使用附加体质粒载体从人外周血单个核细胞生成无整合诱导多能干细胞

摘要

本方案描述了一种从成人外周血细胞高效生成无整合iPSC的详细方法。通过使用四种基于oriP/EBNA的附加体质粒表达重编程因子KLF4、MYC、BCL-XL以及OCT4和SOX2，可从1 mL外周血中获得数千个iPSC克隆。

摘要

诱导性多能干细胞（iPSCs）在疾病建模和再生治疗方面具有广阔前景。我们此前报道了使用附加体型载体（EV）从外周血单个核细胞（PB MNCs）中生成无整合的iPSCs。所用的附加体型载体是含有Epstein-Barr（EB）病毒oriP和EBNA1元件的DNA质粒， 可在哺乳动物细胞中实现质粒的复制和长期保留， 分别通过进一步优化，可从1 mL外周血中获得数千个iPSC克隆。实现高效重编程的两个关键因素 是：1）使用 2A "自切割" 通过使用连接OCT4和SOX2的肽段，实现这两种因子的等摩尔表达；2）使用两个独立载体分别表达MYC和KLF4。本文详细描述了一种从成人外周血样本中生成无整合诱导多能干细胞（iPSCs）的逐步操作方案。所获得的iPSCs为无整合型，因为在连续传代五次后已无法检测到残留的附加体型质粒。尽管该方法的重编程效率与仙台病毒（SV）载体相当，但附加体（EV）质粒的成本显著低于 commercially available 的SV载体。这种经济高效的EV重编程系统在再生医学的临床应用中具有广阔前景，并为外周血单个核细胞（PB MNCs）直接重编程为无整合型间充质干细胞、神经干细胞提供了可行策略。 等等.

引言

在强制表达多个转录因子后 (即 OCT4、SOX2、MYC 和 KLF4），体细胞可被重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs），这类细胞在再生医学和细胞替代治疗中具有广阔的应用前景^1-3迄今为止，已开发出多种方法以提高重编程的成功率^4-7病毒载体诱导的重编程因病毒整合可实现重编程因子的高效、稳定表达，被广泛用于诱导多能干细胞（iPSCs）的生成。然而，载体DNA在细胞基因组中的永久性整合可能引发插入突变。⁵此外，重编程因子的不充分失活可能会干扰iPSCs的分化⁸因此，在细胞治疗应用中，必须使用不整合重编程因子的诱导多能干细胞（iPSCs）。

附加体质粒（EVs）被广泛用于生成无整合的诱导多能干细胞（iPSCs）。最常用的附加体质粒是一种包含两种元件的质粒：来自EB病毒（Epstein-Barr病毒）的病毒复制起点（oriP）和EB病毒核抗原1（EBNA1）⁹。oriP元件可促进质粒在哺乳动物细胞中的复制，而EBNA1元件则将含有oriP的质粒DNA锚定至染色体DNA上，从而在宿主细胞分裂时实现附加体的分配。与其他无整合方法（如仙台病毒（SV）和RNA转染）相比，附加体质粒具有多种优势^5,6,10。作为质粒DNA，附加体质粒可在实验室内方便地制备和修饰，因此成本极低。此外，使用附加体质粒进行重编程的操作更为简便，因....

方案

所有人外周血样本均来自天津市血液中心的匿名成年捐献者，在当地研究伦理委员会批准下获取，无任何可识别的个人信息。

1. 无内毒素质粒制备

1. 根据制造商的说明书，使用商业质粒纯化大提试剂盒从 E. coli 中提取附加体质粒。最后一步中，用无内毒素的无菌水替代TE缓冲液以溶解DNA沉淀。
2. 使用商业紫外/可见光分光光度计测定DNA浓度。浓度通常大于1 µg/µL， A260/A280 和 A260/A230 比值分别大于1.8和2.0。

2. 培养基

1. 制备红系培养基：在造血干细胞扩增培养基中添加100 ng/mL人干细胞因子（SCF）、10 ng/mL白细胞介素-3（IL3）、2 U/mL促红细胞生成素（EPO）、20 ng/mL胰岛素样生长因子-1（IGF1）、1 µM地塞米松和0.2 mM 1-巯基甘油。使用0.22 µm注射器滤器过滤灭菌。红系培养基可在4 °C下保存最多一个月。
2. 制备iPSC培养基：在DMEM/F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12）中添加1x L-谷氨酰胺、1x青霉素/链霉素、1x非必需氨基酸溶液、50 ng/mL成纤维细胞生长因子2（FGF2）、1x胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂（ITS）和50 mg/mL抗坏血酸。使用0.22 µm注射器滤器过....

