在扫描电子显微镜观察的生物样品制备过程中，存在的问题包括细胞塌陷、来自湿润微环境的样品处理以及细胞破坏。本文汇编并详细描述了适用于制备具有挑战性样品（如花分生组织、卵菌囊、真菌（伞菌目））的低成本且相对快速的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
在使用扫描电子显微镜（SEM）进行观察时，生物样品制备过程中常见的问题包括细胞塌陷、来自湿润微环境的样品处理以及细胞破坏。本文以幼嫩的花组织、卵菌囊泡和真菌孢子（伞菌目）为例，介绍针对脆弱样品的特定制备方案，以克服在SEM成像过程中样品处理所面临的主要挑战。
使用 FAA（甲醛-醋酸-酒精）固定并经临界点干燥仪（CPD）处理的花分生组织未出现细胞壁塌陷或器官变形。这些结果对于花发育过程的重建至关重要。采用基于 CPD 的类似方法处理来自湿润微环境的样本（如戊二醛固定的卵菌囊孢），是检测不同基质上诊断性特征（例如，囊孢刺）差异生长的理想方案。在经过再水化、脱水及 CPD 处理后，附着于真菌孢子的助细胞未发生破坏，这对于后续开展这些细胞的功能研究具有重要意义。
本文所述方案为获取高质量图像以重建生长过程并研究诊断特征提供了低成本且快速的替代方法。
引言
在生物学中，扫描电子显微镜（SEM）已被广泛应用于结构演化、比较形态学、器官发育以及种群或物种特征的研究1. 由于其对微观结构提供二维视图，自20世纪下半叶以来，微形态学和分类学等领域受益于扫描电镜（SEM）技术的进步th 世纪。例如，20世纪70年代引入的溅射镀膜技术使得对茎尖和花朵等精细材料的观察成为可能，从而改善了非导电组织的成像效果2,3扫描电子显微镜利用从样品表面激发出的电子，在高真空环境中重现样品的表面形貌。4.
涉及扫描电子显微镜（SEM）的研究主要集中在结构特征的推断以及生长过程的重建。通过SEM观察，已发现大量与多种生物分类学和系统学相关的新结构特征。例如，用于物种鉴定或种上分类的植物性状，如木材的具缘纹孔5、柱头多样性6、蜜腺和花部形态7、8、毛状体细微结构9以及花粉粒特征10、
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方案
注意：本方案包含六个主要部分，其中三个部分专门针对特定生物体（第1-3部分），另外三个部分描述适用于所有生物体的通用步骤（第4-6部分）。星号（*）表示由实验人员修改的步骤。
1. 植物发育中及完全形成结构的研究
- 样本采集与固定
- 若植物材料采集地无法使用通风橱，则将材料放入离心管中，并加入70%乙醇进行固定和浸润。理想情况下，应在材料经FAA固定48小时后（步骤1.1.1–1.1.3）再浸入乙醇，以避免乙醇造成过度脱水。若采集地可使用通风橱，则忽略此步骤，直接进行步骤1.1.1。
- 在配备醛类过滤装置的通风橱中配制福尔马林-乙酸-酒精（FAA）固定液。加入85份70%变性乙醇、10份60%甲醛溶液和5份冰醋酸。应在固定材料前现配FAA，因其不建议长期储存。40.
- 在通风橱下，将FAA固定液倒入若干个广口且防漏的塑料瓶中。塑料瓶的数量应与待处理样本数量一致，并制作标签用于样本标识。
- 选择待固定的花芽或营养分生组织，确保其未受到昆虫、真菌或极端天气条件的损伤。剪取枝条，去除不需要的组织，并将样品置于 立即 在 FAA 溶液中。
- 72–96 小时后，将 FAA 倒入塑料容器中用于化学废弃物处理。立即用新鲜的 70% 乙醇清洗样品三次，以....
