 
1Biodiversity and Conservation Department, Real Jardín Botánico, CSIC, 2Research Support Unit, Real Jardín Botánico, CSIC, 3Mycology Department, Real Jardín Botánico, CSIC, 4Division of Glycoscience, AlbaNova University Center, Royal Institute of Technology (KTH)

本文内容

摘要

在扫描电子显微镜观察的生物样品制备过程中，存在的问题包括细胞塌陷、来自湿润微环境的样品处理以及细胞破坏。本文汇编并详细描述了适用于制备具有挑战性样品（如花分生组织、卵菌囊、真菌（伞菌目））的低成本且相对快速的实验方案。

摘要

在使用扫描电子显微镜（SEM）进行观察时，生物样品制备过程中常见的问题包括细胞塌陷、来自湿润微环境的样品处理以及细胞破坏。本文以幼嫩的花组织、卵菌囊泡和真菌孢子（伞菌目）为例，介绍针对脆弱样品的特定制备方案，以克服在SEM成像过程中样品处理所面临的主要挑战。

使用 FAA（甲醛-醋酸-酒精）固定并经临界点干燥仪（CPD）处理的花分生组织未出现细胞壁塌陷或器官变形。这些结果对于花发育过程的重建至关重要。采用基于 CPD 的类似方法处理来自湿润微环境的样本（如戊二醛固定的卵菌囊孢），是检测不同基质上诊断性特征（例如，囊孢刺）差异生长的理想方案。在经过再水化、脱水及 CPD 处理后，附着于真菌孢子的助细胞未发生破坏，这对于后续开展这些细胞的功能研究具有重要意义。

本文所述方案为获取高质量图像以重建生长过程并研究诊断特征提供了低成本且快速的替代方法。

引言

在生物学中，扫描电子显微镜（SEM）已被广泛应用于结构演化、比较形态学、器官发育以及种群或物种特征的研究1. 由于其对微观结构提供二维视图，自20世纪下半叶以来，微形态学和分类学等领域受益于扫描电镜（SEM）技术的进步th 世纪。例如，20世纪70年代引入的溅射镀膜技术使得对茎尖和花朵等精细材料的观察成为可能，从而改善了非导电组织的成像效果2,3扫描电子显微镜利用从样品表面激发出的电子，在高真空环境中重现样品的表面形貌。4.

涉及扫描电子显微镜（SEM）的研究主要集中在结构特征的推断以及生长过程的重建。通过SEM观察，已发现大量与多种生物分类学和系统学相关的新结构特征。例如，用于物种鉴定或种上分类的植物性状，如木材的具缘纹孔5、柱头多样性6、蜜腺和花部形态7、8、毛状体细微结构9以及花粉粒特征10、11，若无SEM则难以清晰观察。此外，常规SEM也已成功应用于长期福尔马林固定的生物样本12和植物标本馆标本的观察13。

另一方面，利用扫描电镜研究生长过程重建涉及广泛的主题，例如器官发育14、细菌诱导的感染15、植物根系生理学16、寄生生物与宿主的附着机制17,18、药物对寄生生物的影响19、霉菌寄生与抗生作用20,21、生长畸形22、野生型与突变个体的比较发育23，以及完整的生活史周期24。尽管环境扫描电子显微镜（ESEM）25在观察生长过程中湿润生物样品方面可能具有重要优势，但即使在ESEM的低真空条件下，精细材料仍可能受损，因此需要进行充分处理，以避免丧失有价值的形态学观察信息。

本文综述了针对三类不同样品进行扫描电镜（SEM）观察的具体实验方案：花分生组织、卵菌（Saprolegnia）以及真菌材料。这些方案总结了我们以往基于扫描电镜研究的实践经验26,27,28,29,30,31,32,33，其中发现了特定的技术难点及相应的替代解决方案。在植物比较发育与结构研究领域，扫描电镜的应用始于20世纪70年代34,35，自此研究人员发现某些花部特征比此前认为的更具可变性36。花发育过程的重建需要获取从幼嫩花分生组织到开花期之间的所有发育阶段图像。为实现这一目标，样品的表面形貌和细胞壁完整性在固定及后续脱水处理后必须保持完好无损。幼嫩的花分生组织尤其容易发生细胞壁塌陷（图1a, 1b）。类似地，蜜腺、花瓣、柱头和孢子囊等精细结构也需要高效且无损伤的处理方案。本综述总结了一套优化的实验流程，以确保幼嫩且脆弱的组织在扫描电镜成像中保持完整。

