在凝胶表面生长的植物根部的光片荧光显微成像 光片荧光显微镜，植物根系，凝胶培养，活体成像，根系发育，三维成像

摘要

本方案展示了一种用于光片显微镜的植物样品制备方法。该实验装置的特点是将植物垂直固定在凝胶表面，并在可控的光照条件下使其生长，从而能够在标准化条件下对植物器官的发育过程进行长期观察。

摘要

理解植物发育的一个关键问题是单个细胞在组织的更大背景下如何行为。因此，需要在较长时间内以高空间和时间分辨率对整个器官进行观察，而这可能引起光毒性效应。本方案介绍了一种用于光片显微镜的植物样品制备方法，其特点是将植物垂直固定在凝胶表面。植物的安装方式使得根部浸没在液体培养基中，而叶片则保持在空气中。为了确保植物的光合作用活性，采用定制的照明系统对叶片进行光照。为使根部保持在黑暗环境中，液面使用黑色塑料薄膜覆盖。该方法可在标准化条件下实现对植物器官发育的长期成像。

引言

理解植物发育的一个关键问题是单个细胞在器官分化和生长过程中如何发挥作用。理想情况下，细胞事件（如基因表达模式和细胞内蛋白质定位）应能在组织的整体背景下被观察到。这一目标带来了技术上的挑战，要求在较长时间内以高空间和时间分辨率对整个器官进行观察，而这可能会导致光毒性效应。由于植物会迅速适应环境变化，因此必须严格控制生长条件。为了在不干扰植物生理状态的前提下进行长期成像，必须确保以下三点：1）样品腔内的生长条件；2）样品在长时间内的稳定固定；3）采用低光照强度进行成像，以避免光损伤和非生理状态的产生。

显微镜样品腔内的生理生长条件对于长期实验至关重要。目前已有一些实验方案描述了共聚焦显微镜用的成像生长室^1-3。然而，共聚焦显微镜会对植物施加高强度光照，可能引发应激反应，并通常抑制植物生长⁴。此外，大多数传统显微镜仅允许样品水平放置，这对植物并不理想，因为植物会试图重新定向并朝向重力矢量方向生长。在过去十年中，光片显微镜已成为一种强大工具，能够在细胞分辨率下对大型样品进行长达数天的发育过程成像^5-9。光片显微镜允许将样品垂直放置，在研究根系发育的植物科学研究中应用日益广泛^10-21，近期由Berthet和Maizel进行了综述²²。上述许多研究^10,13-18,21均在Ernst H.K. Stelzer实验室中优化并实施，采用了一种特殊的样品固定方法，即让根在凝胶表面生长¹⁷。在这些研究中使用的是定制显微镜，植物样品从底部被固定。相比之下，目前大多数广泛可用的光片显微镜是从顶部固定样品，因此这种特定的制备方法无法直接应用。本文所提出的方法提供了一种成熟的表面培养固定方案，适用于OpenSPIM²³——一个用于应用和改进选择性平面照明显微镜（SPIM）的开放平台。

本实验方案的总体目标是在OpenSPIM光片显微镜中实现对拟南芥根部的长期成像。该目标通过将植物垂直生长在凝胶表面来实现，其根部浸入液体培养基中，而叶片则暴露在空气中。为了确保植物的光合作用活性，采用定制的照明系统对叶片进行光照，而不照射根部（图1）。

方案

1. 成像前拟南芥的培养

1. 制备½ MS培养基（半强度Murashige和Skoog培养基），加入2.15 g MS培养基粉、10 g蔗糖、0.97 g MES（2-(N-吗啉代）乙磺酸）和 1 L ddH₂O₂将O（双蒸水）加入1 L瓶中，用KOH调节pH至5.8。
2. 向½ MS培养基中加入15 g/L的结冷胶，并在121 °C下高压灭菌20分钟。
3. 将30 mL热培养基倒入方形培养皿（245 × 245 × 25 mm）中，形成约2 mm厚的凝胶层。将培养皿冷却至室温，使培养基完全凝固。
4. 将灭菌的拟南芥种子放入含有1 mL无菌H₂O的1.5 mL离心管中₂O. 使用玻璃移液管或1,000 µL移液器吸头吸取种子，将其播种于凝胶表面。种子之间应相互分离，间距约为10 mm。用封口膜密封培养皿。
5. 在 4 °C 下将培养板孵育 24 小时（层积处理）。
6. 在培养箱中培养该培养板， 例如 在22 °C、16/8小时光暗周期、光照强度为120–140 µmol/m²/s的条件下培养6天。最多可使用不超过10天龄的植株。

