我们描述了从C57Bl/6J对照小鼠、紧皮小鼠以及用IRF5抑制肽处理的紧皮小鼠中分离心脏细胞外基质的方法。同时，我们还描述了对来自C57Bl/6J小鼠、紧皮小鼠以及用IRF5抑制肽处理的紧皮小鼠的离体血管进行的血管舒张研究。
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摘要
摘要
干扰素调节因子5（IRF5）对于细胞决定其产生促炎性或抗炎性反应至关重要。IRF5能够使细胞在不同信号通路之间转换，这一特性使其成为极具吸引力的治疗靶点。我们利用分子建模软件设计了一种模拟肽IRF5D，用于小分子和肽类的设计。
IRF5D 抑制了 IRF5，减少了紧皮小鼠（Tsk/+）细胞外基质的改变，并改善了内皮依赖性血管舒张功能。通过生物膜干涉技术结合实验测定，IRF5D 与重组 IRF5 的解离常数（Kd）为 3.72 ± 0.74 × 10-6 M。使用不同浓度的 IRF5D（0 至 100 µg/mL，处理 24 小时）处理内皮细胞（EC）后，细胞增殖和凋亡未发生显著变化。对 Tsk/+ 小鼠给予 IRF5D 治疗（1 mg/kg/天，皮下注射，持续 21 天）。经 IRF5D 治疗后，IRF5 和 ICAM 的表达水平降低。通过检测面部动脉的血管舒张反应发现，接受 IRF5D 治疗的 Tsk/+ 小鼠内皮功能较未接受 IRF5D 治疗的小鼠得到改善。作为一种转录因子，IRF5 可从细胞质转运至细胞核。通过在不同心脏细胞外基质上培养心肌细胞并进行免疫组织化学染色，评估 IRF5 的转位情况。与未接受 IRF5D 治疗的动物相比，经 IRF5D 处理（50 µg/mL，24 小时）的 Tsk/+ 小鼠心肌细胞中 IRF5 阳性细胞核数量减少。这些结果表明，IRF5 在 Tsk/+ 小鼠的炎症和纤维化过程中发挥着重要作用。
引言
细胞生长和细胞死亡免疫反应的调控是干扰素调节因子转录因子家族功能的核心。IRF5在调控促炎性的1型免疫反应与以组织修复为目标的2型免疫反应之间发挥关键作用。IRF5在癌症1以及自身免疫疾病2,3,4,5中具有重要作用。
紧皮小鼠（Tsk/+）是由于纤维蛋白-1基因发生重复突变而形成的组织纤维化和硬皮病模型。该突变导致皮肤紧绷以及结缔组织增加。这些小鼠会出现心肌炎症、纤维化，最终发展为心力衰竭5,6,7,8,9。硬皮病是一种自身免疫性纤维化疾病，在美国约影响15万名患者6。该疾病的主要特征是包括心脏在内的内脏器官发生纤维化7,
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方案
本研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。实验方案已获机构动物护理与使用委员会批准（方案编号：AUA#1517）。所有涉及小鼠的研究均符合美国公共卫生署（PHS）政策要求。
1. 诱饵肽的设计
- 基于IRF5的三维结构进行设计。设计一条17个氨基酸的肽段，命名为IRF5D（ELDWDADDIRLQIDNPD），其中用天冬氨酸（D）取代丝氨酸（S），以模拟IRF5在421–438位点（ELSWSADSIRLQISNPD）的磷酸化状态。结合对三维结构中巯基基团的分析及对IRF5激活机制的已有认知， 即，丝氨酸磷酸化，提示靶向IRF5的一种策略是生成诱饵肽。参见 图 1. 为了确定三维结构中的最佳区域，使用分子建模软件来设计小分子和多肽15.
注意：此过程中的关键步骤是获得靶蛋白的三维结构及其可能的结合位点。IRF5 的三维结构能够准确反映其在磷酸化后形成二聚体的方式。将天冬氨酸取代丝氨酸或苏氨酸的步骤由外部完成。该肽段单独合成，不与 IRF5 连接。 - 通过将丝氨酸（S）替换为天冬氨酸（D），复制磷酸化结构域。根据原始序列（ELSWSADSIRLQISNPD），合成新的IRF5S肽，其氨基酸序列为Ac-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH₂。2 (IRF5D)
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结果
结果表明 图1 展示如何设计一种多肽。 图1左上图显示了IRF5中被多种激酶磷酸化的区域（位于两个黄色箭头之间，氨基酸425-436）。 图1，右上方显示一个黄色椭圆形区域，为IRF5的磷酸化结构域结合位点。将3DSH的二聚体结构旋转后，可观察到位于螺旋2（aa303-312）左侧的一个裂隙或凹谷，该位置即为IRF5的磷酸化尾部结构域在完全激活状态下预期结合的位点即，丝氨酸磷酸化），形成同源二聚体并进入其假定的生物学活性状态。
在图2中展示了通过生物膜干涉技术测定的结合活性。为确定诱饵肽IRF5D无细胞毒性，在用不同浓度的IRF5D处理细胞后，检测了细胞增殖和凋亡情况（图3）。经IRF5D处理Tsk/+小鼠后，炎症标志物ICAM-1和IRF5的表达水平均降低，该结果通.......
