分流手术、右心导管检查及血管形态测量在血流诱导型肺动脉高压大鼠模型中的应用

摘要

本方案描述了一种在大鼠中建立血流诱导肺动脉高压（PAH）模型的手术方法，以及分析该模型主要血流动力学和组织学终点的实验步骤。

摘要

在本实验方案中，通过联合使用60 mg/kg野百合碱（MCT）注射与经主动脉-腔静脉分流术（MCT+Flow）增加肺血流量来诱导肺动脉高压（PAH）。分流术通过将18号针头从腹主动脉插入邻近的腔静脉建立。研究表明，增加的肺血流量是诱发一种具有明确疾病进展阶段的重度PAH的关键触发因素，其特征为早期出现中膜肥厚，随后形成新生内膜病变，并逐渐导致小肺血管闭塞。为测量该模型中的右心及肺血流动力学，经右颈静脉插入带有柔性球尖导管的硬质套管进入右心室，进行右心导管检查。随后将导管推进至主肺动脉及更远端的肺动脉。肺血管系统的组织病理学评估采用定性与定量两种方法：定性评估通过评分肺小叶前和肺小叶内血管的肌化程度及新生内膜的存在情况；定量评估则通过测量血管壁厚度、壁腔比以及闭塞评分来完成。

引言

该方法的目的是建立一种可重复的大鼠严重血流诱导性肺动脉高压模型，并测量其主要的血流动力学和组织病理学终点指标。

肺动脉高压（PAH）是一种临床综合征，其特征是肺血管阻力进行性升高，最终导致右心室衰竭和死亡。在肺动脉高压性疾病（PH）这一大类疾病谱中，PAH 是最为严重的形式，目前仍无治愈手段¹。PAH 的基础血管病变表现为典型的血管重塑，导致血管腔闭塞。正常无肌层血管出现肌层化以及血管中膜层肥厚被认为是 PAH 的早期病变，这些改变也可见于其他类型的 PH²，且被认为具有可逆性³。随着 PAH 的进展，内膜层开始发生重塑，最终形成特征性的新生内膜病变²。这种新生内膜型肺血管重塑为 PAH 所特有，目前认为不可逆转⁴。

由于肺动脉高压（PAH）是一种罕见疾病，其病理生物学机制的深入理解以及新疗法的开发在很大程度上依赖于动物模型。大鼠单克洛碱（monocrotalin, MCT）模型是一种简便的方法 单次打击 一种被频繁使用且至今仍被广泛采用的模型。MCT 是一种毒素，可导致肺小动脉损伤及局部炎症⁵60 mg/kg MCT 在3至4周后会导致平均肺动脉压（mPAP）、肺血管阻力（PVR）和右心室肥厚（RVH）升高⁶组织形态学特征为孤立的中膜肥厚，无新生内膜病变⁵因此，MCT大鼠模型代表了一种中度的肺动脉高压（PH），而非肺动脉高压症（PAH），尽管该模型常被误称为后者。

在伴有先天性左向右分流的肺动脉高压患儿（PAH-CHD）中，肺血流量增加被认为是导致新生内膜病变发展的关键触发因素^7,8,9。在大鼠中，可通过建立腹主动脉与下腔静脉之间的分流来诱导肺血流量增加，该技术最早于1990年被描述¹⁰。其他诱导肺血流量增加的方法包括单侧肺切除术或锁骨下动脉-肺动脉吻合术¹¹。这些模型的概念性缺陷在于：单侧肺切除可能引起剩余肺组织的代偿性生长以及适应性通路的激活，而肺动脉吻合术则可能导致医源性肺血管损伤，二者均会干扰肺血流量增加本身所产生的效应。

当在MCT处理的大鼠中建立主动脉-下腔静脉分流并诱导肺血流增加作为二次打击时，会出现特征性的内膜下病变，并在血流增加后3周内发展为严重的肺动脉高压及相关的右心室衰竭（RVF）¹²该模型中肺动脉高压（PAH）的血流动力学进展可被评估 体内 通过超声心动图和右心导管检查。血管组织形态学、血管壁厚度、小动脉闭塞程度以及右心室衰竭的相关参数构成了 离体 多环芳烃的表征

