培养 秀丽隐杆线虫 在实验室中进行三维培养

摘要

我们介绍一种简单的构建三维线虫培养系统的方法，该系统称为NGT-3D和NGB-3D。这些系统可用于研究线虫在更接近天然Caenorhabditis elegans生境的环境中其适应性及行为特征，相较于标准的二维实验室C. elegans培养皿，其模拟环境更为自然。

摘要

使用遗传模式生物，例如 秀丽隐杆线虫 在过去的五十年中，已促成生物学领域的多项开创性发现。我们目前所了解的大部分生物学知识源自 秀丽隐杆线虫 仅限于线虫的实验室培养，这可能无法完全反映它们在自然界中通常栖息的环境。线虫的培养 秀丽隐杆线虫 在更接近自然界中腐烂水果和植物堆肥内线虫所遇到的三维基质的三维环境中，可能会揭示出在二维条件下未观察到的新表型和行为。此外，三维条件下的实验有助于阐明我们在二维条件下观察到的表型对于线虫在自然环境中的实际意义。在此，一种新方法，其中 秀丽隐杆线虫 在三维条件下正常生长和繁殖的方法如下所述。培养 秀丽隐杆线虫 在线虫生长管-3D（NGT-3D）中可使我们测量线虫的生殖适合度 秀丽隐杆线虫 在三维环境中培养不同菌株或不同条件下的生物体。我们还提出了一种新方法，称为线虫生长瓶-3D（NGB-3D），用于培养 秀丽隐杆线虫 用于显微分析的三维成像。这些方法使科学家能够研究 秀丽隐杆线虫 在更接近自然界中所遇环境的条件下研究生物学。这些条件有助于我们理解生理学和行为学背后的进化意义 秀丽隐杆线虫 我们在实验室中观察到。

引言

过去五十年中，对线虫 Caenorhabditis elegans 的实验室研究推动了生物学领域的多项开创性发现¹。C. elegans 是首个于1998年完成全基因组测序的多细胞生物²，在揭示单个基因对整个生物体发育、生理和行为的影响方面具有不可估量的价值。目前，科学家正致力于进一步探究这些基因如何影响生物体在自然环境中的生存与繁殖适应性，从遗传层面提出有关生态学与进化的问题^3-5。

C. elegans 再次成为回答这些问题的优良体系。然而，目前对 C. elegans 在天然线虫栖息环境中的生物学特性了解甚少，且尚无现有方法可在实验室中模拟 C. elegans 的受控自然条件。在实验室中，C. elegans 通常在接种了 E. coli 细菌的琼脂平板表面培养⁶。然而在自然界中，C. elegans 及其近缘线虫广泛分布于全球各类土壤中，但尤其常见于腐烂的果实和植物残体中并在此旺盛生长^7,8。这些三维（3D）复杂环境与实验室中线虫所处的简单二维（2D）环境存在显著差异。

为了在更接近自然的三维环境中探究线虫生物学的相关问题，我们设计了一种用于实验室培养线虫的三维培养系统，称为“线虫三维生长管”（Nematode Growth Tube 3D），简称 NGT-3D⁹。该系统的设计目标是实现与标准二维线虫生长培养基（Nematode Growth Media, NGM）平板¹⁰相当的生长、发育和繁殖能力。该三维培养系统可支持细菌和线虫在其整个生命周期中的三维生长，允许线虫在三维空间中自由移动和自然行为，且制造和使用简便、成本低廉。

在本研究中，我们提供了一种逐步制备NGT-3D并评估线虫发育和繁殖力的方法。除了在三维条件下评估线虫的适应性外，我们还致力于对三维培养条件下的线虫行为和生理进行成像、录像和分析。因此，除NGT-3D外，本文还介绍了一种替代方法，称为线虫生长瓶三维法（Nematode Growth Bottle 3D，简称NGB-3D），用于在三维培养过程中对秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行显微成像。该方法对于研究在二维条件下已知的行为，以及发现三维培养所特有的新行为将具有重要意义。

方案

1. 准备 NGT-3D 和 NGB-3D 所需溶液

1. 配制以下无菌溶液：1 L 0.1454 M NaCl 溶液，1 L 1 M CaCl₂，1 升 1 M MgSO₄₄，LB 培养基（Lysogeny Broth），1 L 1 M KPO₄ 缓冲液（108.3 g KH₂PO₄ 和 35.6 g 的 K₂HPO₄，并填充 H₂0至1 L）。使用这些溶液制备NGM的方法可参见先前的实验方案。¹⁰.
2. 121 °C 高压灭菌 15 分钟
3. 配制50 ml无菌的5 mg/ml胆固醇溶液。在50 ml锥形管中，加入0.25 g胆固醇和50 ml 99.99%乙醇，充分混匀。 请勿高压灭菌使用50 ml注射器和0.45 µm针头滤器对胆固醇溶液进行灭菌，同时可去除任何未溶解的胆固醇。
4. （可选）配制10 ml浓度为150 mM的2'-脱氧-5-氟尿苷（FUdR）储备液。在15 ml离心管中进行操作。 在离心管中，加入0.3693 g FUdR和10 ml蒸馏水，充分混匀。