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讨论
研究目的是设计一种IRF5抑制剂，以阐明IRF5在Tsk/+小鼠心脏炎症、纤维化和血管功能中的作用。研究发现，IRF5D未诱导细胞增殖或凋亡；此外，炎症减轻，血管功能得到改善。这些数据表明，IRF5在Tsk/+小鼠心脏炎症和纤维化的发生发展中具有重要的机制性作用，并具备作为治疗靶点的潜力。
第一步是设计一种抑制剂。在设计肽段时，需要考虑多个因素：序列长度、二级结构、易氧化残基、氨基酸组成、酰胺化与封端、N-末端氨基酸和C-末端氨基酸，以及配体连接方式。理想的序列长度为10至15个残基，以确保最佳的总体产率、更少的杂质以及降低成本。需要注意避免形成β-折叠等二级结构，因为β-折叠可能导致大量缺失序列的产生。应避免使用易氧化的残基，以防发生副反应而影响肽段的活性。为了控制溶解性、合成效率和纯化效果，肽段中疏水性氨基酸的比例应低于50%，并确保含有足够数量的带电残基。N-末端和C-末端应选择不带电荷的形式。避免在N-末端使用谷氨酸，避免在C-末端使用半胱氨酸、脯氨酸和甘氨酸。在肽段与配体之间添加一个间隔基，以最小化折叠效应。因此，可能需要将其以无电荷的酰胺形式进行屏蔽。
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目HL-089779（DW）、HL-112270（KAP）和HL-102836（KAP）以及Cimphoni生命科学公司（资助DW部分薪金）的支持。作者感谢Meghann Sytsma对稿件的编辑工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 吐温 X-100 | Sigma Aldrich | X100- 100ml | |
| Alexa 488 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体 | Thermo Fisher | A11001 | |
| Bardford 试剂 | Thermo Fisher | 23200 | Pierce |
| 生物传感器 | Forte-Bio | MR18-0009 | |
| CD64 (H-250) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-15364 | |
| CellEvent Caspase-3/7 底物 | Thermo Fisher/Life Technologies | C10427 | |
| CellTiter AQueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒 | Promega | G3580 | Promega |
| DAPI (4′,6-二脒基-2-苯基吲哚) | Thermo Fisher | D-1306 | PBS 中 1:1,000 稀释 |
| 驴抗大鼠 Alexa 488 | Thermo Fisher | A-21208 | PBS 中 1:1,000 稀释 |
| ECL plus | GE healthcare/Amersham | RPN2133 | 经过多次尝试与错误后，我们最终重新选用该试剂 |
| Eclipse TE 200-U 显微镜，配备 EZ C1 激光扫描软件 | Nikon | ||
| 山羊抗兔 Alexa 488 | Thermo Fisher | A-11008 | PBS 中 1:1,000 稀释 |
| HRP 抗山羊抗体 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-516086 | TBS 中 1:10,000 稀释 |
| HRP 驴抗小鼠抗体 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2315 | TBS 中 1:10,000 稀释 |
| ICAM-1 抗体 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1511 | PBS 中 1:200 稀释 |
| IRF5 抗体 (H56) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-98651 | |
| Micro plate reader Elx800 | Biotek | ||
| NIMP 中性粒细胞标志物 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-133821 | PBS 中 1:200 稀释 |
| Octet RED | Forte Bio | 蛋白-蛋白结合检测 | |
| Peptide design Medit SA 软件 | RCSB.org | ||
| 重组 IRF5 蛋白合成 | TopGene Technologies | 蛋白表达与合成服务 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma Aldrich | 436143 | 去垢剂 |
| 氯胺酮 | 药房 | 受控物质 III 类，需处方 | |
| 赛拉嗪 | MedVet | ||
| 3.5X-45X 三目变倍解剖立体显微镜，带鹅颈 LED 灯 | Am Scope | SKU: SM-1TSX-L6W | |
| Zeba 脱盐柱 | Thermofisher | 2161515 | |
| 内皮基础培养基 EBM Bullet 试剂盒 | Lonza | CC-3124 | 试剂盒含生长补充剂 |
| VIA-100K | Boeckeler Instruments | ||
| 4 - 15% TGX 凝胶 | Bio-Rad | 5671081 | |
| MedSuMo 软件 | Medit, Palaiseau, France | ||
| Laemmli 缓冲液 | BioRad |
参考文献
- Bi, X., et al. Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis. Breast Cancer Res. 13 (6), 111(2011).
- Dideberg, V., et al.
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