从死后人脑供体衍生软脑膜外植体培养物

摘要

人死后脑组织软脑膜外植体培养方案是一种技术上稳健且简便的方法，可在6-8周内获得表达纤连蛋白的脑膜成纤维细胞，并可冷冻保存约2000万至3000万个细胞。

摘要

尽管帕金森病的临床表征已取得显著进展，但多项研究报道，临床上诊断为帕金森病的病例中，高达25%未得到病理学证实。因此，从临床诊断为特发性帕金森病的患者中采集的组织可能存在较高的误诊率；故 体外 使用此类组织作为帕金森病的临床前模型进行研究可能会徒劳无功。

通过收集经神经病理学确诊为帕金森病的死后人脑软脑膜组织，且该组织具有黑质纹状体细胞丢失以及称为路易小体的细胞内蛋白包涵体的特征，可以确定临床上观察到的帕金森综合征并非由其他潜在疾病过程（例如肿瘤、动脉硬化）引起。

本方案介绍了死后人类软脑膜的解剖与制备，用于建立脑膜成纤维细胞培养体系。该方法稳定可靠，成功率高。由于脑组织获取通常不在无菌条件下进行，因此培养过程中的无菌操作是主要挑战。为此，必须在培养基中添加含有青霉素、链霉素和两性霉素B的抗生素混合物。

从经尸检证实的帕金森病病例中分离脑膜成纤维细胞，为帕金森病的体外建模提供了基础。in vitro 培养的脑膜成纤维细胞通常在样本制备后3-9天出现，约6-8周内可冻存约2000万至3000万个细胞。脑膜成纤维细胞培养物具有均一性，且细胞表达纤维连接蛋白，后者是常用于鉴定脑膜的标志物。

引言

脑膜由三层膜组成，可保护大脑：硬脑膜、蛛网膜和软脑膜。近年来，人们认识到脑膜在大脑发育和大脑稳态中也发挥着重要作用¹脑膜来源于间充质细胞和神经嵴来源的细胞，有趣的是，已有研究表明，存在于脑膜中的前体细胞能够分化为神经元。 体外 移植后 体内^2,3,4脑膜培养物也已成功用作饲养层，因其具有间质细胞来源的诱导活性，可促进胚胎干细胞向多巴胺能神经元分化⁵此外，在缺血条件下，软脑膜具有直接分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能。⁶.

本方案中，人死后蛛网膜和软脑膜（合称软脑膜）样本作为人脑捐献用于研究的一部分进行采集。脑组织解剖在死亡后24小时内进行，软脑膜样本采集后置于冷的生长培养基中，并在接下来的6-8小时内进行进一步处理，具体步骤如本方案所示。

本方案描述了人脑膜样本的解剖与制备过程，用于建立患者原代软脑膜细胞培养。将组织切成约25-30块，每块大小约为3 mm × 3 mm的方块。每块6孔板的明胶包被孔中放置3块组织，并用圆形玻璃盖玻片....

方案

脑组织捐献登记包括登记人签署表明其捐献意愿的文件。根据法律规定，组织取材所需的尸体解剖许可须由法定继承人提供。使用所采集的尸体解剖标本开展的研究项目需经机构审查委员会（IRB）审核，以确保符合《健康保险可携性与责任法案》（HIPAA）的规定。

注意：软脑膜样本由脑解剖人员或神经病理学家在脑组织解剖过程中采集，并储存于含有25-30 mL脑膜生长培养基的50 mL锥形管中。样本在4 °C保存直至进行处理。应尽快完成样本处理，因为细胞活力会随着死亡后时间的延长而下降。

1. 开始软脑膜解剖前的准备工作

注意：步骤 1.1 - 1.3 应在生物安全柜内进行。

1. 通过在500 mL滤器装置中混合375 mL的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Media）、100 mL胎牛血清、5 mL 10 mM非必需氨基酸、5 mL 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、5 mL 100 mM丙酮酸钠、5 mL 10,000 U/mL青霉素/链霉素和5 mL 250 µg/mL两性霉素B，制备脑膜生长培养基。过滤并混匀。培养基可在四周期间内使用。
2. 开始解剖前，将所有材料放入生物安全柜中：4个培养皿、2个6孔板、2把手术刀、15–20片灭菌的15 mm盖玻片、磷酸盐缓冲液（PBS）、血清移液管、吸液移液管。....