2. 准备用于NGT-3D和NGB-3D的细菌培养物

1. 用细菌接种10 ml LB液体培养基。C. elegans 饲喂所用的标准细菌为大肠杆菌（E. coli）OP50菌株。
2. 将接种后的细菌培养物置于37 °C摇床培养箱中过夜培养。
3. 为进行系列稀释，将9 ml NaCl溶液分装至无菌的15 ml锥形管中。例如，共准备7支试管，每管加入9 ml NaCl溶液，用于制备OP50菌株E. coli的10^-7稀释度样品。
4. 使用无菌的1,000 µl移液器，将1 ml细菌培养物或已稀释的细菌培养物加入含有9 ml NaCl溶液的无菌新管中，并充分涡旋混匀10 ml混合液。重复此步骤，直至达到所需的细菌稀释倍数。
   注意：所需细菌稀释倍数取决于细菌的种类与状态以及具体的实验条件。例如，OP50菌株E. coli的10^-6–10^-8稀释度可在每6.5 ml NGT-3D管中产生1–200个菌落。当菌落数量超过60时，线虫能够稳定发育并正常繁殖，该情况通常出现在10^-6–10^-7稀释度下。对于NGB-3D，则使用10^-8的稀释度。

3. 制备NGT-3D和NGB-3D（200 ml）

1. 制备细菌培养物后，将 0.6 g NaCl、1 g 颗粒状琼脂和 0.5 g 蛋白胨混合于一个 500 ml 的烧瓶中。将磁力搅拌子放入烧瓶内。
2. 加入 195 ml 蒸馏水，并用铝箔封住烧瓶口。
3. 在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。
4. 将灭菌后热的烧瓶置于磁力搅拌器上，以中等速度持续搅拌至少 2 小时。将烧瓶冷却至 40 °C。必须充分冷却，因为在此步骤后若温度过高可能导致最终琼脂出现浑浊；但温度过低则可能导致琼脂提前凝固。
   1. （可选）为加快冷却过程，可在将烧瓶置于搅拌器前 15 分钟将其放入 40 °C 水浴中。
5. 当琼脂培养基温度降至 40 °C 时，在持续搅拌条件下加入 200 µl 1 M CaCl₂、200 µl 5 mg/ml 胆固醇溶液、200 µl 1 M MgSO₄ 和 5 ml 1 M KPO₄ 缓冲液，使其终浓度分别为 1 mM CaCl₂、5 µg/ml 胆固醇、1 mM MgSO₄ 和 1 mM KPO₄。
   1. （可选）对于 NGT-3D 寿命测定实验，加入 80 µl 150 mM 氟脱氧尿苷（FUdR），使其终浓度为 120 µM¹²。
6. 将步骤 2.4 中稀释的 10 ml 细菌培养物中的 6 ml 直接加入烧瓶中。
   1. （可选）对于 NGT-3D 实验，在步骤 3.6 前取出 6 ml 琼脂培养基并单独保温。该培养基将用于制备无菌顶层。
7. 采用无菌操作技术，将培养基分装至无菌培养腔室中。确保腔室盖子紧密闭合。
   1. （可选）为防止琼脂表面形成细菌菌落，可在步骤 3.7 的培养基完全凝固前，使用步骤 3.6.1 中的无菌培养基在其表面覆盖一层。这将在 NGT-3D 顶部形成一个无菌区域。
   2. 对于 NGT-3D，将 6.5 ml 培养基倒入 8 ml 透明塑料试管中以形成含菌琼脂层，然后小心地在半凝固的 3D 琼脂上层加入 200 µl 无菌培养基，形成一层薄的无菌顶层。
   3. 对于 NGB-3D，将 65 ml 培养基倒入 25 cm² 透明塑料细胞培养瓶中。此体积应恰好填满 25 cm² 细胞培养瓶的主体部分。
8. 将培养腔室垂直放置于室温下一周，使细菌菌落生长至至少 1 mm 直径的可观大小。
   1. （可选）对于 NGT-3D 的寿命测定实验，用铝箔覆盖腔室以防止 FUdR 受光照降解。

