本文描述了一种利用比率荧光指示剂S-1（seminaphthorhodafluor，SNARF-1）来测量人和小鼠中性粒细胞吞噬体pH值与面积以及细胞质pH值的简单方法。该方法通过活细胞共聚焦荧光显微镜结合图像分析实现。
本文内容
摘要
摘要
中性粒细胞在宿主先天免疫防御中至关重要，因此成为医学研究的重要领域。吞噬体是细胞内杀灭和消化被吞噬颗粒的主要场所，也是中性粒细胞杀灭病原体的核心区域，其功能需要精密调控。其中，吞噬体的pH值受到严格控制，进而调节抗菌蛋白酶的活性。已有多种荧光pH敏感性染料被用于可视化吞噬体微环境。S-1染料相较于其他pH敏感性染料具有多项优势，包括双发射光谱、抗光漂白性强以及较高的pKa值。利用该方法，我们已证明与其他吞噬细胞相比，中性粒细胞的吞噬体异常偏碱性。通过将该染料与不同生化分子偶联，可将吞噬体与细胞质区分开来，从而评估吞噬体大小和形态的变化。这为进一步监测离子移动提供了可能。
引言
中性粒细胞是体内数量最多的天然免疫细胞。其主要功能是在血液中巡逻，并通过一种称为吞噬作用的过程，吞噬和消化其所遇到的外来颗粒1,2。这些颗粒在细胞内一个称为吞噬体的区室中被降解。中性粒细胞NADPH氧化酶（即NOX2亚型）的激活会启动一系列生化反应，最终导致病原体死亡。NOX2蛋白亚基随后在吞噬体膜上形成电子传递链复合物3。一旦被激活，该复合物便将电子从NADPH跨膜传递至吞噬体内的分子氧，生成超氧阴离子及其他活性氧物质。这一过程被称为呼吸爆发，被认为对高效杀灭和消化微生物至关重要2。然而，若无正电荷进入和/或负电荷离开吞噬体来加以补偿，这种跨膜的负电荷单向移动将很快使NOX2失活。已有充分证据表明，中性粒细胞中大部分的电荷补偿是由质子通道HVCN1完成的4,5。该通道允许质子顺其电化学梯度从细胞质被动进入吞噬体。质子浓度由pH值反映，因此在特定氧化酶活性水平下，测量吞噬体内的pH值可提供有关质子性与非质子性途径在电荷补偿中相对贡献的信息。
人中性粒细胞吞噬体在吞噬作用后约20-30分钟内具有约8.5的碱性pH值5。这表明在NOX2介导的电荷补偿过程中，除质子通道外还存在其他非质子离子通道，因为若仅依赖酸性颗粒的融合与内容物释放以及HVCN1的单独补偿作用，则应维持酸性环境，与实际观察结果相反。为补偿这种负电荷而发生的离子移动也可能通过渗透作用引起吞噬体体积的变化。这些离子可能是中性粒细胞内生理浓度较高的离子：已有研究显示钾离子可进入吞噬体6，而氯离子的移动则是另一种对中性粒细胞功能重要的候选机制7。
吞噬体内的pH调节对抗菌蛋白酶的活性至关重要5。髓过氧化物酶（MPO）在pH 6时表现出最佳活性，而组织蛋白酶G和弹性蛋白酶的最适pH范围分别为pH 7-9和pH 8-105。因此，吞噬体内pH的短暂变化可能为不同酶的功能发挥提供适宜的活性微环境。深入了解pH在中性粒细胞杀灭微生物过程中的作用，可能为设计新型增强中性粒细胞功能的抗菌剂提供有价值的信息。
中性粒细胞吞噬体是一个高度反应性的环境，这使得准确测定其pH值变得困难，因为染料可能容易被氧化，从而导致技术性假象。传统上，异硫氰酸荧光素（FITC）一直是用于测量细胞内pH值的首选染料8,9。然而，FITC在测定中性粒细胞吞噬体pH值时存在一些缺点。其pKa为6.410，意味着它仅能准确用于评估pH值在5至7.5范围内的变化8，因为在pH < 8时即达到饱和11。由于中性粒细胞吞噬体的pH值可能变得更为碱性5，FITC无法捕捉到pH变化的全部范围。另一个在中性粒细胞背景下使用FITC的重要问题是，它被认为会被髓过氧化物酶（MPO）漂白12。MPO抑制剂叠氮化钠可用于减少漂白作用13，但已有研究表明，叠氮化钠会以不依赖MPO的方式直接降低吞噬体pH值，因此不适合用于此类检测5。