本方法详细描述了主动脉-腔静脉分流术（AC-分流术）、右心导管术以及血管组织形态学定性和定量评估的实验方案。

方案

涉及动物受试者的实验程序已获得荷兰中央动物实验委员会和格罗宁根大学医学中心动物护理委员会（荷兰）的批准。实验使用了体重在180至300克之间的Wistar和Lewis大鼠。

1. 动物饲养与适应性驯化

1. 到达中心动物房后，将大鼠以每笼5只进行群养。在为期7天的适应期期间，使大鼠适应人类接触操作，但不得进行任何实验操作。

2. 无菌野百合碱的制备与注射

1. 配制1 mL浓度为60 mg/mL的野百合碱（MCT）溶液时，称取60 mg野百合碱置于2 mL离心管中，加入700 µL 0.9% NaCl溶液，再加入200 µL 1 M HCl。将离心管置于热水下温育并涡旋混匀。使用6 N NaOH调节溶液pH至接近7.0。配制用于注射啮齿类动物的MCT溶液时，需采用无菌操作技术。
2. 按每公斤体重皮下注射1 mL无菌60 mg/mL MCT溶液的剂量，在动物颈部进行注射（例如，300 g大鼠注射0.3 mL 60 mg/mL MCT溶液）。注意：我们不推荐使用更小的注射体积，因为可能导致给药剂量不准确。

3. 腔静脉-主动脉分流手术

1. 麻醉
   1. 用5%异氟烷/100%氧气充满诱导室₂ （流速：1 L/min）并将大鼠放入麻醉舱中。通过夹捏后肢脚趾检查麻醉深度。称量大鼠体重。
   2. 剃除腹部约8 cm长、3 cm宽区域的毛发并进行清洁。将大鼠仰卧置于覆盖无菌垫的加热垫（37 °C）上。
   3. 将动物的吻部置于通风面罩/罩中，使用2-3%异氟烷/100%氧气₂ （流速：1 L/min）。通过夹捏后肢脚趾检查麻醉深度。使用眼膏以防止麻醉期间角膜干燥。
2. 分流手术
   1. 用氯己定擦拭皮肤进行消毒。皮下注射0.01 mg/kg的丁丙诺啡用于术后镇痛。
   2. 使用无菌器械进行手术。用10号手术刀片在腹部正中线处做切口，起始于膈肌下方1 cm处，向下延伸至接近外生殖器上方。
   3. 用棉签轻轻抬起肠管，以无菌湿纱布（0.9% NaCl）覆盖肠管，并将其置于动物左侧。
   4. 使用棉签分离将腹主动脉和下腔静脉与周围组织相连的膜。
      注意：不要解剖主动脉与下腔静脉之间的膜。
   5. 使用劈裂镊子，仅在主动脉分叉上方的主动脉右侧、针头将要插入的位置，去除血管周围脂肪组织。
   6. 使用棉签从穿刺点上方2 mm处开始分离主动脉和腔静脉，以腾出空间放置Biemer钳。
   7. 在此区域，先于主动脉周围放置一根松紧适宜的结扎线（5-0 缝线）。通过在结扎线上夹持一把柯赫钳（Kocher clamp）以施加张力，随后将柯赫钳置于切口上方。图1A）。将Biemer钳置于结扎线稍上方图e 1A).
   8. 使用棉签尽可能向远端压迫下腔静脉以阻断血流（图1A）。将一根针头（本方案中使用18 G针头）弯成45度角，针尖朝向外侧（图1A).
   9. 以90度角将针头插入主动脉分叉上方，针孔朝向左侧图1A将针尖向左移动并插入下腔静脉。
      注意：此时针尖应可见于腔静脉中（图1B).
   10. 使用第二根棉签将主动脉内残留的血液从插入部位推出，以防止血栓形成。用无菌纱布擦干分流管周围的区域，以便胶水能够充分粘附。
   11. 将整个针头从主动脉中拔出，立即在主动脉穿刺部位滴加一滴组织胶。注意勿将棉签粘附到组织上。松开主动脉夹。
   12. 通过牵拉并释放分流 proximal 端主动脉上的结扎线，手动验证分流是否通畅。结扎线松开后，应使分流 distal 端的下腔静脉充盈鲜红色血液，并在分流部位产生湍流。
       注意：结扎后会使静脉中的血液恢复为暗红色。
   13. 将肠道放回动物体内。使用可吸收的4-0缝线缝合肌肉层和皮肤。用100% O₂为动物通气₂ 从麻醉中恢复。
       注意：在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。
3. 假手术
   1. 除将针插入主动脉外，执行上述所有步骤。
4. 术后护理。
   1. 将大鼠放入单独的笼子中，并置于37 °C的培养箱内，直至第二天早晨。
   2. 术后约6小时，皮下注射0.01 mg/kg的布托啡诺，用于术后镇痛。若大鼠次日早晨仍表现出不适症状，可重复给药一次。
      注意：术后前3天，大鼠的进食和饮水量通常会减少（当饲料或饮用水中混有药物时，这一点尤为重要）。大多数大鼠在术后3天可恢复正常行为。若未恢复，需密切观察。若1周内体重减轻超过15%，视为异常，应在麻醉状态下通过放血法处死。

