分析营养补充剂在实验性结肠炎期间对肠道上皮屏障功能的有益作用

摘要

目前对炎症性肠病（IBD）的治疗旨在缓解疾病症状，但可能引起严重副作用。因此，研究人员正在利用动物结肠炎模型探索替代性治疗策略。本文将介绍如何在结肠炎模型中分析膳食补充剂对临床IBD症状的有益作用。

摘要

炎症性肠病（IBD），包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，是一类肠道的慢性复发性疾患。患者会出现严重症状，如腹痛、血性腹泻和体重减轻。遗憾的是，目前尚无治愈方法，治疗手段仅旨在缓解症状。现有疗法包括可能引起严重副作用的抗炎药和免疫抑制剂。因此，有必要寻找不会产生副作用的替代治疗方案，例如营养补充剂。在将其应用于临床研究之前，这些化合物必须在动物模型中严格测试其有效性和安全性。其中一种可靠的实验模型是小鼠右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎模型，该模型可再现人类溃疡性结肠炎的多种临床特征。我们近期应用该模型评估了一种含有维生素C和E、L-精氨酸以及ω3-多不饱和脂肪酸（PUFA）的营养补充剂的有益作用。我们分析了多种疾病相关参数，发现该补充剂能够减轻水肿形成、组织损伤、白细胞浸润、氧化应激以及促炎细胞因子的产生，从而整体改善疾病活动指数。本文中，我们将详细说明在C57Bl/6小鼠DSS诱导结肠炎模型中正确应用营养补充剂的方法，并介绍如何评估组织病理学、氧化应激和炎症等疾病参数。对不同饮食补充剂的有益效应进行系统分析，有望为开发可缓解IBD症状和/或延长缓解期且不产生严重副作用的替代治疗策略提供新思路。

引言

结肠炎是一种结肠的炎症性疾病，可引起腹泻和腹痛。结肠炎可以是急性的，由感染或应激引发；也可以发展为慢性疾病，例如属于炎症性肠病（IBD）范畴的溃疡性结肠炎（UC）。尽管UC的临床表现已有较详细的描述，但其发病机制仍不甚清楚¹。目前专家普遍认为，UC是一种多因素疾病，其中基因突变和异常的免疫反应起着重要作用²。然而，环境因素如生活方式和营养状况也参与了疾病的发生和发展³。

遗憾的是，炎症性肠病（IBD）目前尚无法治愈，但存在多种旨在缓解临床症状的治疗方案。现有的治疗方法包括抗炎药物，如柳氮磺吡啶和皮质类固醇；免疫抑制剂，如硫唑嘌呤；单克隆抗体，可结合促炎性细胞因子（如肿瘤坏死因子-α（TNF-α））或阻断黏附分子（如整合素），以减少白细胞的过度募集；以及靶向激活促炎信号通路的激酶抑制剂，如Janus激酶（JAK）⁴。并非所有患者对所有治疗均有反应，因此治疗策略必须个体化⁵。此外，这些治疗药物大多会干扰机体的代谢和免疫应答，常导致严重的不良反应。因此，研究人员已开始探索替代性治疗方案。

替代疗法包括益生菌和营养补充剂，这些已在动物模型和临床试验中应用，并取得了不同程度的成功^6,7。我们最近发现，单独使用某种营养补充剂（如抗氧化维生素或ω3-多不饱和脂肪酸（PUFAs））在缓解结肠炎和心血管疾病症状方面，效果不如联合使用多种此类补充剂^8,9。这些研究是在小鼠中进行的，因此必须在人体中开展临床研究，以确定这些发现是否同样适用于人类。在启动临床研究之前，必须在动物模型中评估新治疗方案的有效性和安全性。

对于炎症性肠病（IBD），葡聚糖硫酸钠（DSS）模型已被广泛用于研究疾病发生机制以及药物和营养补充剂的有益作用^6,10。在大多数研究中，仅诱导为期七天的急性疾病；然而，这些动物所表现出的临床症状与IBD患者中观察到的症状非常相似（即血性腹泻、体重减轻、上皮功能障碍和免疫细胞浸润）¹⁰。DSS可引起黏膜糜烂，导致屏障功能障碍和肠道上皮通透性增加¹¹。其确切机制尚不明确。然而，有研究提示DSS可与中链脂肪酸相互作用，形成能够进入上皮细胞并激活炎症信号通路的纳米脂质复合物¹²。本文详细描述了如何在小鼠中诱导和分析结肠炎，如何通过灌胃给予营养补充剂以确保每只动物接受恒定剂量，以及如何检测这些补充剂对各种结肠炎症状的影响。