与其他细胞内染料相比，S-1 具有相对较高的 pKa 值（7.5）10。在酸性条件下，该分子发生质子化，当以 488 nm 或更高波长激发时，在 560 至 600 nm 范围内产生发射信号。当分子在更偏碱性的条件下去质子化时，发射波长则超过 600 nm。这两个波长处荧光强度的比值可反映发射波长的偏移，该比值测量比单一荧光强度测量更可靠，因为它不受荧光探针浓度和细胞结构的影响。S-1 可与抗原性物质（如酵母聚糖14）偶联，但更优选使用热灭活的（HK）Candida albicans，因其具有更大的表面积，可获得更一致的荧光读数。
我们还对该方法进行了改进，用于研究pH值的时程变化（图3）5。这种细胞质pH值的测定方法可轻松应用于其他细胞类型，正如其他文献所述15,16，也可用于具有更偏碱性吞噬体的细胞14。
方案
伦理声明：所有动物实验均在英国政府内政部的许可和批准下进行。本研究中的人类参与者研究已获得伦敦大学学院（UCL）与UCL医院联合人类研究伦理委员会的批准。所有参与者均提供了知情同意书。
1. 准备 C. albicans
- 根据制造商说明，在YPD琼脂平板上培养一株 Candida 菌环（见材料列表）。挑取单菌落并接种至15 mL YPD液体培养基中。在30 °C、200 rpm条件下于摇床中孵育，直至培养液变浑浊（通常约需2天，或达到浓度约超过1 x 109/mL）。
- 将 Candida 培养液离心，弃上清，用50 mL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬菌体。在3,000 × g条件下离心10分钟。重复此步骤两次。
- 将含有50 mL PBS/Candida 培养液的离心管置于预热至60 °C的水浴中，确保整个离心管完全浸没，持续1小时。
- 为确认 Candida 已完全热灭活，取少量样品划线接种于YPD琼脂平板，于30 °C过夜培养。根据 Candida 生长情况，将热灭活（HK）Candida 的浓度调整为5–9 × 108/mL，并以1 mL分装保存于-20 °C冰箱中。
注意：本实验方案中的所有细胞计数均使用自动细胞计数仪完成。
- 为确认 Candida 已完全热灭活，取少量样品划线接种于YPD琼脂平板，于30 °C过夜培养。根据 Candida 生长情况，将热灭活（HK）Candida 的浓度调整为5–9 × 108/mL，并以1 mL分装保存于-20 °C冰箱中。
2. S-1 与热灭活的 Candida（HK）偶联
- 将羧基-S-1 琥珀酰亚胺酯（50 µg）用 100 µL 高纯度二甲基亚砜（DMSO）溶解，配制成一份 aliquot。充分涡旋混匀。
- 制备1 mL浓度为1 × 10⁶的细胞悬液8 HK 假丝酵母 在15 mL离心管中加入0.1 M碳酸氢钠（pH 8.3）。
- 逐滴加入100 µL羧基-S-1至HK中 假丝酵母 在约2,000 rpm（中高速）下涡旋混匀。用铝箔包裹试管，室温下置于滚轴上孵育1小时。
- 洗涤 HK 白色念珠菌-S-1(HKC-S-1) 三次，每次在 2,250 × g 离心 10 分钟。前两次洗涤中，将沉淀重悬于 15 mL 0.1 M 碳酸氢钠（pH 8.3）中。第三次洗涤后，将其重悬于 1 mL 平衡盐溶液（BSS）缓冲液中（见 表1).