2. 植物样品制备方法

注意：样品支架可根据图2C所示尺寸通过3D打印或在机械加工车间手工制作。3D模型文件已作为补充材料提供（补充文件—3D样品支架.stl）。有关3D打印的订购链接，请参见材料清单。

1. 将5 g低熔点琼脂糖加入含有50 mL ½ MS培养基的50 mL瓶中，在121 °C下高压灭菌20分钟。
2. 将1%低熔点琼脂糖溶液分装至1.5 mL离心管中，于4 °C保存（可使用至少两个月）。
3. 在80 °C下融化一份1%低熔点琼脂糖溶液，并使其冷却至33 °C。
4. 在超声波仪中清洗样品台，用70%乙醇对样品台进行灭菌，并用无菌水冲洗。
5. 使用解剖刀在植物周围切割凝胶。
6. 用一把扁平刮铲提起凝胶块，并用第二把刮铲小心地将其滑移到样品台上。
7. 使用100 µL移液器将33 °C的1%琼脂糖滴加到样品台上以固定凝胶。
8. 使用10 µL移液器将1%琼脂糖滴加到凝胶上以固定植物。使用体视显微镜确认叶片未被凝胶覆盖。切勿将凝胶直接置于目标区域上。
9. 为防止植物干燥，请连续操作。尽可能将样品台插入1,000 µL移液器吸头中，将吸头作为盖子，并小心地从样品台的一端（植物所在端）滑入覆盖。
10. 将样品台放入移液器吸头盒中，必要时可继续准备更多样品。样品可直接用于成像，或放回培养孵育箱中继续培养。

3. 设置显微镜

注意：LED 照明系统为自行搭建的光源装置。构建 LED 环的技术细节详见图3及材料清单。电路板设计请参见补充材料文件（Supplemental_File_-_LED_Ring_Board.brd）。

1. 螺丝或胶水（例如 在OpenSPIM x/y/z/θ平台臂的下侧，使用双面胶带固定LED环。
2. 将LED环与可调电源（0-30 V，最大2 A）连接。
3. 将电压调整至所需光照强度（对于拟南芥，为120-140 µmol/m²/秒 图3D).
4. 用70%乙醇对样品室进行灭菌，并用无菌水冲洗。
5. 用苯清洗物镜镜头，再用镜头清洁纸擦拭。用70%乙醇对物镜镜头进行消毒。
6. 将灌流管以单向方式连接至样品室。将一个装有新鲜½ MS培养基的1 L瓶和一个空瓶放置在蠕动灌流泵旁。用一根灌流管将盛有培养基的瓶子连接到样品室的下部入口，再用另一根灌流管将样品室的上部出口连接至空瓶，用于收集并废弃使用过的培养基。
7. 将流速设为1 mL/min。
   注意：为避免样本室溢出，出流速度必须高于进流速度。可通过提高泵速或使用内径更大的出流管来实现。
8. 将黑色塑料膜切成3 mm的小方块，用70%乙醇清洗后晾干，再将其放置于样品室的水面上。
9. 从样品架上取下移液器吸头，并将样品架插入样品室。如果新制造的样品架无法安装到载物台臂上，可使用细砂纸将其磨薄，或在样品架过薄时使用O形圈（∅ 6 mm）。
10. 制作盖子时，将黑色铝箔裁剪成两块50 × 25 mm的片状。在每片一侧的中部切出一个5 mm的切口，然后折叠形成三角形凹槽（图1D）。通过将两个盖子上的三角形凹口对准样品架方向，盖上样品室。确保植物叶片未被盖子遮挡，能够接收来自照明系统的光照。
11. 使用 x/y/z 和旋转平台调节，将正在发育的侧根定位在视野中以确定感兴趣区域。
12. 记录前，让系统平衡至少15分钟。
13. 设置图像采集。
    1. 设置一个包含217张图像的堆栈，z轴间距为3 µm（总计650 µm），时间间隔为15分钟，总时长为17小时。
       注意：有关如何操作 OpenSPIM 软件的详细说明，可参见（http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack）。
14. 开始记录。

结果

该样品制备方法可在显微镜样品腔内培养植物的同时，利用光片显微镜观察其根系结构（图1）。植物生长于一层凝胶表面（含1.5%凝胶糖的½ MS培养基），该凝胶固定在定制设计的样品 holder 上（图2）。样品 holder 采用透明树脂材料通过3D打印制成，图中所示制造版本标注了具体尺寸（图2C）。根部浸没在液体（½ MS培养基）中，并由灌流系统持续更新培养液。叶片暴露于空气中，并由位于植物上方环形排列的蓝红LED光源提供持续光照，光强为130 µmol/m²/s（图1A, B 和 图3A-C）。LED环由本单位机械车间加工制造，图3 及材料清单中提供了其构建的技术细节。光照强度可在30–250 µmol/m²/s范围内连续调节（图3D）。根系区域通过覆盖在液面的小片黑色塑料薄膜进行遮光处理（图1）。任何由照明光源产生的杂散光，若被检测物镜收集，将被GFP滤光片滤除（图3E）。

