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方法文章

从死后人脑供体衍生软脑膜外植体培养物

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⸱

DOI：

10.3791/55045

⸱

2017年1月21日

 ,  ,  ,  , 
1Parkinson’s Institute and Clinical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

人死后脑组织软脑膜外植体培养方案是一种技术上稳健且简便的方法，可在6-8周内获得表达纤连蛋白的脑膜成纤维细胞，并可冷冻保存约2000万至3000万个细胞。

摘要

尽管帕金森病的临床表征已取得显著进展，但多项研究报道，临床上诊断为帕金森病的病例中，高达25%未得到病理学证实。因此，从临床诊断为特发性帕金森病的患者中采集的组织可能存在较高的误诊率；故 体外 使用此类组织作为帕金森病的临床前模型进行研究可能会徒劳无功。

通过收集经神经病理学确诊为帕金森病的死后人脑软脑膜组织，且该组织具有黑质纹状体细胞丢失以及称为路易小体的细胞内蛋白包涵体的特征，可以确定临床上观察到的帕金森综合征并非由其他潜在疾病过程（例如肿瘤、动脉硬化）引起。

本方案介绍了死后人类软脑膜的解剖与制备，用于建立脑膜成纤维细胞培养体系。该方法稳定可靠，成功率高。由于脑组织获取通常不在无菌条件下进行，因此培养过程中的无菌操作是主要挑战。为此，必须在培养基中添加含有青霉素、链霉素和两性霉素B的抗生素混合物。

从经尸检证实的帕金森病病例中分离脑膜成纤维细胞，为帕金森病的体外建模提供了基础。in vitro 培养的脑膜成纤维细胞通常在样本制备后3-9天出现，约6-8周内可冻存约2000万至3000万个细胞。脑膜成纤维细胞培养物具有均一性，且细胞表达纤维连接蛋白，后者是常用于鉴定脑膜的标志物。

引言

脑膜由三层膜组成，可保护大脑：硬脑膜、蛛网膜和软脑膜。近年来，人们认识到脑膜在大脑发育和大脑稳态中也发挥着重要作用1脑膜来源于间充质细胞和神经嵴来源的细胞，有趣的是，已有研究表明，存在于脑膜中的前体细胞能够分化为神经元。 体外 移植后 体内2,3,4脑膜培养物也已成功用作饲养层，因其具有间质细胞来源的诱导活性，可促进胚胎干细胞向多巴胺能神经元分化5此外，在缺血条件下，软脑膜具有直接分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能。6.

本方案中，人死后蛛网膜和软脑膜（合称软脑膜）样本作为人脑捐献用于研究的一部分进行采集。脑组织解剖在死亡后24小时内进行，软脑膜样本采集后置于冷的生长培养基中，并在接下来的6-8小时内进行进一步处理，具体步骤如本方案所示。

本方案描述了人脑膜样本的解剖与制备过程，用于建立患者原代软脑膜细胞培养。将组织切成约25-30块，每块大小约为3 mm × 3 mm的方块。每块6孔板的明胶包被孔中放置3块组织，并用圆形玻璃盖玻片压住固定。脑膜解剖过程耗时约25-35分钟。该培养的主要挑战在于无菌性，因为脑组织的获取、运输和解剖通常并非在无菌条件下进行。因此，必须在培养基中添加青霉素、链霉素和两性霉素B的混合抗生素，并使用多孔板分别培养各组织块。

脑膜成纤维细胞通常在第一周内开始生长。每两到三天更换一次培养基，直至细胞达到汇合状态，然后通过酶法进行传代。脑膜成纤维细胞以每毫升每管100万个细胞的密度，用冷冻保存培养基进行冻存。采用本方案，可在6至8周内获得2000万至3000万个可用于冻存的脑膜成纤维细胞。这些脑膜成纤维细胞的后续应用包括用于疾病研究的原代培养、直接神经元分化，或从软脑膜来源的细胞中诱导生成多能干细胞，以帮助理解疾病机制并推动药物开发。

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方案

脑组织捐献登记包括登记人签署表明其捐献意愿的文件。根据法律规定，组织取材所需的尸体解剖许可须由法定继承人提供。使用所采集的尸体解剖标本开展的研究项目需经机构审查委员会（IRB）审核，以确保符合《健康保险可携性与责任法案》（HIPAA）的规定。

注意：软脑膜样本由脑解剖人员或神经病理学家在脑组织解剖过程中采集，并储存于含有25-30 mL脑膜生长培养基的50 mL锥形管中。样本在4 °C保存直至进行处理。应尽快完成样本处理，因为细胞活力会随着死亡后时间的延长而下降。

1. 开始软脑膜解剖前的准备工作

注意：步骤 1.1 - 1.3 应在生物安全柜内进行。

  1. 通过在500 mL滤器装置中混合375 mL的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Media）、100 mL胎牛血清、5 mL 10 mM非必需氨基酸、5 mL 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、5 mL 100 mM丙酮酸钠、5 mL 10,000 U/mL青霉素/链霉素和5 mL 250 µg/mL两性霉素B，制备脑膜生长培养基。过滤并混匀。培养基可在四周期间内使用。
  2. 开始解剖前，将所有材料放入生物安全柜中：4个培养皿、2个6孔板、2把手术刀、15–20片灭菌的15 mm盖玻片、磷酸盐缓冲液（PBS）、血清移液管、吸液移液管。
  3. 向6孔板的每孔中加入1 mL经高压灭菌的0.1%明胶溶液。静置30–60分钟。准备2个6孔板。

2. 软脑膜样本的制备

注意：步骤 2.1 - 2.3 必须在生物安全柜内进行。

  1. 向无菌的10 cm组织培养皿中加入约10 mL PBS，将脑膜样本放入培养皿中。用镊子轻轻用PBS冲洗软脑膜，以去除血液。
  2. 将脑膜转移至另一含有10 mL新鲜PBS的10 cm组织培养皿中继续清洗。根据需要重复操作，尽可能去除血液。
  3. 使用两把手术刀将软脑膜组织切成约6 cm × 6 cm大小的片状。
  4. 将培养皿盖上盖子，转移至水平层流罩内的解剖显微镜下。

3. 软脑膜组织的解剖

注意：步骤 3.1 - 3.3 需在水平层流罩内使用解剖显微镜进行。

  1. 从软脑膜组织（步骤 2.3）上选择一个足够大的区域，去除该区域的血管，以便制备至少 20–25 个 3 mm × 3 mm 的组织块。用一把解剖刀固定软脑膜组织，另一把解剖刀以轻柔、浅表的刮除动作分离血管。
  2. 从已处理的区域切割出小块组织。采用逐步切割法，先切出较大组织块，再将其进一步切成更小的片段。
  3. 用一把解剖刀固定组织，另一把解剖刀以 rocking motion（ rocking 动作）进行切割。由于组织质地特性，难以将两把解剖刀相互滑动切割；这样做只会撕裂组织，导致边缘不整齐。
  4. 持续将组织块对半切割，直至获得约 20–25 个 3 mm × 3 mm 的组织块。

4. 将解剖后的脑膜组织片转移至组织培养板

注意：步骤 4 必须在生物安全柜内进行。

  1. 吸出6孔板中的明胶（来自步骤1.3）。向每孔加入1 mL脑膜生长培养基。使用无菌镊子，将3-4块活检组织放入每孔中。

5. 将盖玻片放置于脑膜组织片上

注意：步骤 5.1 - 5.2 需在水平层流罩内使用解剖显微镜进行。

  1. 每孔用 1-2 个无菌的 15 毫米圆形盖玻片覆盖组织块。
  2. 用镊子用力按压，确保组织块与培养板底部充分接触，以促进组织块在孔底的贴附。
  3. 将 6 孔板放入 37 °C、5% CO2 的培养箱中。

6. 细胞培养的维持

注意：步骤 6.1 - 6.3 应在生物安全柜内进行。操作培养皿时需小心，避免盖玻片移动而导致脑膜组织脱落。

  1. 培养 2 天后，向每孔中额外加入 1 mL 新鲜的脑膜细胞生长培养基。
  2. 第 7 天时，小心吸除培养基，并向每孔中加入 2 mL 新鲜培养基。
  3. 第 9 天后，继续每隔一天更换一次生长培养基，直至细胞培养达到汇合状态。

7. 传代

注意：所有步骤均须在生物安全柜内进行。一旦脑膜成纤维细胞从脑膜组织块迁移出来并开始向培养容器边缘生长，即将脑膜成纤维细胞扩增至更大的培养皿中。

  1. 传代开始前，用 1% 明胶对培养皿进行包被处理，持续 15-30 分钟。
  2. 从 6 孔板中吸除培养基，并用 2 mL PBS 洗涤细胞。
  3. 每孔加入 1 mL 胰蛋白酶/EDTA 溶液，在 37 °C 下孵育 5-10 分钟。此步骤无需移除盖玻片或脑膜组织。
  4. 当细胞变圆并开始脱落时，加入 2 mL 完全培养基。
  5. 用移液器反复吹打细胞，彻底分散所有细胞团块，并将细胞悬液转移至更大的培养皿中。
  6. 按 1:3 至 1:4 的比例，将三个 6 孔板中的细胞合并至一个 T75 培养瓶中。
  7. 当 T75 培养瓶中的脑膜成纤维细胞达到融合状态时，用胰蛋白酶消化细胞，并以每管 1×106 个细胞/mL 的密度在冻存液中进行冻存。一个融合状态的 T75 培养瓶中的脑膜成纤维细胞大约含有 500 至 700 万个细胞。

8. 通过免疫染色对脑膜成纤维细胞进行表征

注意：在开始实验前，需配制4%多聚甲醛溶液、含5%正常山羊血清的PBS（封闭缓冲液）、含0.3% Triton X-100的PBS（通透缓冲液）、一抗和二抗溶液，以及将Hoechst 33342从10 mg/mL储存液稀释至1 µg/mL的PBS工作液。

  1. 在涂有0.1%明胶的8孔腔室载玻片中接种15,000至30,000个脑膜成纤维细胞。
  2. 24小时后，待细胞贴壁，每孔加入100 µL 4%多聚甲醛，室温固定10分钟。用1×PBS洗涤孔板3次。
  3. 每孔加入150 µL 0.3% Triton X-100，室温透化5分钟。用1×PBS洗涤孔板3次。
  4. 每孔加入200 µL封闭液（PBS + 5%正常山羊血清），室温封闭1小时。
  5. 吸除封闭液，每孔加入150 µL用封闭液稀释的一抗溶液。进行双重染色时，将一抗工作液分别在冰上置于不同的离心管中配制，具体如下：
    1. 在封闭液中配制抗Fibronectin抗体1:300稀释液 + 抗nestin抗体1:200稀释液；在封闭液中配制抗SERPINH1抗体1:250稀释液 + 抗TUJ1抗体1:1,000稀释液；在封闭液中配制抗SERPINH1抗体1:250稀释液 + 抗SOX2抗体1:100稀释液
  6. 4 °C孵育过夜。
  7. 用1×PBS洗涤孔板3次。
  8. 在封闭液中配制荧光标记的二抗工作液（山羊抗兔IgG，绿色；Ex/Em2 495/519 nm；山羊抗小鼠IgG，红色；Ex/Em2 590/617 nm），稀释比例为1:400，每孔加入100 µL，室温避光孵育1小时。随后用1×PBS洗涤1次。
  9. 每孔加入100 µL 1 µg/mL Hoechst 33342溶液（蓝色；Ex/Em2 358/461 nm），避光孵育3分钟。用1×PBS洗涤3次，最后一次洗涤后保留1×PBS于孔中，并用铝箔包裹载玻片。
  10. 在荧光显微镜下观察细胞。

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结果

当软脑膜处理方案成功时，通常在解剖后3至9天可首次观察到脑膜成纤维细胞的迁移生长，但该时间可能因脑组织的死后间隔时长而有所不同。图1展示了四位不同供体的脑膜成纤维细胞培养结果。图1A显示来自一位88岁供体（死后间隔时间为10小时20分钟）的软脑膜组织碎片，经处理后第4天，组织周围出现成纤维细胞迁移生长，组织被玻璃盖玻片（深色对角线）压住。图1B显示来自一位70岁供体（死后间隔时间为11小时45分钟）的样本，处理后第7天成纤维细胞生长稀疏。图1C显示来自另一位88岁供体（死后间隔时间为24小时）的样本，解剖后第13天出现明显的成纤维细胞迁移生长。图1D显示已形成融合培养的细胞，此时可将细胞传代至T75培养瓶，并可在此阶段进行冷冻保存。

脑膜成纤维细胞呈双极或多极形态，具有细长或不规则的形...