- 将HKC-S-1悬液以100 µL等分试样转移至离心管中，并于-20 °C保存。
注意：如果可能，使用低吸附表面材料的离心管，因为HKC-S-1颗粒可能会粘附在普通离心管管壁上。 - 调理HKC-S-1
- 对于人中性粒细胞，将100 µL人IgG血清加入100 µL解冻的HKC-S-1中。
- 对于小鼠中性粒细胞，加入 50 µL 正常小鼠血清和 50 µL 小鼠 假丝酵母 免疫血清（由注射了HK的C57B6小鼠产生） 假丝酵母)5 至100 µL的HKC-S-1。
- 在37 °C、1,100 rpm条件下于加热振荡器中混合60-90分钟，随后在4 °C滚轴混合仪上混合2小时。
- 以17,200 × g离心1分钟，用BSS缓冲液洗涤三次。用100 µL BSS缓冲液重悬。
3. 中性粒细胞的分离
- 对于人外周血中性粒细胞，从健康供体通过静脉穿刺采集15 mL血液，并将其注入含有90 µL 1,000 IU/mL肝素钠溶液的20 mL注射器中（即每10 mL血液加入60 µL肝素）。
- 使用移液器吸头，向注射器中注入1.5 mL 10%右旋糖酐溶液。轻轻倒置3次，然后直立静置于实验台上。
- 静置30–60分钟，直至血液大致分为两层：上层为淡黄色的白膜层，下层为含有红细胞的红色层。
- 小心通过针头推出上层液体，或用移液器吸头将其移除，收集至15 mL离心管中。注意避免吸取下层红色部分。使用5 mL移液器，将3–4 mL密度梯度介质（见材料列表）沿管壁缓慢加入离心管底部，使白膜层位于上层，形成清晰的两层液体。在913 × g条件下离心10分钟。
注意：若使用小鼠中性粒细胞（参见参考文献17中小鼠中性粒细胞分离方法），则使用从骨髓中冲洗获得的细胞悬液代替。 - 弃去上清液，保留底部红色沉淀。轻轻涡旋震荡以重悬沉淀。向沉淀中加入7 mL蒸馏并经高压灭菌的H2O，倒置混匀20秒。随后加入7 mL 2倍浓度的生理盐水，轻轻倒置数次混匀，以裂解残留的红细胞。
- 在300 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于BSS缓冲液中，细胞浓度调整至约4 × 106/mL。
注意：为获得最佳细胞显微观察效果，建议将细胞悬液浓度维持在1.5–6 × 106/mL之间。
4. 载玻片的制备
- 用200 µL聚-L-赖氨酸（0.01%溶液）预处理8孔显微镜培养板（见材料列表），每孔加液，室温孵育40–60分钟。
- 移除聚-L-赖氨酸（可重复使用），并用 200 µL 蒸馏水洗涤孔板两次2O.