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结果
花的发育及发育中和完全形成植物结构的固定
采用本文所述的FAA-CPD法，可对幼嫩和成熟的植物组织进行最佳的固定与脱水处理，以用于扫描电镜观察。由于芽体的表面形貌和形态未受到细胞皱缩的干扰，因此可对花部发育等过程进行三维重建（图1b、1d、4a-f）。具有复杂形态的结构可被溅射镀膜仪产生的导电金属层均匀覆盖，从而获取原本难以观察到的细微结构（图4g-I、5e）。对于来自湿润微环境的样品，若脱水或镀膜不当，以往常因电子束过度充电而影响成像，如今也可获得高质量图像（图4f、5a、5b）。诸如花粉壁表面（图5b、5c）以及不同类型毛被结构（图5d-g）等重要细节，均可在无伪影或形变干扰的情况下进行深入研究。
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讨论
与标准的扫描电镜（SEM）操作流程相比，本文所介绍的方法具有相对快速、易于操作且成本较低的特点。根据样本数量及处理难易程度，通常需要四到五天时间即可获得高质量的图像。只要在临界点干燥（CPD）和扫描电镜操作过程中采取适当的安全防护措施，整个流程易于掌控。需特别注意甲醛和戊二醛的使用（见实验方案步骤1.1.1至1.1.3及2.1.5）。在某些步骤中，如有必要，可在不损害样本或影响前期操作的前提下长时间暂停流程。例如， 步骤 1.1.5、1.2.3 和 1.3.5）。在成本方面，大部分设备可重复用于多次制备（例如， CPD 铝制容器和样品 stub 持架），且所用试剂均为商业供应商提供的非昂贵化学品。
这些方法的缺点包括需要妥善处理醛类和乙醇的化学废弃物，以及关键耗材的缺乏和技术本身的局限性。应提前充分检查材料，例如溅射镀膜仪用的金靶盘和临界点干燥仪用的CO2钢瓶。若持续使用，实验室需储备多个此类物品，最终将增加成本。由于个别研究人员往往难以承担此类耗材维护所产生的费用，或其本身并不需要持续使用扫描电镜，目前这些操作通常在提供外.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划的资助，资助协议编号为634429。本出版物仅反映作者的观点，欧盟委员会对其中所含信息的任何使用均不承担责任。我们还感谢西班牙高等科研理事会皇家植物园提供的资金支持。SR感谢欧盟[ITN-SAPRO-238550]对其在Saprolegnia研究方面的支持。我们还要感谢Francisco Calonge慷慨提供Phellorinia herculanea的图像，以及B. Pueyo对样品的处理（图5）。所有图像均由位于马德里的西班牙高等科研理事会皇家植物园扫描电镜服务中心拍摄。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸 | 无特定供应商 | 皮肤刺激，眼睛刺激 | |
| 铝制样品台 | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| 离心管 | 无特定供应商 | ||
| 临界点干燥仪 | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Merck | 1,083,421,000 | |
| 双面透明胶带 | 无特定供应商 | ||
| 无水乙醇 | 无特定供应商 | 易燃 | |
| 欧洲细菌学琼脂 | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| 滤纸 | 无特定供应商 | ||
| 镊子 | 无特定供应商 | ||
| 4% 甲醛 | 无特定供应商 | 有害，急性毒性，皮肤致敏性，致癌性。易燃 | |
| 玻璃盖玻片 | 无特定供应商 | ||
| 玻璃密封容器 | 无特定供应商 | ||
| 25% 戊二醛 DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| 真菌蛋白胨 | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| 针头 | 无特定供应商 | ||
| 培养皿 | 无特定供应商 | ||
| 塑料容器 | 无特定供应商 | ||
| 临界点干燥仪用带盖样品架 | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| 手术刀 | 无特定供应商 | ||
| 扫描电子显微镜 | 日立 | S3000N | |
| 扫描电镜软件 | |||
| 溶液 A：NaH2PO4 | |||
| 溶液 B：Na2HPO4 | |||
| 样品载台 | 无特定供应商 | ||
| 溅射镀膜仪 | Balzers | SCD 004 | |
| 体视显微镜 | 无特定供应商 | ||
| 透射电子显微镜 (TEM) 载网 | Electron Microscopy Sciences | G200 (方格网) | www.emsdiassum.com |
| 镊子 | 无特定供应商 |
参考文献
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputte....
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重印与许可
