我们提出了一种在玻璃表面进行功能化的方法，使其形成被流动脂双层包围的纳米级蛋白质斑块。这些基底适用于先进的光学显微镜技术，有望作为细胞黏附与迁移研究的平台。
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本文内容
摘要
摘要
目前，人们对于在钝化表面的背景中构建有序的黏附蛋白岛阵列以用于细胞生物学研究具有浓厚兴趣。近年来，人们日益明确，活细胞不仅会对呈现给它们的分子的生化性质产生响应，还会对这些分子的呈现方式产生响应。因此，构建蛋白质微米级图案现已成为许多生物学实验室的标准技术，而纳米级图案也变得越来越容易实现。然而，在细胞-细胞相互作用的研究背景下，不仅需要对蛋白质进行图案化，还需要对脂双层进行图案化。迄今为止，这种双重的蛋白-脂质图案化技术仍难以实现。我们提供了一种简便的方法，可在玻璃表面构建由支撑的蛋白质纳米点，并提出一种方法，用支撑脂双层（SLB）填充纳米点之间的空隙。通过观察SLB中掺入的示踪荧光脂质的光漂白现象，我们证明该脂双层具有显著的平面内流动性。将荧光基团修饰到蛋白质纳米点上，使我们能够对其进行成像，并显示其排列成规则的六方晶格结构。典型的纳米点尺寸约为800 nm，本研究中实现的点间距为2微米。这些基底有望作为细胞黏附、迁移及力学感知研究的有用平台。
引言
细胞黏附通过特化的细胞黏附分子（CAMs）实现，这些分子是存在于细胞膜上的蛋白质，能够与细胞外基质或其他细胞上的对应分子结合。在已黏附的细胞中，大多数黏附分子（包括广泛存在的整合素和钙黏蛋白）以簇状形式存在1。T淋巴细胞（T细胞）与抗原呈递细胞（APCs）之间的相互作用尤为显著地体现了受体簇在两个细胞界面处形成的重要性——这一结构常被称为免疫突触。当T细胞与APC初次接触时，T细胞表面的T细胞受体（TCRs）会形成微米级的簇状结构，作为信号传导平台2,3,4，并最终向中心聚集形成更大的中心超分子簇（cSMAC）5,6,7。最近的研究表明，在APC一侧，TCR的配体也同样呈簇状分布8。
在T细胞与抗原呈递细胞（APC）相互作用的研究背景下，采用模拟APC的人工表面（其表面功能化修饰有相关蛋白质）的杂合系统，已极大地促进了我们对免疫突触界面的理解2,3,4,5,6,7。在此背景下，设计能够模拟靶细胞一个或多个特征的APC模拟表面具有重要意义。例如，若将配体接枝于支撑的脂双层上，这些配体可在双层平面内扩散，既模拟了APC表面的实际情况，又能同时促进cSMAC的形成6,7。类似地，研究人员已通过在聚合物“海洋”中构建配体“岛屿”的方式，模拟APC表面的配体簇状分布9,10,11,12,13,14。然而，迄今为止，上述两种特性尚未被整合于同一系统中。
本文介绍一种新颖的技术，用于创建由扩散性脂质构成的脂双层所包围的抗CD3纳米点（一种靶向TCR复合物的抗体）。该脂双层采用Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer技术沉积7,15,16，并可根据需要在其中功能化特定蛋白——例如T细胞整合素的配体（称为ICAM1）。此外，抗CD3蛋白点也可替换为其他抗体或细胞黏附分子（CAM）。尽管我们选择这些蛋白是为将来用于T细胞黏附研究的平台，但本文详述的策略可适用于任何蛋白，甚至DNA。
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方案
1. 清洁玻璃盖玻片和观察室
- 将玻璃盖玻片放置在由惰性材料（如聚四氟乙烯，PTFE）制成的多片载玻片托盘上。
- 将装有盖玻片的托盘和观察室浸入表面活性剂溶液中（任何推荐用于清洗石英比色皿的产品均可使用）。
- 使用超声波清洗机，在表面活性剂溶液中于室温（20 至 30 °C 之间）超声处理 30 分钟。
- 用超纯水（18.2 MΩ.cm，0.059 µS/cm）冲洗 5 次。
- 在表面活性剂溶液中于室温（20 至 30 °C 之间）再次超声处理 30 分钟。
- 用超纯水冲洗 10 次。
- 重复步骤 1.5 和 1.6 两次。
- 在室温（20 至 30 °C 之间）水中保存，最长可保存一周。
2. 蛋白质纳米点的制备
- 微珠沉积
- 将二氧化硅微珠悬浮液（2% v/v，70 µL）逐滴沉积在倾斜15度的盖玻片（24 × 24 mm，厚度170 µm）上。
- 让悬浮液扩散约1分钟，同时每15秒将玻片翻转90°。
- 在常温条件下让液体自然蒸发。