- 向每个孔中加入200 µL步骤3.6中制备的细胞悬液。室温孵育30-60分钟。
- 取一支试管，加入100 µL高纯度DMSO，配制5-(和-6)-羧基S-1乙酰氧基甲基（S-1-AM）酯（50 µg）的 aliquot。涡旋混匀。不使用时，于-20 °C保存。
- 在小型离心管中，加入 1.7 mL BSS 缓冲液和 20 µL S-1-AM，涡旋混匀。
- 用 200 µL BSS 缓冲液洗涤孔板两次，然后将缓冲液替换为 S-1-AM 溶液。加样时应沿孔壁轻轻吹打，避免扰动贴附在孔底的单层细胞。室温孵育至少 25 分钟。
- 用 200 µL BSS 缓冲液洗涤各孔两次。若需检测抑制剂，配制一种 "预混液" 用适当药物的BSS缓冲液处理。用抑制剂溶液洗涤孔板两次。
注意：务必使用相同量的药物溶剂（例如， DMSO 或乙醇）与抑制剂所用的相同。若检测氯化锌的作用，则使用不含 KH 的 BSS 缓冲液2PO4 （HEPES 可单独缓冲该溶液），因为锌会与磷酸盐形成沉淀。 - 将已调理的HKC-S-1（第6.2节）在5 µm振幅下超声处理约3秒。每孔加入10 µL。于37 °C孵育15–20分钟，以允许吞噬作用进行，使细胞处于适合拍摄吞噬过程快照的成像状态。
5. 共聚焦显微镜
- 使用共聚焦显微镜，调节激光波长，使细胞在 555 nm 处被激发，并通过两个通道或检测器检测发射光：560–600 nm 和超过 600 nm。
注意：具体显微镜参数因设备而异，需由研究人员进行优化。 - 使用油镜（63X 物镜）观察细胞。采用连续模式下的拼图扫描（tile-scan）成像方式观察中心图块。根据荧光强度及检测器通道的增益，调节激光的聚焦、激光强度以及两个通道的增益，以优化图像质量。
- 使用设置将图像拆分为两个通道进行观察；检查细胞质或液泡中的荧光强度是否出现饱和。饱和区域会显示为红色斑点。降低激光强度，使红色斑点数量尽可能减少，同时确保细胞和吞噬体足够明亮，能够清晰可见。
- 当图像满意后，点击 "开始实验"。系统将生成一幅包含 9 个图块的扫描图像。将图像保存为软件推荐的复合文件格式（包含两个通道的合成图像），不要使用 jpeg 或 tiff 格式。
6. 校准实验
- 单独使用Candida构建pH标准曲线。
- 按照表1配制pH 3.0至13.0的缓冲液。
- 取一份HKC-S-1样品（100 µL），在17,200 × g下离心1分钟，沉淀重悬于500 µL指定缓冲液中。
- 从最低pH范围开始，将上述悬液加入一个预处理过的孔（步骤4.2）中，将载玻片置于设定为37 °C的加热载物台上进行共聚焦显微镜观察。
- 每分钟记录一次荧光信号，持续10分钟。对每种缓冲液重复此操作。
- 皂苷标准曲线。
- 分离1 × 107个人类中性粒细胞5，并将其重悬于1 mL最低pH的缓冲液中。
- 按照第4节所述方法测定中性粒细胞吞噬体内的pH值。
- 与Candida悬液孵育20分钟后，向培养皿中加入0.3%皂苷（将15 µL 10%储备液加入一个预处理过的孔（步骤4.2）），随后在37 °C下孵育20分钟。每分钟采集一次图像，持续10分钟。对每种缓冲液重复此操作。
- 采用高K+/尼日利亚菌素法构建胞质pH标准曲线5,18,19。
- 按照表1配制pH 4.0至13.0的缓冲液。
- 按照步骤4.1–4.7操作，仅将中性粒细胞置于预处理过的孔中——每个孔使用不同缓冲液。将载玻片置于37 °C加热载物台上，每分钟记录一次荧光信号，持续10分钟。
- 注意：胞质pH与外部溶液达到平衡可能需要一定时间，但在此之后，S-1比值将保持恒定。在每次实验中测量细胞外HKC-S-1的信号可作为对照，以确认所加入的抑制剂不会干扰S-1荧光发射或影响缓冲液的pH值。
7. 图像分析
注意：此处提供了使用免费软件 ImageJ 进行图像分析（荧光定量）的操作说明。建议使用 ImageJ。
- 根据开发者说明下载并安装 ImageJ 版本 >1.46r（https://imagej.nih.gov/ij/）。安装本实验方案附带的补充代码文件“Phagosomal measurement”。
- 打开 ImageJ，将选定用于分析的图像文件加载到工具栏中。为合并两个通道，请使用 Image>Color>Make Composite。
- 右键单击以选择用于存储结果的文件。
- 单击工具栏上的直线工具，然后双击将线宽增加至 "2."