4. 肺动脉高压的发展

注意：在本实验方案中，动物在麻醉状态下通过放血以处死。

1. 术后1天处死（MF8），以研究肺血流量增加后的早期细胞和功能反应例如， 基因上调或早期转录因子
2. 术后1周处死动物（MF14），以获取肺动脉高压早期血管表型（中膜肥厚，无新生内膜病变）。
3. 术后2周（MF21）处死动物，以获得晚期肺动脉高压血管表型（明显的中膜肥厚和新生内膜形成），伴有右心室压（RVP）和平均肺动脉压（mPAP）轻度升高。
4. 术后3周（MF28）处死动物，以获取终末期肺动脉高压血管表型（显著的内膜增生性闭塞），此时右心室压（RVP）和平均肺动脉压（mPAP）显著升高。此阶段常出现右心衰竭的临床体征。
5. 第28天后实施安乐死（MF-RVF），用于肺动脉高压相关右心衰竭（RVF）的研究，临床定义为呼吸困难、严重嗜睡和体重减轻< 1周内体重减轻10%）。当出现上述任一症状时，应终止实验并处死大鼠。通常情况下，大鼠在第28至35天之间出现这些症状，若不加以干预，会在此期间自发死亡。

5. 右心导管插入术

1. 麻醉
   1. 用5%异氟烷/100%氧气填充诱导室₂ （流速：1 L/min），将大鼠放入箱中。通过夹捏后肢脚趾检查麻醉深度是否充分。称量大鼠体重。
   2. 剃除大鼠颈部右侧腹面的毛发并清洁该区域，进行超声心动图检测时，还需剃除胸部和上腹部的毛发并清洁。
   3. 将大鼠仰卧置于加热垫（37 °C）上，并将其口鼻部放入含有2–3%异氟烷/100%氧气的通气面罩/罩中₂ （流速：1 L/min）。鼻部应朝向研究人员。
   4. 检查麻醉深度。对患有严重肺动脉高压（PH）的大鼠需格外小心。若心率下降，应降低麻醉深度。建议所有测量在20分钟内完成。麻醉期间涂抹眼膏以防止角膜干燥。
2. 超声心动图检查方案
   1. 根据Brittain所述的方案进行超声心动图检查 等 在 JoVE 中¹³.
3. 导管插入术操作规程
   注意：本方案使用刚性 套管 带有预成型的20度弯曲尖端，用于引导15厘米硅胶管 导管 尖端前方2 mm处有一个小球。20-G 针 使用其管口稍向内弯曲的插管将套管插入大鼠右侧颈静脉（参见材料列表）。本方案适用于肺动脉高压（PAH）进展各阶段及对照组的大鼠。
   1. 用氯己定消毒颈部。使用#10手术刀片在颈部右腹侧从右锁骨至下颌骨处做一1.5 cm的切口。
   2. 用剪刀展开组织。用镊子轻轻将组织分开，直至颈静脉显现。使用显微镊剥离颈静脉周围的膜。
   3. 通过在颈静脉周围放置一根松紧适当的结扎线（5-0 缝线）对静脉施加张力。逐步增加张力，并将结扎线固定于呼吸面罩上图 2A).
   4. 在插入位点的下游，于血管周围放置一个松紧结，待插管插入后将其扎紧 原位 以防止泄漏和压力损失。
   5. 使用镊子的手柄轻轻弯曲20号针头的尖端，使针口朝内，以引导套管和导管。
   6. 将20号针头的尖端插入静脉，迅速将带有导管的套管送入血管内。拔出针头，然后结扎第5.3.4步中预先准备好的结扎线。
   7. 将带有导管的套管插入颈静脉。套管尖端呈20度弯曲（见步骤5.3.5）。操纵套管经过锁骨下方，并稍向前推进以进入右心房。图2C).
   8. 为进入右心室，将导管尖端指向左侧，朝向心脏（图 2D）。在床旁监护仪上，应出现与右心室压力曲线相匹配的波形 图 2D.
   9. 当右心室压力曲线稳定时，记录右心室收缩压和舒张压1（sRVP1/dRVP1）。
   10. 将套管针的尖端向左上方移动。推进导管进入套管内（图 2E).
   11. 将导管推进至主肺动脉（PA）。通过肺动脉瓣时不应感到任何阻力。
       注意：当导管进入主肺动脉时，舒张压将升高。在床旁监护仪上应出现肺动脉压力曲线，与之匹配 图2E.
   12. 当肺动脉（PA）压力曲线稳定时，记录肺动脉收缩压、舒张压和平均压1（sPAP1、dPAP1、mPAP1）。
   13. 将导管进一步经套管推进，直至导管尖端的球囊嵌入肺动脉分支。观察床旁监护仪上的压力曲线下降，并与楔压曲线相一致 图 2F.
   14. 当楔压曲线稳定时，记录收缩期、舒张期和平均楔压。
   15. 缓慢回撤导管，随后测量并记录床旁监护仪上显示的sPAP2、dPAP2、mPAP2、sRVP2和dRVP2数值。
   16. 当导管位于右心室时，轻微回撤套管和导管以测量平均右心房压（RAP）。曲线应与 RAP 曲线相匹配 图2A.
       注意：在本实验方案中，大鼠在麻醉状态下通过放血法处死，即在导管插入术完成后放尽循环血量以实施安乐死。