- 在洁净的玻璃或聚四氟乙烯（PTFE）容器中常温保存，最长可保存2天。
- 铝膜沉积
- 将第2.1节中制备的玻片放入射频（RF）磁控溅射设备8中，置于距铝（99%）：硅（1%）靶材约105 mm的旋转台面上。
- 使用涡轮分子泵将沉积室抽真空至2.6 × 10-4 Pa。此步骤对去除可能的气体杂质至关重要。
- 通入高纯氩气（5N，99.999%），流量为10 s.c.c.m.，压力维持在0.8 Pa（6.6 mTorr）。
注意：进气流量由质量流量控制器调节，工艺压力通过压力计监测。氩气流持续通入，通过调节进气与出气阀门的平衡进行控制。 - 开启射频电源发生器。
注意：此处通常使用频率为13.56 MHz、功率范围为400–600 W的射频电源。射频发生器通过匹配网络以电容耦合等离子体模式运行。通过网络调节监测并最小化反射功率。 - 待等离子体稳定后，保持快门关闭，溅射2分钟，以清除靶材表面可能存在的杂质。
- 打开快门，继续溅射60分钟，使铝在玻片表面沉积至200 nm厚度。
- 关闭氩气流，关闭闸阀以隔离涡轮分子泵与沉积室，并向腔室通入洁净氮气至常压。取出镀铝玻片，在洁净且密封良好的玻璃或PTFE盒中常温保存，最长可保存一个月。
- 有机硅烷的气相沉积
- 将第2.2.6步制备的镀铝玻片在室温下浸入超纯水中，并在超声波清洗仪（50 W，50/60 Hz，温度介于20至30 °C之间）中超声处理30秒。
- 在干燥器底部加入0.5 mL的(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）。
警告：APTES为易挥发且有毒的有机硅烷，仅可在通风橱内佩戴手套操作。 - 将第2.3.1步制备的玻片置于陶瓷网格上，并放入干燥器中。
- 将干燥器连接至隔膜泵，以最大功率运行30分钟，以建立低真空环境。
- 关闭干燥器阀门，关闭泵。
- 将干燥器加热至约50 °C，持续1小时。
- 打开干燥器，取出玻片。
- 转移至另一洁净干燥器中，在室温（20至30 °C）下保存，最长可保存48小时。
- 第一层蛋白沉积——生物素标记的牛血清白蛋白（BSA-生物素）
- 将第2.3节中制备的一片玻片放置于聚四氟乙烯（PTFE）支架上。
- 加入1 mL浓度为25 µg/mL的BSA-生物素溶液（溶于磷酸盐缓冲液PBS中），在室温（20至30 °C）下孵育30分钟。
- 用PBS冲洗10次。样品避光保存于4 °C，最长可保存24小时。
- 去除铝掩模
- 将玻片在NaOH的PBS溶液中（通过将1 M NaOH逐滴加入约100 mL PBS中调节至pH≈12）于室温（20至30 °C）下过夜孵育。
警告：NaOH具有腐蚀性，操作时应佩戴手套。 - 用超纯水冲洗10次。
- 将玻片在NaOH的PBS溶液中（通过将1 M NaOH逐滴加入约100 mL PBS中调节至pH≈12）于室温（20至30 °C）下过夜孵育。
3. 支持性脂质双层（SLB）的制备
- 清洁朗缪尔槽
- 使用泵将朗缪尔槽聚四氟乙烯（PTFE）腔室中的水排出。
- 用浸有氯仿的无尘非织造一次性擦拭布进行清洁。
警告：氯仿具有毒性，操作时应在通风良好的环境中进行，并佩戴口罩（或在通风橱内操作）以及适当的防护手套。 - 用温热的超纯水（40 至 50 °C）清洗 4 次。
- 用冷的超纯水至少清洗 6 次。
- 第一层脂质层的沉积
- 将 PTFE 托盘放入朗缪尔槽的 PTFE 腔室内，然后注入超纯水。
- 使用朗缪尔仪器的控制软件将测得的压力设定为 0 mN/m。
- 使用气密性玻璃/金属注射器将 30 µL 浓度为 1 mg/mL 的脂质溶液（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）溶于氯仿）滴加到水表面。氯仿挥发后，脂质分子会自发形成单分子层。
- 使用控制软件通过闭合 PTFE 挡板压缩脂质单分子层，直至达到目标压力（DOPC 为 27 mN/m）。
- 使用控制软件通过电动夹具将第 2.5.2 节中制备好的载玻片浸入 PTFE 腔室中。
- 将载玻片固定在夹具上，使其垂直于气-水界面。使用控制软件以缓慢速度（15 mm/min）将其从界面中提起，同时保持压力恒定在 27 mN/m。
- 将载玻片置于干燥环境中，可立即使用，或在室温（20 至 30 °C）下储存不超过 24 小时。
- 第二层脂质层的沉积