4. 在 NGT-3D 上测定线虫群体的适合度（相对子代数量测定）

1. 使用铂金丝挑取一只L4期线虫，转移到无菌的NGM平板上。让线虫自由爬行数分钟，以去除其体表附着的细菌。
2. 重复步骤4.1，确保线虫完全无菌。通常重复两次步骤4.1即可。
3. 用铂金丝将清洁的线虫小心放置于3D培养基表面。线虫最终会钻入琼脂，进入三维琼脂基质中。
4. 松散地盖上盖子，使试管内可进入少量空气，同时防止琼脂培养基干燥。
5. 在20 °C条件下培养96小时。
6. 4天后，将盖子拧紧，将NGT-3D培养装置放入88 °C水浴中，使琼脂融化。高温会杀死线虫，但其尸体保持完整。
   注意：使用8 ml试管进行NGT-3D实验时，通常20–30分钟的孵育时间已足够。
7. 使用玻璃移液管将融化的培养基转移至9 cm塑料培养皿中。不建议使用塑料移液管，因为线虫容易粘附在其表面。
8. 在透射式立体解剖显微镜下，统计处于L3、L4和成虫阶段的线虫数量。不要计数L2期及更早期的线虫，因为F1与F2代在此阶段难以区分。因此，本实验为相对子代数量测定，而非总子代数量测定。

5. 在 NGB-3D 上成像并记录线虫行为

1. 使用铂金丝挑取一只L4期的线虫，并将其转移至无菌的NGM平板上，使其自由移动数分钟，以去除体表附着的细菌。
2. 重复步骤5.1，确保线虫完全无菌。
3. 用铂金丝将清洁的线虫小心地放置于NGB-3D瓶内琼脂表面的中央，靠近瓶口颈部位置。线虫最终会进入琼脂，进入三维琼脂基质中。
4. 松散地盖上盖子，使试管内可进入少量空气，同时防止琼脂培养基干燥。
5. 在透射式体视解剖显微镜下对线虫进行成像或录像。随着线虫在三维基质中移动，适时调整焦距。

结果

NGT-3D 的构建是一种简单直接的方案，最终得到装有琼脂的试管，其中分布着分散的小型细菌菌落（图 1A）。线虫可在琼脂基质中自由移动，寻找并摄食这些细菌菌落。为了验证 C. elegans 是否能在 NGT-3D 中正常繁殖和生长，我们将 3D 条件下的繁殖力和幼虫发育情况与标准的 2D NGM 平板进行了比较。在相对子代数量检测中，当细菌菌落数量充足（至少 60 个菌落）时，NGT-3D 中的成年 C. elegans 雌雄同体个体的繁殖能力与标准 2D NGM 平板中的雌雄同体个体相当（图 1B）。此外，在细菌菌落充足的情况下，NGT-3D 中的幼虫发育也正常进行，96 小时后大多数线虫已发育至成虫阶段（图 1C）。然而，若 3D 基质中的细菌菌落稀少，则相对子代数量（图 1B，左侧柱状图）和幼虫发育（图 1C，左侧柱状图）均会受到显著负面影响。

讨论

实验室培养 秀丽隐杆线虫 使用经典的线虫生长培养基平板对线虫研究领域所取得的数百项重要发现至关重要 秀丽隐杆线虫 已提供。在此，我们介绍新的培养方法 秀丽隐杆线虫 在更准确反映其天然三维生境的环境中。尽管已有其他方法被用于观察 秀丽隐杆线虫 在3D中¹³这是首个允许在线虫在三维固体基质中进行培养的实验方案。本文展示的两种方法——NGT-3D 和 NGB-3D，使科研人员能够研究线虫在三维培养条件下的适应性、发育和生长情况，同时实现对线虫的三维成像与记录。尽管 NGT-3D 和 NGB-3D 与标准的二维 NGM 平板存在一些差异，但它们在本质上仍与原始方法相似，仅针对 z 轴方向的线虫培养进行了调整。因此，我们发现在线虫培养条件下，其发育、繁殖力和寿命均正常进行。本研究的目标是建立一种任何实验室均可应用于科研工作的实验方案。这些方法操作简便、成本极低、易于重复，并可根据使用者的具体实验需求对方案进行调整。

尽管方案中的所有步骤都很重要，但制备NGT-3D和NGB-3D的关键步骤在于第3.4...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB 肉汤，Miller（Luria-Bertani）	Difco	224620
氯化钠	DAEJUNG	7548-4400	58.44 MW
琼脂，颗粒状	Difco	214530
蛋白胨	Bacto	211677
氯化钙二水合物	Bio Basic	CD0050	2*H2O；147.02 MW
胆固醇	Bio Basic	CD0122	386.67 MW
乙醇	B&J	RP090-1	99.99%；46.07 MW
硫酸镁，无水	Bio Basic	MN1988	120.37 MW
磷酸二氢钾，无水	Bio Basic	PB0445	136.09 MW
2'-脱氧-5-氟尿苷	Tokyo Chemical Industry	D2235	246.19 MW
磷酸氢二钾，无水	Bio Basic	PB0447	174.18 MW
多功能试管	Stockwell Scientific	ST.8570	8 ml
试管盖	Stockwell Scientific	ST.8575
细胞培养瓶	SPL Lifescience	70125	25 cm2
科研体视显微镜	Nikon	SMZ18
高清彩色摄像头	Nikon	DS-Fi2
基于PC的控制单元	Nikon	DS-U3
NIS-Elements Basic Research 显微成像软件	Nikon	MQS32000