利用该装置，使用20倍/0.5数值孔径的物镜对生长中的拟南芥侧根进行了持续17小时的时间序列成像（图4）。侧根起源于位于主根内部较深层的中柱鞘细胞层。为了展示在组织更深层部位长时间成像的能力，采用更高倍率（40倍/0.75数值孔径）对侧根从第一阶段原基形成直至突破主根表面的全过程进行了为期38小时的成像记录（图5）。图5B展示了该数据集的一个典型二维切片。该记录使我们能够以单细胞分辨率在三维空间中追踪侧根形成的动态过程（图5A）。

图1： OpenSPIM样品室内的生长条件。 A) 成像室示意图。植物直立生长在凝胶表面，固定于定制的样品支架上（另见图2）。根系在液体培养基中生长，并通过灌流系统持续更换培养液。植物叶片暴露于空气中，由红光和蓝光LED照射（另见图3）。根系区域通过覆盖在液面的小片黑色塑料膜遮光。由两片黑色铝箔制成的盖子进一步减少水面以下的光照强度，并维持样品室内的湿度。右侧放大图显示植物生长在浸没于液体培养基中的凝胶块表面。一滴琼脂糖将根部固定在凝胶上。虚线框标示显微镜观察的兴趣区域。B) 成像室照片（无盖）。A和B中的编号(1)-(10)分别代表：(1) 带LED环的x/y/z/θ调节平台，(2) 样品支架，(3) 盖子，(4) Arabidopsis thaliana，(5) 黑色塑料膜片，(6) 灌流系统，(7) 检测物镜，(8) 液体培养基，(9) 样品室，(10) 照明物镜。C) 盖子由两片黑色铝箔制成。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2： 样品夹持器。 A) 三维模型。三维模型文件已作为补充材料提供。 B) 使用不同材料打印的三维模型照片：(1)-(3)：透明丙烯酸塑料，(4) 和 (5)：树脂，(6)：透明树脂。 C) 样品夹持器的技术图纸，数字表示毫米。 D) 安装植物后的加工完成样品夹持器照片。虚线区域可通过显微镜观察。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3： 植物照明装置示意图。 A) 灯具的电路原理图。成对的LED可单独开关，以实现定向照明。LED：发光二极管，R：电阻，T：晶体管，JP：针脚。 B) 照明灯的最终设计使用PCB软件绘制（PCB：印刷电路板）。我们在补充材料中提供了电路板设计文件。该电路板随后由本研究所的MIBA机械车间制造并组装完成。 C) 开启状态下的LED环形灯照片。四个红色LED和蓝色LED成对排列成环形。 D) 电压范围可在3.5 V至14.0 V之间调节。通过使用不同阻值的电阻，使光照强度达到30–250 µmol/m²/s（R1–8：220 欧姆，R9–12：1,220 欧姆）。 E) 灯具、GFP和YFP的发射光谱。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 4： 拟南芥（Arabidopsis thaliana）侧根的延时记录。 五天大的幼苗表达一种膜标记（pUBQ10::YFP-PIP1;4）和一种核报告基因（pGATA23::nls-GUS-GFP），特异性地标记将发育为侧根的中柱鞘细胞。使用20X/0.5物镜，每隔15分钟采集一次图像，共记录17小时，每次采集包含217层图像（z轴步进3 µm）。A) 展示了69个时间点中的四个，采用最大强度投影显示。B) 展示了某一时间点z轴堆栈中217层图像的六个单层切片。A和B中的比例尺均为100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图5： 拟南芥（Arabidopsis thaliana）侧根的延时记录。 6天大的幼苗表达一种膜标记（pUBQ10::YFP-PIP1;4）和一种核报告基因（pGATA23::nls-GUS-GFP），特异性地标记将发育为侧根的中柱鞘细胞。使用40倍/0.75数值孔径的物镜，每15分钟采集一次共38小时的图像，每次采集包含200层图像（z轴步进1.5 µm）。A) 四个时间点的三维重建图像，网格中的数字表示µm；B) 主根中央切面的单层图像。比例尺为50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件 - 3D 样品架.stl。 提供了三维模型文件。请点击此处下载该文件。