- 保持朗缪尔槽中表面压力在目标值 27 mN/m。可通过朗缪尔仪器的控制软件进行压缩，和/或添加少量脂质以达到所需压力。
- 将第 3.2.6 节中制备的带有脂质单分子层的载玻片水平放置于水面上。确保每片载玻片漂浮在对应的 PTFE 托盘上方。
- 使用 PTFE 或金属镊子逐个将载玻片向下推入相应的 PTFE 托盘中，使其完全浸入水中。推动过程中避免倾斜载玻片。
- 使用 PTFE 或金属镊子将含有载玻片的 PTFE 托盘转移至盛有超纯水的结晶皿中，确保载玻片不暴露于空气中。
- 在水下操作，使用 PTFE 或金属镊子将已涂覆双分子层的载玻片转移至观察室中。
注：观察室预先置于结晶皿的水下。该观察室为定制装置，由一个带橡胶垫圈和钢制外壳的 PTFE 环组成，可在水下组装成密封腔室，其底面即为先前涂覆脂质双分子层的载玻片。 - 继续在水下封闭腔室，并确保腔室内截留约 1 mL 水。
- 将组装好的腔室从水中取出，确保其密封良好，无泄漏。
- 通过反复加入和移除 500 µL PBS 共 10 次，替换观察腔室中现有的 1 mL 超纯水。确保腔室始终不缺液体。
- SLB 封闭步骤
- 向第 3.3.6 节制备的载玻片所在的观察腔室中加入 100 µg/mL 的牛血清白蛋白（BSA），在室温（20 至 30 °C）下孵育 30 分钟。
- 通过移除并添加 500 µL PBS 共 10 次清洗双分子层。双分子层可在 4 °C 下保存 24 小时。
4. 配体功能化
- 将荧光或非荧光的中性亲和素（NAV，一种在 pH 7 下不带电荷的去糖基化亲和素）以 2 µg/mL 的浓度加入到含有第 3.4.2 节制备的载玻片的腔室中，在室温（20 至 30 °C）孵育 30 分钟。
- 用 PBS 加液和移液各 500 µL，重复冲洗 10 次。
- 向含有第 3.4.2 节制备的载玻片的腔室中加入浓度为 2 µg/mL 的生物素化抗 CD3 抗体。若需对 SLB 和点状结构进行双重功能化修饰，同时加入浓度为 5 µg/mL 的 Fc-ICAM1 His 标签蛋白（此处双层膜由 DOPC + 1% 硝基三乙酸（NTA）脂质组成）。在室温（20 至 30 °C）孵育 30 分钟。
- 用 PBS 加液和移液各 500 µL，重复冲洗 10 次。
- 用细胞培养基（PBS + 0.1% BSA）替换 PBS，通过加液和移液各 500 µL，重复更换培养基 10 次。
- 在含有载玻片的腔室中保留 200 µL 细胞培养基。
- 在加入细胞前，将腔室置于 37 °C 环境中孵育 10 分钟。
5. 细胞沉积（详见参考文献7）
- 将400 µL细胞悬液小心地加入 chamber 中，在37 °C下孵育30分钟。
- 用2%多聚甲醛（PFA）在37 °C下固定细胞15分钟。通过反复移除和添加500 µL PBS，将PFA替换为PBS。
6. 观察
- 蛋白-脂质纳米图案与支持性脂双层流动性
- 使用荧光显微镜，在落射荧光模式下，采用适当的激发波长（639 nm）和滤光片组（例如，此处使用 EX TBP 483+564+642；BS TFT 506+582+659；EM TBP 526+601+688）对蛋白图案进行成像。
注意：可通过量化信号强度来估算点状结构内部和外部的蛋白含量。使用适当的激发波长（330 nm）和滤光片组（BP 365/12，FT 395，LP 397）对脂双层进行成像，此时脂双层呈亮区并带有暗孔。 - 采用连续光漂白（CPB）技术13,15测量示踪脂质在脂双层中的扩散系数。该观察最好在支持性脂双层（SLB）形成后立即进行。
注意：为了量化扩散系数，在CPB过程中需测量两个参数：染料的特异性漂白时间（tauT）以及漂白区域周围晕状荧光轮廓衰减长度（tauD）。第一个参数通过绘制CPB过程中照射区域中心荧光强度随时间变化的曲线获得；第二个参数通过在达到稳态后，对照射区域边缘的强度分布曲线进行平均（沿12条线、5张图像取平均）获得。将曲线拟合以得到tauT和tauD。扩散系数由tauD2/ tauT给出（D=
）。
- 使用荧光显微镜，在落射荧光模式下，采用适当的激发波长（639 nm）和滤光片组（例如，此处使用 EX TBP 483+564+642；BS TFT 506+582+659；EM TBP 526+601+688）对蛋白图案进行成像。
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结果