在卵菌纲（Oomycetes，属于茸鞭生物界 Stramenopiles）中——这是寄生生物中多样性最高且分布最广的类群之一，其宿主范围涵盖微生物、植物以及无脊椎动物和脊椎动物37- 孢子在湿润环境中生长和发育。这种条件对扫描电镜观察构成挑战，因为孢子需要一种不适合标准扫描电镜流程的适宜基质。在卵菌中，物种的 水霉菌 因其可导致水产养殖、渔业和两栖动物种群数量严重下降而备受关注38微形态学特征，例如包囊的钩状刺，已被发现可用于鉴定以下物种： 水霉菌， 这对于建立感染控制和潜在治疗方法至关重要39. 本实验方案旨在比较囊肿在不同基质上棘状突起的生长模式，并对样品进行临界点干燥（CPD）处理，以备后续扫描电镜（SEM）观察。

在第三种情况下，对真菌Phellorinia herculanea f. stellata f. nova（Agaricales）的孢子进行检查后获得了一些有趣的发现31。在观察孢子的同时，扫描电镜（SEM）下还发现了一组意料之外的护育细胞。采用以往的传统方法和未经处理的样品时，这些护育细胞完全塌陷（图1c）。而通过对本文所述的标准方法进行简单但关键的改进，即可进一步推断与孢子相关的特定组织结构（图1d）。

本文综述了可用于解决被子植物、卵菌和伞菌目在扫描电镜观察中所遇到不同问题的详细扫描电镜（SEM）实验方案，例如细胞塌陷和分生组织收缩、孢囊刺生长不理想以及短暂性组织破坏等问题。

用于形态学分析的具有不同表面纹理的花粉粒的扫描电镜显微照片。
图1：未经（a, c）和经过（b, d）FAA-乙醇-临界点干燥（CPD）处理的样品比较。（a-b）Anacyclus clavatus 花蕾，处于中期发育阶段。经四氧化锇处理的花蕾46（a）与经FAA-CPD方案处理的花蕾（b）。（c-d）携带Phellorinia herculanea f. stellata 孢子的营养细胞。未经任何处理的干燥样品（c）与采用本文所述Agaricales目真菌处理方案的样品（d）。孢子呈橙色。比例尺：(a-b) 100 µm，(c-d) 50 µm。照片由Y. Ruiz-León拍摄。 请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

注意：本方案包含六个主要部分，其中三个部分专门针对特定生物体（第1-3部分），另外三个部分描述适用于所有生物体的通用步骤（第4-6部分）。星号（*）表示由实验人员修改的步骤。

1. 植物发育中及完全形成结构的研究

  1. 样本采集与固定
    1. 若植物材料采集地无法使用通风橱，则将材料放入离心管中，并加入70%乙醇进行固定和浸润。理想情况下，应在材料经FAA固定48小时后（步骤1.1.1–1.1.3）再浸入乙醇，以避免乙醇造成过度脱水。若采集地可使用通风橱，则忽略此步骤，直接进行步骤1.1.1。
    2. 在配备醛类过滤装置的通风橱中配制福尔马林-乙酸-酒精（FAA）固定液。加入85份70%变性乙醇、10份60%甲醛溶液和5份冰醋酸。应在固定材料前现配FAA，因其不建议长期储存。40.
    3. 在通风橱下，将FAA固定液倒入若干个广口且防漏的塑料瓶中。塑料瓶的数量应与待处理样本数量一致，并制作标签用于样本标识。
    4. 选择待固定的花芽或营养分生组织，确保其未受到昆虫、真菌或极端天气条件的损伤。剪取枝条，去除不需要的组织，并将样品置于 立即 在 FAA 溶液中。
    5. 72–96 小时后，将 FAA 倒入塑料容器中用于化学废弃物处理。立即用新鲜的 70% 乙醇清洗样品三次，以去除残留的 FAA。固定后的材料可无限期保存在 70% 乙醇中。
  2. 解剖与脱水
    1. 在体视显微镜下，使用超细镊子、针、镊子、刷子和显微手术刀，在70%乙醇中解剖固定材料（组织最大尺寸应约为1 cm）3，或对于平面材料为2 cm）。将样品解剖至盛有乙醇的培养皿中，以防止组织干燥。使用底部铺有干燥黑色硅胶的培养皿，以便更清晰地观察呈对比色的白色组织。
    2. 将解剖后的材料放入临界点干燥仪（CPD， 图 2a）。此时，将容器浸入含有70%乙醇的培养皿中，并放入样本标识标签（用纸和铅笔制作）。为便于后续操作时更有效地干燥，请避免在同一容器中混合幼嫩样本与成熟样本。*
    3. 将容器盖上盖子后放入装有足量70%乙醇的塑料离心管中。若样品不能立即处理，可将离心管在室温下放置过夜。
    4. 将解剖后的材料依次转移至密封罐或离心管中的以下乙醇梯度溶液：70%、90%、100% 和 100%。每种溶液中至少浸泡 1 小时。最后在 100% 乙醇溶液中过夜保存。
    5. 将装有材料的容器转移至CPD（第4节）。
  3. 用于扫描电镜观察的植物组织制备与固定
    1. 在扫描电镜样品台下方写上样品编号即， 铝制样品台）。用双面胶带覆盖样品台顶部。将样品台放入样品 holder（图2b).
    2. 在体视显微镜下，小心打开携带经临界点干燥（CPD）处理后已干燥的幼嫩样品的容器。需注意，经过CPD处理后，样品会变得轻盈且对静电敏感。取出样品后应立即关闭容器，以避免灰尘或杂质污染。
    3. 将样品置于载片粘性表面时，需预先规划好理想位置（一旦样品接触表面，便很难再移除）。此时不要尝试进行复杂的解剖操作，仅需去除容易移除的多余组织即可。进行孢粉学研究时，应解剖花药并将其打开，使花粉暴露在载片表面。
    4. 将较长的样本（例如， 2 cm）的样本（如花序）置于水平位置。若可能，应将相同结构的样本按极性、侧面和底部视图进行排列。样本在载物台上的摆放应留出足够的间距。
    5. 如果样品无法立即处理，应将其置于含硅胶的密闭容器中过夜保存，避免重新吸水（图2c)*. 使用溅射镀膜仪对样品进行镀膜处理，并将其转移至扫描电镜进行观察（第5和第6节）。