方案

所有动物实验均已获得Cinvestav机构动物护理和使用委员会的批准。

1. DSS 饮用水的制备与结肠炎的诱导

1. 在高压灭菌的饮水中配制3.5% w/v的葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液。DSS易于溶解，最终溶液无需过滤。
   注意：7天的DSS处理可诱导严重的结肠炎。若需诱导轻度结肠炎，建议处理3至4天。只要DSS饮用水保持澄清，便无需更换；但如果水变浑浊，则必须更换。
2. 记录雄性小鼠的基线体重，确保其年龄在8至12周之间，体重范围在21至25 g。
   注意：合适的DSS浓度需在每个实验室中进行优化。结果可能因饲养条件不同而存在显著差异。通常报道，在C57Bl/6J野生型小鼠中，2.5%–5%的DSS浓度可诱导出严重的结肠炎。¹⁰不同公司及不同批次的DSS应进行测试，因为使用不同来源的DSS可能导致结果差异。
3. 提供水 随意摄取 必要时更换为新鲜的3.5% DSS水。

2. 通过灌胃法应用营养补充剂

1. 制备 "可饲喂的" 按所需营养补充剂在适当溶剂中配制的溶液。本研究中采用的混合物包含200 mg/kg L-精氨酸、83 mg/kg 维生素C、46 mg/kg 维生素E、77 mg/kg 二十碳五烯酸（EPA）和115 mg/kg 二十二碳六烯酸（DHA），溶于水与红花油1:1混合溶液中。
2. 用1 mL注射器（连接15 G × 50 mm灌胃针）吸取营养补充剂混合物。擦拭灌胃针外壁，去除针外残留的化合物，以确保给药剂量准确。
3. 用一只手抓住小鼠尾部的基部，另一只手用拇指和食指牢固地捏住颈部后方的皮肤褶皱以固定小鼠。将尾巴置于握住颈部的同一只手的无名指与拇指根部之间。
4. 保持小鼠直立姿势，将针头插入动物口腔左侧，沿上颚小心推进以定位食道。若未遇到阻力，继续将针头向胃部推进。
   注意：在继续操作前，请确认动物呼吸正常。
5. 缓慢给予混合物，通过缓慢拔出注射器移除导管，然后释放小鼠。在结肠炎实验期间，每天通过灌胃给予一次营养补充剂。

3. 疾病活动指数的测定

注意：疾病活动指数是每日获得的体重减轻、肛周出血和粪便性状评分的综合结果¹³。

1. 每日测量体重，并根据体重减轻的百分比赋予0至4的评分（0：0%；1：1–5%；2：5–10%；3：10–20%；4：> 20%）。
   注：体重减轻程度通过计算DSS结肠炎诱导前的基础体重与实际体重之间的百分比差值来确定。
2. 为评估肛周出血程度，采集新鲜粪便样本，使用提供的取样棒从愈创木脂粪便隐血检测试剂盒中取样，在载玻片上涂布一层薄薄的粪便。每个样本均需使用新的取样棒。
   1. 盖上载玻片正面的盖子，打开背面的观察窗。在背面样本位置滴加两滴显色液。
   2. 30秒后读取结果。任何蓝色痕迹均提示隐血阳性。赋予0至4的评分（0：无；0.5–2.5：愈创木脂粪便隐血试验阳性（根据信号强度）；3–4：肉眼可见出血）。
      注：若粪便中可见血液，则无需进行愈创木脂粪便隐血试验，根据可见血液量直接赋予3、3.5或4分。
3. 通过观察新鲜粪便样本评估粪便性状。赋予0至4的评分（0：正常/成形；0.5–2.5：糊状便；3–4：腹泻）。