通过荧光图像分析测量点状结构的间距和尺寸。典型间距为 1,900 ± 80 nm，典型点状结构尺寸为 600 ± 100 nm（图 1g）。间距由用于掩膜的微珠尺寸决定，点状结构尺寸则由微珠尺寸及沉积条件共同决定。支撑脂双层（SLB）仅选择性地沉积在蛋白点状结构周围，而不在其上方（图 2），SLB 成像通道中观察到的孔洞与 NAV 成像通道中观察到的点状结构完全互补。连续光漂白数据的分析表明，图案化双层膜中的脂质保持流动性，典型的扩散系数为 5 µm²/s（图 3）。
图1：制备步骤的示意图。
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讨论
上述方案中的关键步骤与蛋白质纳米点的形成，或由支撑脂双层在纳米点周围进行的回填有关。关于蛋白质纳米点的第一个关键步骤是微珠掩模的制备。盖玻片的清洗至关重要。推荐使用清洗石英比色皿所用的洗涤剂溶液或氧等离子体对玻片进行清洗。其他清洗方法，如浸入乙醇或异丙醇处理，无法使玻璃表面足够亲水，因此不能支持大面积覆盖的微珠单层的形成。同时，玻片表面必须与后续通过Langmuir-Blodgett技术形成支撑脂双层（SLB）的步骤相兼容7,15,16。下一个关键步骤是铝的沉积与去除。若采用溅射技术进行沉积（如本实验），靶材应掺杂硅（含量1%）。否则，若使用纯铝靶材，所沉积的铝层难以用上述碱性氢氧化物溶液去除，这可能是由于形成了氧化铝，以及沉积的铝层与玻璃基底之间发生相互渗透所致。沉积时间决定了蛋白质点的尺寸9，但在本实验中，我们仅采用单一的沉积时间，因此获得单一尺寸的点。在铝沉积完成后，样品可在常温环境下保存数月；在B...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Laurent Limozin、Pierre Dillard和Astrid Wahl就细胞应用问题持续进行的富有成效的讨论。我们还感谢PLANETE洁净室设施的Frederic Bedu在扫描电镜观察方面提供的帮助。本工作部分由欧洲研究理事会通过资助编号307104 FP/2007-2013/ERC提供资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 玻璃盖玻片 | Assistent, Karl Hecht KG | ||
| 观察室 | 自制 | ||
| 碱性表面活性剂浓缩液（Hellmanex） | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 | |
| 超声波清洗器 | ThermoFisher | ||
| 干燥器 | Labbox | ||
| 结晶皿 | Shott | ||
| 中性亲和素（Neutravidine） | Thermo Fischer Scientifique | 84607 | |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 | |
| 超纯水（MQ） | ELGA, Veolia France | ||
| 二氧化硅微珠 | Corpuscular Inc | 147114-10 | |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 | |
| 生物素化牛血清白蛋白（BSA-Biotin） | Sigma-aldrich | A8549 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| 丹磺酰磷脂酰乙醇胺（Dansyl-PE） | Avanti Polar Lipids | 810330C | |
| 氯仿 | Sigma-aldrich | 650471 | |
| 气密注射器 | Dominique Dustcher , France | 74453 | |
| 成膜仪 | NIMA | Medium | |
| 显微镜 | Zeiss, Germany | TIRF-III 系统 | |
| 铝靶材 | Kurt J. Lesker Compagny, USA | ||
| 射频磁控溅射系统ème | 由法国 ALCATEL 改装的 SMC 600 工具 |
参考文献
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