6. 形态学评估与形态测量

注意：本方案中，动物在麻醉状态下通过放血以处死。处于肺动脉高压（PAH）进展期任何阶段的大鼠以及对照组大鼠均可用于本方案。

1. 处死动物后，于支气管分叉上方约5 mm处切断气管，并切断连接肺与心脏的血管，取出肺组织，置于冷生理盐水中。分离左肺，在分叉处切断左主支气管。
2. 用50 mL注射器吸取4%多聚甲醛，将连接有套管针的导管安装在注射器上，并将注射器悬挂在工作台上方约1米处。将套管针插入左主支气管，以被动灌注多聚甲醛填充肺部。操作多聚甲醛时应谨慎小心。
3. 将左肺置于多聚甲醛中孵育48小时。
4. 将左肺依次置于70%乙醇（1小时）、80%乙醇（1小时）、90%乙醇（1小时）、100%乙醇（3小时）、二甲苯（2小时）和石蜡（2小时）中孵育以进行脱水。
5. 将左肺置于包埋盒中，肺门朝向盒面，进行石蜡包埋。
6. 根据制造商说明书，使用Verhoeff或Elastica-van Gieson染色法对石蜡包埋的4-µm肺组织切片进行染色²⁹确保弹性膜清晰可辨（如 图3）。以40倍放大倍数扫描染色切片。
7. 将肺部分为4个象限。在每个象限中，寻找10个外径 < 50 µm（腺泡内）和10条具有外径的血管 > 50 µm（前小叶细支气管）。每肺拍摄2 × 40张图像。随机放大至20倍，对视野中的每一条血管进行拍照，以尽量减少选择偏倚。
8. 排除最长直径与最短直径比值过大的血管 > 2，不完整的环形结构，或血管壁塌陷超过四分之一。
   注意：图中显示了一个被排除的血管示例 图3b 每张图片应使用相同的放大倍数（40X），并包含比例尺。
9. 打开 ImageJ 并导入第一张图片。在图片的标尺上绘制一条直线，通过“分析" 和 设置比例尺。”对于“已知距离，使用图片比例尺上的数值，长度单位为微米（µm），将比例尺设为全局。
10. 使用“徒手选择," 在管腔区域的内侧边界上画一条线（图3), 并使用 测量" （按 Ctrl + M）测量该区域。然后，在外弹性膜周围画一条线。图3) 以测量血管总面积。
11. 计算管腔和外径（）使用 .
12. 使用以下方法计算壁厚 .
13. 使用以下方法计算管壁/管腔比 .
14. 使用以下方法计算阻塞分数 .
15. 根据血管肌化程度进行评分（无肌化、部分肌化或完全肌化）（图3B).
    注意：若血管的双层弹性膜超过管壁周长的一半，则定义为完全肌化；若双层弹性膜不足管壁周长的一半，则定义为部分肌化。
16. 根据是否存在新生内膜对血管进行评分（是或否）图3C).
    注意：缺乏明确内弹性膜且伴有（常为偏心性）管腔闭塞的血管被定义为新生内膜病变。