4. 测定肠道上皮通透性 在体 内 通过伊文思蓝测定法

1. 通过腹腔注射将氯胺酮（100 mg/kg 体重）和赛拉嗪（13 mg/kg 体重）溶于生理盐水（0.9% NaCl）的混合液使动物麻醉，并通过监测夹捏回缩反射评估麻醉深度。
2. 将麻醉后的动物置于仰卧位，进行剖腹手术以暴露肠道。
3. 找到盲肠，并在结肠近端部位做一个小切口 上升 （理想情况下，紧邻盲肠）。
4. 插入喂养针（G22），并用普通丝线结扎固定。通过导管小心灌注大量PBS，冲洗结肠内所有粪便。将伊文思蓝溶液（1.5% w/v，溶于PBS）注入结肠，直至溶液到达肛门。
5. 将伊文思蓝孵育15分钟。用大量PBS冲洗管道，直至肛周冲洗液澄清，以洗去染料。
6. 通过颈椎脱位处死动物。
7. 切除结肠，并用大量 PBS 再次冲洗。用 1 mL 6 mM PBS 冲洗一次 N用 PBS 中的乙酰半胱氨酸去除附着在结肠黏液上的染料。
8. 沿纵轴切开结肠，再用 PBS 和 1 mL 6 mM 的溶液冲洗一次 N乙酰半胱氨酸
9. 记录重量和长度。为了提取伊文思蓝染料，将结肠置于 2 mL 的 N,N在室温下轻轻振荡孵育二甲基甲酰胺过夜。在610 nm处通过分光光度法测定染料浓度。

5. 组织采集

1. 通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg 体重）和赛拉嗪（13 mg/kg 体重）的生理盐水（0.9% NaCl）稀释混合液使动物麻醉，并通过监测夹捏回缩反射评估麻醉深度。
2. 采用颈椎脱位法处死动物。
3. 将动物置于仰卧位，进行剖腹手术以暴露腹腔。
4. 使用剪刀完整解剖结肠，并记录其长度。
5. 用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）反复冲洗结肠数次，以清除粪便。记录组织重量，并按步骤 5.6 - 5.8 所述准备后续实验。
6. 用于RNA提取和髓过氧化物酶（MPO）检测时，切取适当大小的组织样本（通常100 mg已足够），放入试管中，并在液氮中速冻。将组织样本于-80 °C保存以供后续使用。
7. 用于免疫荧光染色和氧化应激检测（见下文）时，切取一小段结肠样本（0.5 - 1 cm），将其浸入装有最佳切割温度（OCT）包埋剂的小型铝杯中。将铝杯置于干冰上，使其缓慢冷冻，以避免气泡形成。冷冻的组织样本可于-80 °C保存以供后续使用。
8. 用于制作瑞士卷¹⁴时，沿纵轴切开结肠，并用镊子小心清除粪便。使用尖头镊子或细圆木棒将结肠卷起，使黏膜面朝向内侧。小心将其放入包埋盒中，然后继续进行步骤 6.1。
   注意：DSS可诱导结肠损伤。然而，损伤分布从近端到远端结肠有所不同，通常在远端结肠和直肠观察到的损伤最为明显。因此，我们建议对远端结肠或整个结肠的瑞士卷样本进行组织学分析。