实验陶瓷烧结；设备示意图、显微镜样品台、炉子、致密化测量仪。
图2：扫描电镜观察前样品处理与操作工具。（a）钢制样品容器，带孔洞侧壁，用于临界点干燥仪腔室中乙醇与CO2的置换。（b）置于塑料样品架内的钢制样品台。（c）用于保护样品免受湿气和灰尘影响的玻璃容器；底部设有硅胶干燥剂存放仓。（d）临界点干燥仪。前方从左至右分别为压力表、电源开关、温度控制系统和温度显示屏。CO2-乙醇置换的常规工作压力为60 bar（800 psi）。顶部有四个阀门（进气、排水、通风和排气控制），围绕中央样品腔室对称分布。照片由Y. Ruiz-León和M.A. Bello拍摄。请点击此处查看该图的高清版本。

2. 包囊行为的研究 水霉菌 (卵菌)在不同表面的行为

  1. 囊肿的培养与固定
    1. 制备蛋白胨葡萄糖（PG-l）培养基41 使用D-(+)-葡萄糖（6 g）和霉菌学蛋白胨（3 g）*，加入自来水至900 mL，121°C高压灭菌40分钟 121 °C. 倒入50 mL先前已高压灭菌的溶液A（NaH2PO4，0.13 M）和 50 mL 溶液 B（Na2HPO4，0.13 M。
    2. 来自菌株的保藏培养物 Saprolegnia parasitica 在PGA培养基（即PG-l培养基，但在高压灭菌前向葡萄糖和蛋白胨中加入10 g欧洲细菌学琼脂）上培养，在0.5 mL PG-l液滴中于24–48 h内生长菌丝菌落 20 °C 在培养皿中。通过无菌自来水洗涤菌丝体三次，并在15小时内于 20 °C42,43.
    3. 轻轻吹打悬浮液上层，收集释放出的次生游动孢子，并将其分装至每份1 mL。将游动孢子剧烈涡旋振荡30秒，以诱导形成次生孢囊44.
    4. 为检测囊肿棘突的差异性生长，在不同的培养皿（p60）中，分别将0.5 mL次级囊肿悬液接种于不同表面即， 碳、金和铜制透射电镜载网；鲑鱼和无须鳕鱼鳞片（先前已漂白）；以及玻璃盖玻片）。将包囊在 20 °C 70分钟，这有利于包囊附着于表面。
    5. 吸去液体，向每个表面加入0.5 mL的2%戊二醛以固定包囊。将样品置于通风橱内室温下孵育1小时。
    6. 去除戊二醛，并通过乙醇系列（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 和 100%）对样品进行脱水，每种乙醇溶液加入 5 mL，作用 15 分钟。当样品进入最后的 100% 乙醇溶液后，可在密封的培养皿中保存长达一个月。至此，样品已准备好进行临界点干燥（CPD）。
    7. 小心地将培养皿中的载网和标尺转移至适用于CPD（第4节）的样品台。此步骤应使用CPD专用载网架或堆叠式样品架，以确保样品彼此分离。使用镊子夹取载网和标尺，并注意在整个过程中保持载网上的包囊始终朝上。*
  2. 用于扫描电镜观察的囊肿样品制备与载样
    1. 将载网和标尺固定在预先贴有双面导电胶带并从底部做好标记的铝 stub 上。
    2. 将样品转移至溅射镀膜仪（第5节）。
    3. 在扫描电镜下观察样品（第6节）。

3. 在扫描电镜下研究Phellorinia herculanea的腊叶标本真菌孢子

  1. 孢子的复水与脱水
    1. 用滤纸小心包裹每个样品，制成约0.5–1 cm2的铅笔标记信封，注意不要压碎样品。用回形针封好滤纸。将包装好的样品转移至培养皿中，加入10 mL水，使孢子周围的组织复水。
    2. 立即将样品放入微波炉中（600 W，约20秒）。当水开始蒸发时取出样品，并在室温下冷却。
    3. 将样品依次通过以下乙醇系列：30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%和100%。根据样品量，使用烧杯或离心管进行此步骤。每种溶液中均放置15分钟。
    4. 将样品放入临界点干燥仪中（第4节）。
  2. 孢子的制片与扫描电镜观察前准备
    1. 打开信封。将孢子倒在预先贴有双面胶的样品台上。或者，也可用样品台的黏性表面直接收集孢子，注意避免压碎样品*。
    2. 若样品中孢子数量较少，除前述步骤外，可剪取信封的一小片（约1 mm2），置于新的样品台上*。
    3. 将组织放入溅射镀膜仪中（第5节）。
    4. 在扫描电镜下观察（第6节）。

4. 使用临界点干燥仪（CPD，图2d）对材料进行干燥

  1. 在通风良好的区域使用CPD，并确认机器的所有阀门均已关闭。检查样品室是否为空且清洁。
  2. 开启机器，确认温度控制系统会自动进行自检。如果CPD配有外部制冷浴系统，开启前应检查水位。
  3. 按照所用CPD设备的制造商说明进行乙醇和CO2的置换操作。出于安全考虑，此步骤应在接受过设备操作培训的人员监督下进行。请注意，设备可能经历快速的压力变化，存在剧烈爆裂的风险。
  4. 取出样品后，若处理植物组织，则继续进行步骤1.3；若处理卵菌孢囊，则进行步骤2.2；若处理真菌孢子，则进行步骤3.2。

5. 使用溅射镀膜仪在样品上镀金（图 3a）

  1. 检查溅射镀膜仪，确认金阴极靶材状态良好。必要时，使用浸有90%乙醇的无尘布清洁真空腔室壁和腔室盖。
  2. 在溅射样品台的每个样品 stub 孔旁边标记数字，以便在显微镜下进一步识别样品。小心地将载有样品的 stub 放置到位并固定。使用旋转行星式样品台，以确保对表面不规则的样品实现均匀镀膜。
  3. 按照制造商的说明调整工作距离等设置（例如，30 mm），操作气体压力（例如， 5 × 10-1 - 7 × 10-1 毫巴），溅射时间（例如， 50 s），金层厚度（例如， 12 nm）时的电流（例如，15 mA）和电压供应（例如， 600 V45.
  4. 移除样品台并将其送至扫描电镜（第6节）。或者，将样品台放入含有硅胶的密封容器中图2c).

冷冻制样装置（a）和用于样品分析的电子显微镜设置（b）
图3：溅射镀膜仪（a）和扫描电子显微镜（b）。（a）真空腔室的正面视图（左侧）、气体阀门、计时器、真空和电流控制装置。（b）扫描电镜主要组件的侧视图（从左到右）：带有样品室的真空柱、带控制系统的计算机屏幕以及腔室监视器。照片由Y. Ruiz-León拍摄。请点击此处查看此图的放大版本。

6. 扫描电子显微镜（SEM，图3b）下的观察

  1. SEM 启动
    1. 按照制造商的说明启动并设置扫描电子显微镜（SEM），调节样品高度和物镜光阑直径（例如， 用于植物 2 µm 以及针对真菌和卵菌 4 µm），工作电压（例如， 15 kV
    2. 检查电子束系统的正确对准情况，并根据制造商的说明设置轴向对准和消像散器。调节工作距离以获得合适的工作景深。
  2. 图像采集
    1. 获取样品的清晰图像，并将其作为起点。将放大倍数调至接近最高水平，再次聚焦图像。选择具有表面不规则特征（如孔洞）的区域。校正像散，并调节至最佳对比度和亮度。
    2. 使用高分辨率拍摄SEM图像。如果图像显示样品带电，则使用BSE探测器；否则，设置SE探测器。根据制造商的说明更换探测器。

