扫描电子显微镜（SEM）协议有问题的工厂，卵菌和真菌样本

Summary

用于扫描电子显微镜观察的生物样品处理问题包括细胞塌陷、湿微环境中样品的处理和细胞破坏。此处编译并详细介绍了适用于制备具有挑战性的样品（如花分生组织、卵菌囊肿和真菌 （Agaricales））的低成本且相对快速的方案。

Abstract

在生物样品的用于与扫描型电子显微镜（SEM）的观察处理常见的问题包括细胞崩溃，治疗从湿微环境和细胞破坏样品。用年轻的花组织，卵菌囊肿，真菌孢子（伞菌）为例，具体的协议来处理这里描述了克服一些在样品处理的SEM下图像采集的主要挑战细腻的样本。

固定FAA花分生组织（福尔马林乙醇），并与临界点干燥机（CPD）进行处理并没有显示倒塌细胞壁内或扭曲器官。这些结果对于花发育的重建的关键。从湿微环境，如戊二醛固定的卵菌囊肿样品的类似的基于CPD处理，是最佳的，以测试的诊断特征在不同类型的su差动生长（ 例如，囊肿刺）bstrates。补液，脱水和CPD处理，这些细胞的进一步的功能研究的一个重要步骤后避免附着到真菌孢子护士细胞的破坏。

这里详细的协议代表了低成本和收购的良好品质的图像重建生长过程和研究诊断的特点迅速的替代品。

Introduction

在生物学上，利用扫描电子显微镜（SEM）已经扩展到构造演化，比较形态学，器官发育，以及人口或物种¹表征的研究。随着微观结构的二维视图，如微观和系统学区从SEM技术的进步，因为在20 ^世纪下半叶获利。例如，引入在20世纪70年代的溅射镀膜方法制成精巧的材料可能观测诸如茎尖和花增强非导电组织^2,3的摄像。 SEM使用从试样的表面喷出重现地形在高真空环境中^4个电子。

在涉及SEM研究主要集中在结构特征既推理和growt重建^ h的进程。而相关的分类结构的新字符的范围广泛的生物系统学已经从SEM的观察发现。例如，用于物种诊断或supraspecific分类植物性状，如木材^_5，柱头多样性^6，蜜腺和花形态^7,8，毛状体细节⁹和花粉的笼罩下的凹坑^10，11，将不能....

Protocol

注:本协议包括六个主要部分，三专门为特定的生物（第1-3款），以及三个描述程序都（4-6）常见。星号（*）表示实验者修改的步骤。

1.制定研究和完全形成植物结构

1. 收集和固定
   1. 如果该植物材料被收集在一个地方，没有访问一个通风橱，介绍并浸泡在70％乙醇中的材料离心管中。理想的情况下，浸入该材料在美国联邦航空局（步骤1.1.1-1.1.3）48小时后，以避免在乙醇过度脱水。如果通风橱是植物材料可以访问，请忽略此步骤并继续1.1.1。
   2. 在装有醛滤波器通风橱制备福尔马林乙醇（FAA）固定剂。添加85份的70％的变性乙醇，10份的60％的甲醛溶液，以及5份冰醋酸的。准备FAA刚刚杀青的材料，作为其长期储存之前，不建议^40。
   3. 在通风橱，倒FAA的股票进入各个广口防漏塑料瓶。因为有提供样品使用尽可能多的瓶子，并创建样品标识标签。
   4. 选择花卉或营养分生组织修复，从而确保它们不会被昆虫，真菌，或极端的天气条件损坏。切枝，除去不需要的材料，并立即沉积在样品中的FAA的溶液。
   5. 72-96小时后，倒入FAA转化为化学处理的塑料容器。立即，洗样品三次以新鲜的70％乙醇，以除去任何残留的FAA的。固定材料可以无限期储存在70％的乙醇。

Results

花发育和发展的固定和完全形成植物结构

使用这里描述的FAA-CPD协议，年轻而成熟的植物组织中得到最佳的固定和脱水SEM成像。过程如花发育可以重建，因为芽的地形和形状不被细胞萎缩（ 图1b，1d中，图4a-f）的失真。具有复杂形状的结构可以成功地覆盖有导电材料（从溅射涂布机的金属）的均匀层，从而允许否则无法访问细节（ 图4G-I，5E）的回收。从湿的微环境，其中使用的未来样本良好质量的图像，以与电子电流被过充电，如果严重脱水和涂敷，可以实现（ 图4F，5A，5B）。重要的细节，如花粉壁表面（图5B，5C）和不同类型的indumenta（ 图5D-G）可以在深入研究不人工或不希望的颗粒或变形的形状。

Discussion

相对于标准的SEM协议，这里提出的步骤包括相对快速的，容易执行，和低成本的方法。取决于样品的量和在便于加工，需要四到五天以获得良好质量的图像。包括为CPD和SEM的操作足够的安全预防措施，程序很容易处理。尤其应谨慎用福尔马林和戊二醛采取（参见1.1.1步骤1.1.3来和协议的2.1.5）。有一定的步骤，其中，如果需要的话，该过程可以停止一段长的时间，而不会损坏样品或破坏前面的步骤（ 例如，步骤1.1.5，1.2.3和1.3.5）。在成本方面，许多设备的可重复使用几制剂（ 例如，CPD铝容器和存根持有人），和所用试剂可从所有的商业供应商的非昂贵的化学品。

这些程序的缺点是需要适当的化学废物处置的醛和乙醇以及缺乏关键用品和技术的限制。材料如金磁盘的溅射镀膜机和CO ₂筒的CPD应提前好进行检查。如果他们是在连续使用，实验室将需要他们的多支股票，最终提升了成本。因为个别的研究人员往往不能证明从维护这些类型用品的衍生的费用，或者它们根本不需要连续使用扫描电子显微镜，这些程序时下趋向于与外部电子显微镜服务实验室中进行。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
乙酸	无特定供应商		皮肤刺激、眼睛刺激
铝桩	Ted Pella， Inc.	16221	www.tedpella.com
离心管	无特定供应商
Critical Point Dryer	Polaron Quatum Technologies	CPD7501
D-（+）-Glucose	Merck	1,083,421,000
双面胶带	无特定供应商 无特定供应商
绝对	无特定供应商		易燃
欧洲细菌琼脂	Conda	1800.00	www.condalab.com
滤纸	无特定供应商
镊子	无特定供应商
福尔马林 4%	无特定供应商		有害、急性毒性、皮肤致敏性、致癌性。易燃
玻璃盖玻片	无特定供应商
玻璃密封容器	无特定供应商
戊二醛 25% DC 253857.1611 （升）	Dismadel S.L.	3336	www.dismadel.com
菌蛋白胨	Conda	1922.00	www.condalab.com
针	无特定供应商
塑料容器	无特定供应商
带盖样品架  用于临界点干燥器	泰德·佩拉公司	4591
www.tedpella.com 手术刀	无特定供应商
扫描电子显微镜
软件
样品架	无特定供应商
溅射镀膜机	Balzers	SCD 004
立体显微镜	无特定供应商
透射电子显微镜 （TEM） 网格	电子显微镜	G200 （方形网格）	www.emsdiassum.com
镊子	无特定供应商