6. 苏木精-伊红染色法分析结肠组织学

1. 组织制备
   1. 进行组织学分析时，将对照组和处理组小鼠结肠特定区域的瑞士卷或小块组织浸入5 mL 10%甲醛溶液中，在室温（RT）下固定48小时，以实现充分固定。
      注意：第6步中的所有后续操作均在室温下进行，除非另有说明。
   2. 用自来水冲洗18小时。
   3. 依次用15 mL 70%乙醇脱水1小时、96%乙醇1小时、无水乙醇1小时。每次更换新试剂后再进行下一浓度步骤。
   4. 继续用7.5 mL无水乙醇与7.5 mL无水二甲苯的混合液处理1小时，重复一次；然后将样本转移至15 mL无水二甲苯中处理1小时，此步骤再用新鲜二甲苯重复一次。
2. 结肠组织样本的石蜡包埋
   1. 将样本浸入50 mL液态石蜡中17小时，重复一次，但仅处理3小时。
   2. 将样本置于立方体模具（塑料，方形，尺寸：22 × 22 × 22 mm）中，并加入810 mL液态石蜡。
   3. 在室温下静置24小时，使含结肠组织的石蜡完全凝固。
3. 使用切片机切割组织横切面
   1. 按照制造商说明书，使用切片机将结肠样本切成5 µm厚的切片。
   2. 将切下的组织片收集于含有0.3%明胶的水浴（1 L）中，以防止组织切片折叠。随后捞出组织切片并贴附于载玻片上。
4. 组织横切面的苏木精-伊红染色
   1. 将样本置于60 °C孵育箱中脱蜡18小时。操作时使用带手柄的玻璃载玻片架。
   2. 脱蜡后，将载玻片浸入70 mL无水二甲苯中5分钟，更换新鲜二甲苯后重复一次。
   3. 将样本转移至70 mL无水乙醇中1分钟，更换新鲜乙醇后重复一次。
   4. 将结肠组织样本在70 mL 96%乙醇中孵育1分钟，更换新鲜乙醇后重复一次。
   5. 用自来水冲洗样本两次，每次2秒。
   6. 将组织在Harris苏木精染液中孵育7分钟。
   7. 用自来水冲洗样本两次，每次2秒。
   8. 将样本在酸性乙醇（70 mL 70%乙醇加700 µL 1 M盐酸）中孵育7秒。
   9. 用自来水冲洗样本两次，每次2秒。
   10. 将组织样本在70 mL碳酸锂溶液（1 g碳酸锂溶于100 mL蒸馏水中）中孵育7秒。
   11. 用自来水冲洗样本两次，每次2秒。
   12. 将样本在70 mL 80%乙醇中孵育1分钟。
   13. 将样本转移至70 mL伊红-Y染液中15秒。
   14. 在70 mL 96%乙醇中孵育1分钟，更换新鲜乙醇后重复一次。
   15. 将组织样本在70 mL无水乙醇（绝对无水乙醇）中孵育1分钟，更换新鲜乙醇后重复一次。
   16. 将样本在70 mL由35 mL无水乙醇和35 mL无水二甲苯组成的混合液中孵育1分钟。
   17. 将样本转移至70 mL无水二甲苯中1分钟，随后在70 mL新鲜无水二甲苯中继续孵育5分钟，此步骤重复一次。
   18. 向结肠组织切片滴加80 µL合成树脂，加盖盖玻片，并在室温下干燥24小时。最后使用明场显微镜进行样本分析⁸。

7. 通过免疫荧光分析连接结构的组成

1. 按照步骤 5.7 所述方法制备组织，并使用冷冻切片机切割 8 µm 厚的横切面。
2. 用 -20 °C 的 96% 乙醇固定并通透结肠横切面，持续 20 分钟。
   注意：除非另有说明，后续所有孵育步骤均应在室温下于避光湿盒中进行，以防止样本干燥和荧光染料褪色。
3. 将样本空气干燥，然后用 1× PBS 每次 5 分钟，重复冲洗 3 次。
4. 将样本在封闭液（含 0.01% Tween 和 2% BSA 的 PBS）中孵育 2 小时。
5. 去除封闭液，并用含 0.01% Tween 的 PBS 洗涤 10 分钟。
6. 在此期间，将一抗用含 0.01% Tween 的 PBS 稀释至所需浓度。
7. 去除洗涤液，加入上一步配制的抗体溶液，在湿盒中 4 °C 过夜孵育。
8. 去除抗体溶液，用含 0.01% Tween 的 PBS 轻柔振荡洗涤 3 次，每次 5 分钟，再用去离子水洗涤一次，持续 10 分钟。
9. 在洗涤过程中，将荧光染料­标记的种属特异性二抗在 4 °C 下以 14,000 × g 离心 20 分钟。
10. 根据供应商说明，将无沉淀的二抗用含 0.01% Tween 的 PBS 稀释，加入样本并室温孵育 1 小时。
11. 重复步骤 7.8，并尽可能彻底地去除洗涤液。
12. 在载玻片上每个样本处滴加 4 µL 抗荧光淬灭剂。
13. 用盖玻片覆盖样本。
14. 空气干燥 1 小时。
15. 用指甲油封片。载玻片可于 -20 °C 保存，直至进一步分析。
16. 在共聚焦激光显微镜上进行分析⁸。

8. 通过溴化乙锭氧化测定氧化应激

1. 在DSS结肠炎造模7天后，按照步骤5.7所述方法制备组织，并在恒冷切片机中将结肠组织切成5 µm厚的切片。将横切面贴附于经多聚-L-赖氨酸溶液处理的载玻片上，加入5 µM二氢乙啶（DHE）水溶液，在37 °C避光孵育30分钟。
2. 用PBS（pH 7.6）在室温下轻轻振荡洗涤样品三次，每次15分钟。将样品自然晾干，滴加一滴封片剂以保护荧光信号。在激光共聚焦显微镜下观察氧化乙啶的荧光（40倍放大，激发波长568 nm）。

