培养 秀丽隐杆线虫 在实验室中进行三维培养

摘要

我们介绍一种简单的构建三维线虫培养系统的方法，该系统称为NGT-3D和NGB-3D。这些系统可用于研究线虫在更接近天然Caenorhabditis elegans生境的环境中其适应性及行为特征，相较于标准的二维实验室C. elegans培养皿，其模拟环境更为自然。

摘要

使用遗传模式生物，例如 秀丽隐杆线虫 在过去的五十年中，已促成生物学领域的多项开创性发现。我们目前所了解的大部分生物学知识源自 秀丽隐杆线虫 仅限于线虫的实验室培养，这可能无法完全反映它们在自然界中通常栖息的环境。线虫的培养 秀丽隐杆线虫 在更接近自然界中腐烂水果和植物堆肥内线虫所遇到的三维基质的三维环境中，可能会揭示出在二维条件下未观察到的新表型和行为。此外，三维条件下的实验有助于阐明我们在二维条件下观察到的表型对于线虫在自然环境中的实际意义。在此，一种新方法，其中 秀丽隐杆线虫 在三维条件下正常生长和繁殖的方法如下所述。培养 秀丽隐杆线虫 在线虫生长管-3D（NGT-3D）中可使我们测量线虫的生殖适合度 秀丽隐杆线虫 在三维环境中培养不同菌株或不同条件下的生物体。我们还提出了一种新方法，称为线虫生长瓶-3D（NGB-3D），用于培养 秀丽隐杆线虫 用于显微分析的三维成像。这些方法使科学家能够研究 秀丽隐杆线虫 在更接近自然界中所遇环境的条件下研究生物学。这些条件有助于我们理解生理学和行为学背后的进化意义 秀丽隐杆线虫 我们在实验室中观察到。

引言

过去五十年中，对线虫 Caenorhabditis elegans 的实验室研究推动了生物学领域的多项开创性发现¹。C. elegans 是首个于1998年完成全基因组测序的多细胞生物²，在揭示单个基因对整个生物体发育、生理和行为的影响方面具有不可估量的价值。目前，科学家正致力于进一步探究这些基因如何影响生物体在自然环境中的生存与繁殖适应性，从遗传层面提出有关生态学与进化的问题^3-5。

C. elegans 再次成为回答这些问题的优良体系。然而，目前对 C. elegans 在天然线虫栖息环境中的生物学特性了解甚少，且尚无现有方法可在实验室中模拟 C. elegans 的受控自然条件。在实验室中，C. elegans 通常在接种了 E. coli 细菌的琼脂平板表面培养⁶。然而在自然界中，C. elegans 及其近缘线虫广泛分布于全球各类土壤中，但尤其常见于腐烂的果实和植物残体中并在此旺盛生长^7,8。这些三维（3D）复杂环境与实验室中线虫所处的简单二维（2D）环境存在显著差异。

为了在更接近自然的三维环境中探究线虫生物学的相关问题，我们设计了一种用于实验室培养线虫的三维....

方案

1. 准备 NGT-3D 和 NGB-3D 所需溶液

1. 配制以下无菌溶液：1 L 0.1454 M NaCl 溶液，1 L 1 M CaCl₂，1 升 1 M MgSO₄₄，LB 培养基（Lysogeny Broth），1 L 1 M KPO₄ 缓冲液（108.3 g KH₂PO₄ 和 35.6 g 的 K₂HPO₄，并填充 H₂0至1 L）。使用这些溶液制备NGM的方法可参见先前的实验方案。¹⁰.
2. 121 °C 高压灭菌 15 分钟
3. 配制50 ml无菌的5 mg/ml胆固醇溶液。在50 ml锥形管中，加入0.25 g胆固醇和50 ml 99.99%乙醇，充分混匀。 请勿高压灭菌使用50 ml注射器和0.45 µm针头滤器对胆固醇溶液进行灭菌，同时可去除任何未溶解的胆固醇。
4. （可选）配制10 ml浓度为150 mM的2'-脱氧-5-氟尿苷（FUdR）储备液。在15 ml离心管中进行操作。 在离心管中，加入0.3693 g FUdR和10 ml蒸馏水，充分混匀。

2. 准备用于NGT-3D和NGB-3D的细菌培养物

1. 用细菌....