结果

采用本方案，可以从 1 × 10⁵ 个核转染的外周血单个核细胞（PB MNCs）中获得数百个克隆（图 1A 和 1B）。重编程效率约为 0.2 - 0.5%，且克隆表达多能性标志物（图 1C 和 1D）。通过所述方案生成的诱导多能干细胞（iPSCs）无整合，且具有形成包含三个胚层的畸胎瘤的能力（图 1E 和 1F）。

讨论

从健康供体或患者获取血样方便且无创，使其成为基础研究和临床细胞治疗的理想细胞来源。本文介绍了一种从外周血样本高效生成无整合iPSC的方案。这一可重复且经济的方法将有助于iPSC领域的发展。

我们已报道，高效PB重编程有两个关键因素³⁰。其一是通过使用2A连接肽实现OCT4与SOX2的等摩尔表达³¹。为实现这一点，本方案中采用了质粒pEV-OCT4-2A-SOX2。其二是使用两个质粒pEV-MYC和pEV-KLF4分别表达MYC和KLF4，而非我们先前使用的pEV-MYC-2A-KLF4³⁰。这一看似简单的改变使PB重编程效率提高了约100倍，这主要归因于在重编程过程中MYC与KLF4的比例逐渐升高且增幅更大。

为实现从外周血（PB）高效生成诱导多能干细胞（iPSC），需考虑若干要点。外周血单个核细胞（PB MNCs）需在红系培养基中培养约1周，以促进红系祖细胞的增殖与扩增，从而提高重编程效率²⁰。然而，对于某些样本（尤其是白血病患者的血细胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
造血干细胞扩增培养基	Sigma	S0192	4°C 下保存 °C
人干细胞因子（SCF）	Peprotech	300-07	储存于 -20 或 -80 °C
白细胞介素-3（IL-3）	Peprotech	AF-200-03	储存于 -20 或 -80 °C
促红细胞生成素（EPO）	Peprotech	100-64	储存于 -20 或 -80 °C
胰岛素样生长因子-1（IGF-1）	Peprotech	100-11	储存于 -20 或 -80 °C
地塞米松	Sigma	D4902	储存于 -20 或 -80 °C
1-硫代甘油（MTG）	Sigma	M6145	储存于 -20 或 -80 °C
DMEM/F12 培养基	Gibco	112660-012	4°C 下保存 °C
L-谷氨酰胺（100倍）	Gibco	25030-081	-20℃保存 °C
青霉素/链霉素（100倍浓缩）	Gibco	15140-122	-20℃保存 °C
非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）	Gibco	11140-050	4°C 保存 °C
成纤维细胞生长因子2（FGF2）	Peprotech	100-18B	储存于 -20 或 -80 °C
胰岛素-转铁蛋白-硒（Insulin-Transferrin-Selenium，ITS，100倍浓缩液）	Gibco	41400-045	4°C 下保存 °C
抗坏血酸	Sigma	49752	-20℃保存 °C
DMEM（高糖）培养基	赛默飞世尔科技	SH30243.01B	4°C 下保存 °C
胎牛血清（FBS）	Hyclone	SV30087.01	-20℃保存 °C
Ficoll	GE Healthcare，SIGMA	17-5442-02	室温保存
海藻糖	Sigma	T9531	4°C 下保存 °C
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D2650	室温保存，避光
内毒素去除质粒大提试剂盒（10）	Qiagen	12362	室温保存
IMDM	Gibco	21056-023	4°C 保存 °C
人类CD34+细胞核转染试剂盒	Lonza	VPA-1003	室温保存，核转染缓冲液和补充剂应于4℃保存 °C
丁酸钠	Sigma	B5887	储存于 -20 或 -80 °C
ROCK抑制剂 - Y27632	STEMGENT	04-0012-10	-20℃保存 °C
Essential 8 基础培养基（E8）	Gibco	A15169-01	4°C 下保存 °C，该补充剂应保存在 -20 或 -80 °C
Matrigel	BD	354277	储存于 -20 或 -80 °C
2x EasyTaq PCR 超级混合液（含染料）	TransGen Biotech	AS111	-20℃保存 °C
细胞解离液	STEMGENT	01-0006	-20℃保存 °C，使用Accutase作为细胞解离溶液以获得单细胞悬液
DAPI	Sigma	D9542-1MG	4 或 -20 保存 °C
抗Nanog AF488	BD	560791	4°C 下保存 °C，用于免疫荧光的一抗，使用时稀释比例为1/100
抗OCT4	abcam	ab19857	4°C 下保存 °C，用于免疫荧光的一抗，使用时稀释比例为1/100
AF488 驴抗小鼠 IgG	Invitrogen	A21202	4°C 保存 °C，用于免疫荧光的二抗，  使用时按1/500稀释
PE 抗人 TRA-1-60-R 抗体	Biolegend	330610	4°C 保存 °C，用于流式细胞术的抗体
eFluor 570 标记的抗 SSEA4 抗体	eBioscience	41-8843	4°C 保存 °C，用于流式细胞术的抗体
同型抗体	eBioscience	11-4011	4°C 保存 °C，用于流式细胞术的抗体
碱性磷酸酶检测试剂盒	SiDanSai	1102-100	4°C 下保存 °C
基因组DNA提取试剂盒	TIANGEN	DP304-02	室温保存
台盼蓝溶液	Sigma	T8154	室温保存
流式细胞仪细胞分析仪	BD	LSRII
转盘共聚焦显微镜（SDC）	PerkinElmer	UltraVIEW VOX	用于共聚焦成像
核转染装置	Lonza	Nucleofector 2b	用于外周血单个核细胞的核转染
ImageQuant LAS-4010	通用电气		批量拍摄碱性磷酸酶染色照片