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讨论

本方案描述了一种简单且可靠的从人死后捐献脑组织时采集的软脑膜中分离脑膜成纤维细胞培养物的方法。目前关于从人死后组织材料中建立细胞培养的方案报道极少。已有两项研究描述了皮肤来源的成纤维细胞培养7,8,9，一项研究描述了硬脑膜样本10，另一项研究描述了未经冷冻保存的冻存硬脑膜样本11。

我们准备两块6孔板，每孔中放入2-3个组织块（大小约为3 mm × 3 mm），以确保在冷冻保存前获得足够的组织块细胞迁移和扩增。关键步骤是用无菌玻璃盖玻片轻轻按压脑膜组织块，使其贴附于培养皿底部。若不使用盖玻片，脑膜组织块将无法贴附在培养皿底部。只有当组织块与塑料培养皿底面直接接触时，才能观察到成功的细胞迁移。如果组织块漂浮在培养基中，则不会观察到细胞从组织块中迁移出来。操作时应先加入约500 µL生长培养基，防止样品干燥...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本方案的开发由定向捐赠给帕金森病研究所脑组织捐献项目的私人捐款资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Corning 培养皿Fisher Scientific351029
Nunc 6 孔板Fisher Scientific14-832-11
15 mm 盖玻片Fisher Scientific12-545-83 15CIR-1D
手术刀，无菌刀片，15 号Miltex4-415
弯头精密尖头镊子Fisher Scientific16-100-122
血清移液管Fisher Scientific13-678-11E
巴斯德移液管Fisher Scientific22-230490
明胶SigmaG1890-100G
磷酸盐缓冲液Fisher ScientificSH30264.02
Corning 500 mL 滤器装置Fisher Scientific430770混合培养基组分并过滤。
Nunc 细胞培养处理带滤帽烧瓶，T175 cm2 Thermo Scientific178883
名称公司目录编号备注
培养基
Hyclone DMEMFisher ScientificSH30081.02
Hyclone FBSFisher ScientificSH30910.03
MEM 非必需氨基酸溶液（100 倍浓缩）Thermo Fisher11140-050
GlutaMAX 补充剂（100 倍浓缩）Thermo Fisher35050-061
丙酮酸钠（100 mM）Thermo Fisher11360-070
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Thermo Fisher15140-122
两性霉素 B（黄色溶液/250 µg/mL）Fisher ScientificBP264520
Bambanker 冻存液 120 mLFisher ScientificNC9582225
名称公司目录编号备注
纤连蛋白染色
8 孔腔室载玻片 Fisher Scientific1256518
20% 多聚甲醛 Electron Microscopy Sciences15713
Triton X-100 SigmaT8787
100% 甘油 BioRad9455
100% 正常山羊血清 Fisher Scientific101098-382
抗纤连蛋白抗体 [F1]Abcamab32419在封闭液中按 1:300 稀释
抗 SERPINH1 抗体SigmaS5950-200ul在封闭液中按 1:250 稀释
抗 SOX2 抗体MilliporeMAB4343在封闭液中按 1:100 稀释
抗 Nestin 抗体MilliporeMAB5326在封闭液中按 1:200 稀释
抗 TUJ1 抗体CovanceMMS-435P在封闭液中按 1:1,000 稀释
Alexa Fluor 488 抗兔抗体Thermo FisherA11029在封闭液中按 1:400 稀释；（绿色通道；激发/发射波长 495/519 nm） 
Alexa Fluor 555 抗小鼠抗体Thermo FisherA21424在封闭液中按 1:400 稀释；（红色通道；激发/发射波长 590/617 nm） 
Hoechst 33342 染色液Thermo FisherH3570稀释至终浓度为 1.0 μg/mL；（蓝色通道；激发/发射波长 358/461 nm）
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参考文献

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