结果

NGT-3D 的构建是一种简单直接的方案，最终得到装有琼脂的试管，其中分布着分散的小型细菌菌落（图 1A）。线虫可在琼脂基质中自由移动，寻找并摄食这些细菌菌落。为了验证 C. elegans 是否能在 NGT-3D 中正常繁殖和生长，我们将 3D 条件下的繁殖力和幼虫发育情况与标准的 2D NGM 平板进行了比较。在相对子代数量检测中，当细菌菌落数量充足（至少 60 个菌落）时，NGT-3D 中的成年 C. elegans 雌雄同体个体的繁殖能力与标准 2D NGM 平板中的个体相当（图 1B）。此外，在细菌菌落充足的情况下，NGT-3D 中的幼虫发育也正常进行，96 小时后大多数线虫发育至成虫阶段（图 1C）。然而，若 3D 基质中的细菌菌落稀少，则相对子代数量（图 1B，左侧柱状图）和幼虫发育（图 1C，左侧柱状图）均受到显著负面影响。

讨论

实验室培养 秀丽隐杆线虫 使用经典的线虫生长培养基平板对线虫研究领域所取得的数百项重要发现至关重要 秀丽隐杆线虫 已提供。在此，我们介绍新的培养方法 秀丽隐杆线虫 在更准确反映其天然三维生境的环境中。尽管已有其他方法被用于观察 秀丽隐杆线虫 在3D中¹³这是首个允许在线虫在三维固体基质中进行培养的实验方案。本文展示的两种方法——NGT-3D 和 NGB-3D，使科研人员能够研究线虫在三维培养条件下的适应性、发育和生长情况，同时实现对线虫的三维成像与记录。尽管 NGT-3D 和 NGB-3D 与标准的二维 NGM 平板存在一些差异，但它们在本质上仍与原始方法相似，仅针对 z 轴方向的线虫培养进行了调整。因此，我们发现在线虫培养条件下，其发育、繁殖力和寿命均正常进行。本研究的目标是建立一种任何实验室均可应用于科研工作的实验方案。这些方法操作简便、成本极低、易于重复，并可根据使用者的具体实验需求对方案进行调整。

尽管方案中的所有步骤都很重要，但制备NGT-3D和NGB-3D的关键步骤在于第3.4.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB 肉汤，Miller（Luria-Bertani）	Difco	224620
氯化钠	DAEJUNG	7548-4400	58.44 MW
琼脂，颗粒状	Difco	214530
蛋白胨	Bacto	211677
氯化钙二水合物	Bio Basic	CD0050	2*H2O；147.02 MW
胆固醇	Bio Basic	CD0122	386.67 MW
乙醇	B&J	RP090-1	99.99%；46.07 MW
硫酸镁，无水	Bio Basic	MN1988	120.37 MW
磷酸二氢钾，无水	Bio Basic	PB0445	136.09 MW
2'-脱氧-5-氟尿苷	Tokyo Chemical Industry	D2235	246.19 MW
磷酸氢二钾，无水	Bio Basic	PB0447	174.18 MW
多功能试管	Stockwell Scientific	ST.8570	8 ml
试管盖	Stockwell Scientific	ST.8575
细胞培养瓶	SPL Lifescience	70125	25 cm2
科研体视显微镜	Nikon	SMZ18
高清彩色摄像头	Nikon	DS-Fi2
基于PC的控制单元	Nikon	DS-U3
NIS-Elements Basic Research 显微成像软件	Nikon	MQS32000