9. 通过MPO检测法分析白细胞募集

1. 在DSS结肠炎第7天时，采集结肠组织，取样品（200 - 400 mg）加入1 mL六甲基溴化铵（HTAB）缓冲液（含0.5% HTAB的50 mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0），在冰上使用匀浆器进行匀浆处理。
2. 用1 mL HTAB缓冲液冲洗匀浆器探头两次，以将所有组织纳入裂解液中，随后以40%振幅超声处理5次，每次10秒。在液氮中进行三次冻融循环。
3. 以14,000 × g离心15分钟，收集上清液。通过混合ABTS、5 mL柠檬酸钠溶液（1 M水溶液）、0.1 mL过氧化氢和45 mL双蒸水，配制2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）溶液。
4. 在96孔平底板中，将每份上清液0.1 mL与0.1 mL ABTS溶液混合。10分钟后，使用分光光度计在460 nm处测定吸光度。

10. 通过 PCR 评估促炎性细胞因子的表达

1. 组织匀浆
   1. 使用电动匀浆器，将50至100 mg结肠组织样本在1 mL酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿混合液中进行匀浆处理。
   2. 室温孵育15分钟。
2. 相分离
   1. 加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡30秒。
   2. 在4 °C下孵育30分钟。
   3. 在4 °C下以12,000 × g离心60分钟。
   4. 将上层水相转移至新管中（约500 µL）。
3. RNA沉淀与重悬
   1. 加入0.5 mL异丙醇，于4 °C孵育60分钟。
   2. 在4 °C下以12,000 × g离心30分钟。
   3. 完全去除上清液。
   4. 加入1 mL 75%乙醇，涡旋振荡。
   5. 在4 °C下以12,000 × g离心30分钟。
   6. 去除上清液。
   7. 让残留乙醇在空气中干燥3–5分钟。
      注意：切勿让RNA沉淀完全干燥，否则将显著降低其溶解度。
   8. 将沉淀溶解于0.3 mL焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水中。应立即进行RNA反转录为cDNA（更稳定，见步骤10.5），或于-80 °C保存。
4. RNA定量
   1. 取1 µL RNA与99 µL DEPC处理水稀释。
   2. 使用紫外/可见光分光光度计测定260 nm和280 nm处的光密度（OD），以确定样品浓度和纯度。
5. cDNA合成
   1. 在无RNase的无菌离心管中，将RNA样品（1–5 µg）与1 µL Oligo(dT)_12-18（0.5 µg/µL）及DEPC处理水混合，总体积为12 µL。
   2. 在70 °C孵育10分钟。
   3. 加入2 µL 10× PCR缓冲液、1 µL 50 mM MgCl₂、1 µL 10 mM dNTP混合物和2 µL 0.1 M二硫苏糖醇（DTT）。
   4. 在4 °C孵育5分钟。
   5. 加入1 µL逆转录酶，在42 °C孵育5分钟。
   6. 在70 °C孵育15分钟。
   7. 在4 °C孵育15分钟。cDNA可于-20 °C保存，待后续使用。
6. PCR
   1. 在总体积为25 µL的反应体系中，加入2.5 µL 10× PCR缓冲液、1.5 µL 25 mM MgCl₂、0.5 µL 10 mM dNTP混合物、0.25 µL Taq DNA聚合酶、每种引物（10 µM）各0.25 µL、cDNA（100 ng）以及无菌水。
   2. 将样品置于96孔PCR仪中运行。为避免基因组DNA扩增，上下游引物应位于不同外显子上：IL1β-FW: GCAACTGTTCCTGAACTCAACT 和 IL1β-RE: TCTTTTGGGGTCCGTCAACT；IL6-FW: CCTTCCTACCCCAATTTCCAA 和 IL6-RE: AGATGAATTGGATGGTCTTGGTC；KC-FW: TGTCAGTGCCTGCAGACCAT 和 KC-RE: CCTGAGGGCAACACCTTCA；以及 Actin-FW: TATCCACCTTCCAGCAGATGT 和 Actin-RE: AGCTCAGTAACAGTCCGCCTA。PCR程序如下：95 °C预变性5分钟，随后进行30个循环（95 °C变性15秒，58 °C退火30秒，72 °C延伸30秒），最后在72 °C延伸10分钟。

结果

膳食补充剂可预防DSS结肠炎

抗炎和抗氧化饮食补充剂，如维生素C、维生素E、一氧化氮（NO）前体L-精氨酸，以及 ω3-多不饱和脂肪酸（ω3-PUFAs）已在动物模型中以不同的效果用于缓解炎症性疾病的症状^3,6,15营养不良、氧化应激以及促炎性细胞因子的产生均可诱发急性和慢性结肠炎³在之前的一项研究中，我们证实多种微量营养素的组合对DSS诱导的结肠炎具有保护作用 体内在此，我们提供了测量这些效应的详细方案⁸首先，我们通过测定疾病活动指数（DAI）来分析营养补充剂对疾病进展的影响，DAI包括体重减轻、粪便性状和肛周出血三个参数。代表性结果显示，DSS处理导致DAI持续升高，符合预期，最高达到8.2 ± 第7天为0.46（图1A）。抗炎饮食补充延缓了结肠炎的发生，但在后期时间点，当结肠炎已非常严重时，其保护作用微弱且...

讨论

为了在临床研究中使用营养补充剂，必须通过动物实验仔细评估这些补充剂的益处和安全性in vivo。对于结肠炎，已有多种可模拟炎症性肠病（IBD）临床症状的合适动物模型被建立，包括使用DSS、TNBS或乙酸的化学诱导模型；如IL10-KO等基因敲除（KO）模型；以及通过过继性T细胞转移介导的免疫细胞型结肠炎模型^19-21。DSS诱导的结肠炎模型是一种快速且可靠的结肠炎诱导方法，其表现出许多与人类IBD相似的疾病症状，已被广泛应用于探究结肠炎分子机制的大量研究中²²。此外，DSS诱导的结肠炎具有可逆性，因此也可用于研究在致结肠炎刺激消除后组织的修复过程。本方案详细描述了我们实验室先前已优化的DSS结肠炎模型⁸。

一个缺点是，由于环境因素会极大地影响疾病的发展和进程²³，因此必须在每个实验室中优化DSS的浓度。此外，DSS的分子量必须在40 - 50 kDa范围内才能诱导结肠炎。对于缺乏经验的研究人员而言，准确无偏地评估粪便性状和肛周出血等DAI参数至关重要。如果评估由缺乏经验的研究人...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.3% 明胶	Bioxon	158
10% 甲醛	J.T. Baker	2106-03
平底96孔板	Corning	3368
无水乙醇	J.T. Baker	9000-03
无水二甲苯	J.T. Baker	9490-03
ABTS	Sigma Aldrich	H5882
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	9048-46-8
ColoScreen	Helena Laboratories	5072
Corabion（由墨西哥瑙卡尔潘Merck公司友情提供）	Merck
硫酸葡聚糖钠盐	Affymetrix	9011-18-1	(分子量 40,000-50,000)
二氢乙啶	Life Technology	D11347
伊红-Y	J.T. Baker	L087-03
伊文思蓝	Sigma-Aldrich	314-13-6
饲喂 针头	Cadence Science Inc.	9921
带手柄玻璃载片架	Electron Microscopy	70312-16
玻璃载片	Corning	2947
哈里斯苏木精	Sigma-Aldrich	H3136
十六烷基三甲基溴化铵（HTAB）	Sigma Aldrich	H6269
组织包埋盒（Histosette）	Simport	M498.2
1 M 盐酸	J.T. Baker	9535-62
过氧化氢	Sigma Aldrich	H3410
氯胺酮	PiSA Agropecuaria	Q-7833-028
液体石蜡	Paraplast	39501-006
碳酸锂	Sigma-Aldrich	2362
N,N-二甲基甲酰胺	J.T. Baker	68-12-2
N-乙酰半胱氨酸	Sigma-Aldrich	A9165
塑料模具	Electron Microscopy	70181
聚-L-赖氨酸溶液	Sigma-Aldrich	25988-63-0
Prism 5 统计分析软件	GraphPad Software	Prism 5
0.9% NaCl 生理盐水	CS PiSA	Q-7833-009
柠檬酸钠	Sigma-Aldrich	W302600
合成树脂	Poly Mont	7987
Taq DNA 聚合酶	Invitrogen	11615-010
Tissue-tek O.C.T. 包埋剂	Sakura Finetek	4583
结核菌素注射器	BD Plastipak	305945
吐温20	Sigma-Aldrich	9005-64-5
含DAPI的VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1200
赛拉嗪	PiSA Agropecuaria	Q-7833-099