结果

代表性结果见图4。所示结果展示了以下各组Lewis大鼠中MCT+FLOW的特征：对照组（n = 3）、MF8组（n = 5）、MF14组（n = 5）、MF28组（n = 5）和MF-RVF组（n = 10）。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）并进行Bonferroni校正。

60 mg/kg MCT 和增加的肺血流量导致第 28 天（MF28）右心室收缩压（sRVP）（从 23 ± 6 升至 56 ± 11 mmHg）、肺动脉收缩压（sPAP）（从 20 ± 4 升至 54.0 ± 10 mmHg）和平均肺动脉压（mPAP）（从 16 ± 3 升至 36 ± 4 mmHg）显著升高。这些压力在右心室衰竭发生阶段（MF-RVF）之前均维持在高水平（图 4）。在肺动脉高压早期阶段（MF8 和 MF14），sRVP、sPAP 和 mPAP 均未见升高。肺动脉舒张压和右...

讨论

本方法描述了对经MCT预处理的大鼠建立动静脉瘘以诱导血流依赖性肺动脉高压的外科手术步骤，以及评估该模型中肺动脉高压主要血流动力学和组织病理学终点的技术。

方案中的关键步骤与故障排除

手术及术后操作。在建立主动脉-下腔静脉分流术的过程中，最关键的步骤是主动脉与下腔静脉的分离。包裹主动脉和下腔静脉的膜组织应充分游离，以实现两个目的：1）获得良好的视野，便于观察针穿刺主动脉的位置以及穿刺后针在下腔静脉内的位置；2）在穿刺点上方为主动脉提供足够的空间以便夹闭。然而，这些膜组织也起到引导血流从主动脉经穿刺孔进入下腔静脉的作用（图1）。若过度剥离这些膜组织，将导致分流处发生渗漏。使用组织胶可封闭渗漏，但胶水也可能渗入分流通道，从而影响其有效直径。当胶水导致分流通道或任一血管血流受限时，可尝试轻柔地清除胶水，但此操作可能引起下腔静脉或引导分流的膜组织破裂。可通过使用棉签压迫并释放近端主动脉，观察下腔静脉内血液颜色的差异及血流湍流程度的变化，来评估分流通道的大小或通畅性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
分流手术
无菌外科手套
Duratears 眼膏	Alcon	10380
氯己定
棉签
Histoacryl 组织胶	B. Braun Medical	1050052
Silkam 5-0 缝线 黑色 不可吸收	B. Braun Medical	F1134027
Safil 4-0 缝线 紫色 可吸收	B. Braun Medical
18 G 针头	Luer	NN1838R BD	针尖向外弯曲45度
纱布 10 x 10 cm	Paul Hartmann	407825
镇痛新 布托啡诺	RB Pharmaceuticals	5429	皮下注射
0.9% 氯化钠
大鼠通气面罩
手术刀片
Biemer钳 18 mm，5 mm开口	AgnTho	64-562
加热垫
Kocher钳
剃毛机
显微镜	Leica
右心导管术
无菌外科手套
眼膏	Duratears
氯己定
棉签
纱布 10 x 10 cm	Paul Hartmann	407825
Silkam 5-0 缝线 黑色 不可吸收	B. Braun Medical	F1134027
20 G 针头	Luer		针尖轻微向内弯曲
20 G 套管	Luer		用于插入导管，针尖预弯20度
硅胶导管 长15 cm			距尖端2 mm处有0.5 mm球囊
压力传感器	Ailtech
床旁监护仪 Cardiocap/5	Datex-Ohmeda
剃毛机
10 mL 注射器
0.9% 氯化钠			用于冲洗
血管形态学
50 mL 注射器
4% 甲醛
带管路的18 G 套管
Verhoeff染色试剂盒	Sigma-Aldrich	HT254	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US
数字切片扫描仪	Hamamatsu	C9600
ImageJ
弹性纤维（结缔组织染色）	Abcam	ab150667	http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf