小鼠全层皮肤移植

摘要

小鼠全层皮肤移植是一种研究同种免疫环境下排斥反应的成熟模型。本文中，我们将详细介绍进行BALB/c-->C57BL/6全层皮肤移植的每一步操作流程。

摘要

小鼠全层皮肤移植是一种成熟的体内模型，用于研究同种免疫反应和移植物排斥。尽管其在人类中的应用有限，小鼠皮肤移植已广泛应用于移植研究。该操作易于学习和实施，无需精细的显微外科技术或长期培训。此外，该模型中的移植物排斥表现为高度可重复的免疫反应，可通过直接观察和触诊轻松监测。另外，在更复杂的移植模型中，可通过供体匹配或第三方皮肤移植物进行二次皮肤移植，作为评估供体特异性耐受性的替代且简便的方法。该操作的并发症较少，通常仅限于麻醉过量或术后呼吸困难。而移植物失败则较为常见，通常由移植物制备不佳、在移植床中位置不当或敷料放置不当所致。本文介绍了一种小鼠全层皮肤移植的实验方案，并详细描述了确保手术成功的关键步骤。

引言

器官移植是终末期器官衰竭患者的首选治疗方法，随着外科手术和免疫抑制方案的进步，移植预后已显著改善。然而，长期免疫抑制伴随明显的副作用，因此建立促进免疫耐受的新策略仍是现代移植研究的目标。

为了开展移植领域的基础研究，探索同种异体移植物排斥反应的机制，并测试预防移植物排斥和促进长期耐受的免疫抑制策略，人们已开发出多种动物模型^1-3。由于小鼠具有种类丰富且特异性明确的诊断与治疗用抗体，以及大量遗传背景清晰的近交系和转基因品系，已成为免疫学研究的主要模型。皮肤移植操作简便，无需特殊的显微外科技术，且术后易于观察。综上所述，小鼠皮肤移植已成为研究同种免疫反应多个方面的理想工具，包括抗原呈递、细胞迁移以及移植物排斥过程中的组织破坏等环节^4,5。

本文展示了利用小鼠模型进行全层皮肤移植的逐步操作流程，并描述了确保移植皮肤成功植入所必需的关键步骤。

方案

所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》的规定，并经约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会（JHUACUC）批准。具体操作依据批准的ACUC方案MO13M292和MO13M370进行。

1. 供体皮肤采集

1. 使用异氟烷麻醉供体小鼠（诱导时挥发器浓度设为4%，通过小鼠麻醉面罩维持1-2%的浓度）。通过脚趾夹捏回缩反射监测麻醉深度。
2. 使用电动剃刀剃除动物背部毛发，并用10%聚维酮碘（例如，贝塔碘）进行消毒。
3. 使用无菌剪刀、手套及无菌操作技术，从髋部至颈部取下供体背部皮肤，在疏松结缔组织层面进行钝性分离。
4. 获取皮肤移植物后，通过颈椎脱位法处死动物。
5. 在显微镜下，使用精细的肌腱切断剪刀将结缔组织、脂肪组织和肉膜肌（panniculus carnosus）从背部皮肤上分离。肉膜肌是一层薄而透明的肌肉，负责皮肤的抽动运动。
6. 采用无菌器械操作技术，从背部皮肤上切取适用于10 mm × 10 mm至15 mm × 15 mm移植床的15 mm × 15 mm移植物。
7. 将移植物置于浸有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的纱布上，放入培养皿中并置于冰上保存。
   注：一只供体小鼠可获取8–10个移植物。

2. 受体皮肤移植

1. 使用异氟烷麻醉受体小鼠（通过小鼠麻醉面罩，诱导浓度为4%，维持浓度为1%–2%）。通过脚趾夹捏回缩反射监测麻醉深度。
2. 给予0.02 mg/kg体重的丁丙诺啡，用于术后镇痛。
3. 剃除将要植入移植物部位的小鼠背部侧面毛发，并用10%聚维酮碘进行消毒。
4. 使用剪刀剪去一块10 mm × 10 mm至15 mm × 15 mm的方形皮肤。缺损面积应比移植物略大（约10%）。切割时尽可能表浅，注意保留肉膜（panniculus carnosus）及其表面的血管。肉膜可通过其可动性以及其表面走行的血管与深层筋膜相区分。
5. 将移植物放置于移植物床中，避免边缘出现皱褶。
6. 在四个角及每条边的中点处各放置一针缝线。每针缝合时，先将针穿过移植物，再穿过移植物床下方受体周围皮肤下的肉膜。
7. 移除麻醉面罩，在应用粘性绷带前让动物部分恢复清醒。
8. 用粘性绷带包裹受体小鼠，并在移植物上方覆盖折叠的纱布。制作绷带时可将两个绷带组合，剪去其中一个的粘性部分，并将两个吸收垫并置在一起。
9. 在恢复期间密切监测小鼠，确保绷带未限制胸廓扩张和呼吸。若呼吸频率下降，或动物出现喘息或浅呼吸，应立即移除绷带。

3. 术后护理

1. 术后给予恩诺沙星 5 mg/kg 以预防感染。
2. 将移植后的小鼠置于清洁笼盒中，并放置在可微波加热的加热垫上 ，直至其完全从麻醉中恢复。
3. 术后观察小鼠 1 小时，然后将其送回饲养设施。
4. 术后第 7 天，按照步骤 2.1 的方法麻醉小鼠，仅剪开绷带的腹侧部分以拆除绷带。
5. 次日观察并触诊移植物，检查是否有结痂、收缩或硬化等迹象。若出现上述情况，表明移植物可能未实现充分血管化，应视为技术失败。
6. 每日监测排斥反应迹象。当移植物组织坏死面积 ≥90% 时，判定为排斥。
7. 对发生排斥的动物实施安乐死，并采集用于分析。

结果

将绷带放置在受体小鼠身上是该操作中的关键步骤。皮肤移植物应置于受体躯干上，位于肩部、髋部与脊柱之间（图1）。绷带由折叠的纱布及两片塑料粘性绷带组合而成。将受体小鼠移植物朝下放置于绷带中央的纱布上。使用两把弯头显微镊，先拉紧绷带的下端，再将上端绕过小鼠背部覆盖至腹部。

在完全不匹配模型中，全层皮肤移植物通常在8至12天内被排斥。在轻微不匹配模型中，排斥反应较慢，变异较大，皮肤移植物的外观变化不明显，例如收缩或脱毛（图2）。急性移植物排斥通常始于移植物的肿胀和红斑。随后出现移植物干燥、收缩和结痂（图2B 和 C）。根据MHC不匹配程度和免疫抑制方案的不同，排斥也可能通过亚急性过程发生，表现为细微变化，如脱毛、色素沉着、真皮脊消失以及移植物体积减小。在这些情况下，被排斥的移植物呈现发亮、苍白、无毛且边缘不规则的外观（

讨论

自Medawar首次在人类研究中引入皮肤移植，随后在兔子和小鼠中应用以来，皮肤移植已成为研究同种异体免疫反应的宝贵模型^6,7。在本论文中，我们介绍了一种利用背部上下区域皮肤进行的大规模、非血管化全层皮肤移植模型。迄今为止，已有多种替代方法被报道，包括使用小鼠尾部皮肤或耳部皮肤作为移植物来源^8,9。这些模型具有操作简便的显著优势，适用于高通量实验。然而，尾部皮肤移植物中表皮朗格汉斯细胞和真皮树突状细胞相对缺乏，会导致排斥反应延迟，并促进宿主对移植物的接受，尤其在主要组织相容性复合体（MHC）轻度不匹配模型中更为明显^10,11。因此，全层躯干皮肤移植被认为是一种更为可靠的模型，更适合用于研究T细胞介导的急性排斥反应¹²。

此外，我们的模型采用简单的技术，无需高级的显微外科技能。手术时间较短（每只小鼠从麻醉开始到手术结束约10分钟），术后发病率和死亡率极低。总体手术死亡率（术后24小时内死亡以及拆除绷带前死亡）据报道为3.8%¹³。大多数并发症源于麻醉过量或包扎过紧，通过在术后即...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
直显微镊	Sigma	F4017
弯显微镊	Aesculap	BD333R
弯Stevens肌腱剪	Aesculap	BC905R
梅奥组织剪	Sigma	S3146
显微持针器	Aesculap	BM563R
无菌纱布	Covidien	441218
6-0尼龙缝线	MWI	31849
塑料条创可贴-Aid	Johnson & Johnson		从药房获取
10 cm培养皿	Fisherbrand	FB0875712
PBS	Quality Biological	119069131
丁丙诺啡			需持有美国药品执法局编号（DEA Number）；从医院药房获取
恩诺沙星	Bayer Health Care	186599