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结果

花的发育及发育中和完全形成植物结构的固定

采用本文所述的 FAA-CPD 方法，可对幼嫩和成熟的植物组织进行最佳的固定和脱水处理，以用于扫描电镜观察。由于芽的表面形貌和形状未受到细胞收缩的扭曲影响，因此可对花部发育等过程进行重建（图 1b、1d、4a-f）。具有复杂形态的结构可成功覆盖一层均匀的导电材料（溅射镀膜仪中的金属），从而获取原本难以观察到的细节（图 4g-I、5e）。对于来自湿润微环境的样品，若脱水和镀膜处理不当，以往在电子束流下易发生过度充电，而如今也可获得高质量图像（图 4f、5a、5b）。关键的细微结构，如花粉壁表面（图 5b、5c）以及不同类型的表皮毛被（图 5d-g），均可在无伪影或非理想颗粒干扰、无形态扭曲的情况下进行深入研究。

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讨论

与标准的扫描电镜（SEM）操作流程相比，本文所介绍的方法具有相对快速、易于操作且成本较低的特点。根据样本数量及处理难易程度，通常需要四到五天时间即可获得高质量的图像。只要在临界点干燥（CPD）和扫描电镜操作过程中采取适当的安全防护措施，整个流程易于掌控。需特别注意甲醛和戊二醛的使用（见实验方案步骤1.1.1至1.1.3及2.1.5）。在某些步骤中，如有必要，可在不损害样本或影响前期操作的前提下长时间暂停流程。例如， 步骤 1.1.5、1.2.3 和 1.3.5）。在成本方面，大部分设备可重复用于多次制备（例如， CPD 铝制容器和样品 stub 持架），且所用试剂均为商业供应商提供的非昂贵化学品。

这些方法的缺点包括需要妥善处理醛类和乙醇的化学废弃物，以及关键耗材的缺乏和技术本身的局限性。应提前充分检查材料，例如溅射镀膜仪用的金靶盘和临界点干燥仪用的CO2钢瓶。若持续使用，实验室需储备多个此类物品，最终将增加成本。由于个别研究人员往往难以承担此类耗材维护所产生的费用，或其本身并不需要持续使用扫描电镜，目前这些操作通常在提供外...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划的资助，资助协议编号为634429。本出版物仅反映作者的观点，欧盟委员会对其中所含信息的任何使用均不承担责任。我们还感谢西班牙高等科研理事会皇家植物园提供的资金支持。SR感谢欧盟[ITN-SAPRO-238550]对其在Saprolegnia研究方面的支持。我们还要感谢Francisco Calonge慷慨提供Phellorinia herculanea的图像，以及B. Pueyo对样品的处理（图5）。所有图像均由位于马德里的西班牙高等科研理事会皇家植物园扫描电镜服务中心拍摄。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸无特定供应商皮肤刺激，眼睛刺激
铝制样品台Ted Pella, Inc.16221www.tedpella.com
离心管无特定供应商
临界点干燥仪Polaron Quatum TechnologiesCPD7501
D-(+)-葡萄糖Merck1,083,421,000
双面透明胶带无特定供应商
无水乙醇无特定供应商易燃
欧洲细菌学琼脂Conda1800.00www.condalab.com
滤纸无特定供应商
镊子无特定供应商
4% 甲醛无特定供应商有害，急性毒性，皮肤致敏性，致癌性。易燃
玻璃盖玻片无特定供应商
玻璃密封容器 无特定供应商
25% 戊二醛 DC 253857.1611  (L)Dismadel S.L.3336www.dismadel.com
真菌蛋白胨Conda1922.00www.condalab.com
针头无特定供应商
培养皿无特定供应商
塑料容器无特定供应商
临界点干燥仪用带盖样品架  Ted Pella, Inc.4591www.tedpella.com
手术刀无特定供应商
扫描电子显微镜日立S3000N
扫描电镜软件
溶液 A：NaH2PO4
溶液 B：Na2HPO4
样品载台无特定供应商
溅射镀膜仪BalzersSCD 004
体视显微镜无特定供应商
透射电子显微镜 (TEM) 载网Electron Microscopy SciencesG200 (方格网)www.emsdiassum.com
镊子无特定供应商

参考文献

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