补充文件 LED 环形板.brd。 提供了该电路板的设计文件。 请点击此处下载该文件。

讨论

光片荧光显微镜具有光毒性低和超快成像速度的显著优势，可用于在保持样本生理状态的同时，以高时空分辨率捕获大体积图像。光片显微镜的分辨率可与共聚焦显微镜相媲美⁹。然而，激发光和发射光路径中分别会发生光散射和吸收，导致在不透明组织内部的整体图像质量明显低于表面区域。为克服这一难题，可利用样本绕垂直轴旋转的特性，从不同方向观察同一区域。但这种方法并非总是有利，例如，侧根仅从主根的一侧生长，从背面成像无法获得更多信息且图像质量较低。然而，旋转原则上可用于将样本调整至最佳观察位置。传统的物镜水平排列方式为样本安装提供了新的可能性。植物更受益于垂直生长方向。本文所展示的"置于凝胶表面"的安装方法，相较于将根部包埋于凝胶内部等其他安装方法具有多项优势^24,25。1）根系直接接触液体培养基。样本腔室连接灌流系统，可持续供应新鲜培养基，也可用于快速更换整个样本腔室的培养基，以施加不同培养条件或药物。2）在样本制备前，植物仍按常规实验室方式生长。可在荧光显微镜下预先筛选植株，仅对目标植株进行制备。3）植株从培养皿转移至样本支架过程中无需直接接触，因此植株可在原本生长的凝胶上继续发育，机械应力降至最低。4）样本与检测物镜之间的空间仅充满培养基，无其他折射率不同的材料，从而确保对样本的观察无遮挡，并最大限度减少光学像差。

为了进行长期成像，需要使用植物照明系统以确保植物的光合作用活性。在大多数实验室中，植物生长在透明凝胶上，即根系暴露于光照下。这可能导致植物对环境产生不同的响应，并引发其生物化学和发育上的变化^26,27。为了减少根系所受的光照量，使用黑色塑料膜覆盖水面，同时样品室上方加盖由黑色铝箔制成的盖子。光线可通过盖子中央的孔照射到植物叶片上。在此设置下，未观察到背景光增加，表明来自红光和蓝光LED的杂散光已被GFP滤光片及遮光措施显著减少。因此，在图像采集过程中可保持照明开启，而不会增加相机的背景噪声。

样品台设计用于3D打印。然而，材料的选择至关重要，因为已测试的多种塑料均未达到100%的稳定性，会导致样品发生漂移。因此，建议改用树脂材料，或通过铣削聚乙烯（PEP）棒来加工样品台。当使用双侧照明系统的光片显微镜装置时，样品台可能会根据旋转角度的不同而干扰其中一侧的光片。在从培养板中舀取植物样品时，为减少机械应力，应使用铲刀的平角操作。植物可能迅速失水，并首次暴露于气流中。应尽量避免任何气流干扰（如快速移动、空调气流），操作应连续进行，并尽可能将样品台滑入1,000 µL移液器吸头中。在显微镜内操作时，切勿将整株植物浸入液体中，需保持叶片干燥。

该技术非常适合成像侧根形成的早期阶段。在对成熟根尖进行长期成像时，必须注意拟南芥根的生长速度为每小时100–300 µm，会迅速移出视野。未来一个非常有用的应用可能是开发自动追踪算法，从而实现对根尖生长过程的长时间连续观察。在图像采集过程中，能够控制光照和培养基营养成分等环境条件，使得研究人员可以探究植物如何适应环境变化。根部直接接触液体培养基，因此可通过该培养基施加药物以化学诱导基因表达，例如使用地塞米松诱导系统²⁸或β-雌二醇诱导系统²⁹。然而，完全更换样品室内的培养基以洗脱药物需要较长时间。通过减小样品室的体积以加快培养基交换速度，可进一步优化该装置。尽管如此，该技术仍具有巨大潜力。结合固定样品的方法、标准化的培养条件以及采用光片显微镜进行的温和图像采集，可在生理水平上以高分辨率开展植物发育的长期研究，这将有助于研究人员探索植物发育的基本机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
低熔点琼脂糖	VWR	AFFY3282125GM
黑色铝箔	Thorlabs	BKF12
黑色塑料薄膜	Carl Roth	HT83.2
蓝色LED（453 nm）	OSRAM	LD CN5M-1R1S-35-1
红色LED（625 nm）	OSRAM	LR T66F-ABBB-1-1
LED电路板 - PCB设计软件	Cadsoft Eagle
MES一水合物	Duchefa	M1503.0100
微孔外科胶带	3M	1530-1
Murashige & Skoog培养基（MS培养基）	Duchefa	M0221
植物凝胶	Sigma-Aldrich	P8169
样品架3D打印	i.materialise	https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1
方形培养皿（245 × 245 × 25 mm）	VWR	734-2179
蔗糖	Sigma-Aldrich	84097-1KG