结果

当软脑膜处理方案成功时，脑膜成纤维细胞的生长通常在解剖后3至9天内首次出现，尽管这一时间可能因脑组织的死后间隔时长而有所不同。图1展示了来自四位不同供体的脑膜成纤维细胞培养结果。图1A显示了一个由玻璃盖玻片（深色对角线）固定的软脑膜组织片段，以及来自一位88岁供体（死后间隔时间为10小时20分钟）在处理后第4天出现的成纤维细胞自组织块向外生长的情况。图1B显示来自一位70岁供体（死后间隔时间为11小时45分钟）在处理后第7天出现的稀疏成纤维细胞生长。图1C显示来自另一位88岁供体（死后间隔时间为24小时）在解剖后第13天的成纤维细胞生长情况。图1D显示一个已汇合的培养物，已被传代至T75培养瓶中，此时细胞可进行冷冻保存。

脑膜成纤维细胞呈双极或多个极性，具有细长或不规则的形态（

讨论

本方案描述了一种简单且可靠的从人死后捐献脑组织时采集的软脑膜中分离脑膜成纤维细胞培养物的方法。目前关于从人死后组织材料中建立细胞培养的方案报道极少。已有两项研究描述了皮肤来源的成纤维细胞培养^7,8,9，一项研究描述了硬脑膜样本¹⁰，另一项研究描述了未经冷冻保存的冻存硬脑膜样本¹¹。

我们准备两块6孔板，每孔中放入2-3个组织块（大小约为3 mm × 3 mm），以确保在冷冻保存前获得足够的组织块细胞迁移和扩增。关键步骤是用无菌玻璃盖玻片轻轻按压脑膜组织块，使其贴附于培养皿底部。若不使用盖玻片，脑膜组织块将无法贴附在培养皿底部。只有当组织块与塑料培养皿底面直接接触时，才能观察到成功的细胞迁移。如果组织块漂浮在培养基中，则不会观察到细胞从组织块中迁移出来。操作时应先加入约500 µL生长培养基，防止样品干燥.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Corning 培养皿	Fisher Scientific	351029
Nunc 6 孔板	Fisher Scientific	14-832-11
15 mm 盖玻片	Fisher Scientific	12-545-83 15CIR-1D
手术刀，无菌刀片，15 号	Miltex	4-415
弯头精密尖头镊子	Fisher Scientific	16-100-122
血清移液管	Fisher Scientific	13-678-11E
巴斯德移液管	Fisher Scientific	22-230490
明胶	Sigma	G1890-100G
磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	SH30264.02
Corning 500 mL 滤器装置	Fisher Scientific	430770	混合培养基组分并过滤。
Nunc 细胞培养处理带滤帽烧瓶，T175 cm2	Thermo Scientific	178883
名称	公司	目录编号	备注
培养基
Hyclone DMEM	Fisher Scientific	SH30081.02
Hyclone FBS	Fisher Scientific	SH30910.03
MEM 非必需氨基酸溶液（100 倍浓缩）	Thermo Fisher	11140-050
GlutaMAX 补充剂（100 倍浓缩）	Thermo Fisher	35050-061
丙酮酸钠（100 mM）	Thermo Fisher	11360-070
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Thermo Fisher	15140-122
两性霉素 B（黄色溶液/250 µg/mL）	Fisher Scientific	BP264520
Bambanker 冻存液 120 mL	Fisher Scientific	NC9582225
名称	公司	目录编号	备注
纤连蛋白染色
8 孔腔室载玻片	Fisher Scientific	1256518
20% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Sigma	T8787
100% 甘油	BioRad	9455
100% 正常山羊血清	Fisher Scientific	101098-382
抗纤连蛋白抗体 [F1]	Abcam	ab32419	在封闭液中按 1:300 稀释
抗 SERPINH1 抗体	Sigma	S5950-200ul	在封闭液中按 1:250 稀释
抗 SOX2 抗体	Millipore	MAB4343	在封闭液中按 1:100 稀释
抗 Nestin 抗体	Millipore	MAB5326	在封闭液中按 1:200 稀释
抗 TUJ1 抗体	Covance	MMS-435P	在封闭液中按 1:1,000 稀释
Alexa Fluor 488 抗兔抗体	Thermo Fisher	A11029	在封闭液中按 1:400 稀释；（绿色通道；激发/发射波长 495/519 nm）
Alexa Fluor 555 抗小鼠抗体	Thermo Fisher	A21424	在封闭液中按 1:400 稀释；（红色通道；激发/发射波长 590/617 nm）
Hoechst 33342 染色液	Thermo Fisher	H3570	稀释至终浓度为 1.0 μg/mL；（蓝色通道；激发/发射波长 358/461 nm）
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