- 在吞噬体的宽度方向上画一条直线，然后右键单击以"测量 pH"。两个通道的平均强度将被获取，并由 ImageJ 中的代码文件自动计算其比值。
- 完成测量后，右键单击以选择"保存文件"。
- 为测量吞噬体面积，使用工具栏上第四个图标，手动围绕目标区域绘制轮廓。右键单击以选择"测量面积"。
注：结果将被保存，并在所选目录中生成日志文件。可使用电子表格软件、R 或等效软件对结果进行后续处理。荧光比值与 pH 之间的关系大致呈 S 形，ImageJ 分析生成的比值可通过广义逻辑函数（logistic 或 sigmoid 函数）或线性或三次样条插值转换为 pH 值。 - 为测量细胞质 pH，跨细胞质画一条直线，然后右键单击“测量 pH”。
结果
图1展示了不同来源的中性粒细胞的图像快照，用以展示不同吞噬体微环境的差异。为了便于进行定量分析，以适当数量的细胞接种孔板至关重要：细胞过多会导致细胞相互重叠，难以准确观察被包裹的吞噬体；细胞过少则显然会减少有效数据量，尤其并非每个中性粒细胞都会发生吞噬作用。图2是一张过度饱和的图像；可通过使用材料列表中推荐的显微镜软件或等效软件将图像按两个通道拆分来评估——红色点表示检测到最大荧光信号的位置。可通过降低激光强度来避免此问题。图3展示了使用不同缓冲体系的校准曲线，改编自Levine et al.5。误差线表明多次测量间的荧光信号存在一定变异。图4展示了吞噬体pH值和面积数据的一种呈现方式。该方法可显示每个单独测量值，并叠加箱形图。然而，这些数据也可用直方图柱状图来展示。
图1：人类和小鼠中性粒细胞的代表性显微图像。最右侧为S-1染色吞噬体颜色与对应pH值的定性视觉参考。黄色表示酸性更强，而红色表示碱性更强。（A）显示Hvcn1-/-小鼠骨髓中性粒细胞在吞噬作用发生20分钟后的情况。吞噬体呈现明显的红色、碱性且肿胀。图像右下角的红色箭头指向一个细胞内的Candida，左上角的箭头指向一个细胞外颗粒。（B）显示野生型小鼠骨髓中性粒细胞吞噬Candida后的状态；其碱性程度明显低于Hvcn1-/-细胞。（C）显示人类外周血中性粒细胞在相同时间点的吞噬后状态。其碱性略高于野生型小鼠细胞，但吞噬体的大小和红色程度仍不及Hvcn1-/-细胞。（D）显示人类中性粒细胞在5 µM二苯基碘𬭩（DPI）存在下吞噬Candida的情况。所有吞噬体均呈强酸性，pH为6或更低；该药物抑制NADPH氧化酶，因此无补偿性离子移动。酸性颗粒与吞噬体融合后释放的质子导致吞噬体内pH降低20，同时DPI处理可增强V-ATP酶在吞噬体膜上的募集9。与其他条件相比，细胞质也显得更偏碱性。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：Hvcn1-/- 小鼠骨髓中性粒细胞的荧光过饱和现象。在分析过程中，必须排除荧光信号过饱和的图像。如第5.3节所述，复合图像被拆分为两幅独立显示各通道的图像（左上，红色箭头）。在该软件中，需启用范围指示器（左下，红色箭头），此时任何过饱和的像素将显示为亮红色。两个通道（通道1和通道2）均存在过饱和现象。右下角展示了部分细胞和细胞外Candida的放大图像，箭头指向受影响区域。若对这些区域进行分析，将导致错误的比率测量结果。请点击此处查看该图的高清版本。
图 3：将 S-1 荧光比值转换为 pH 测量值的标准校准曲线。单独 Candida 在不同缓冲液（标记为“Tris”）中的标准曲线，以及细胞经皂苷处理通透化后（“Saponin”）的标准曲线非常相似，表明细胞内外（吞噬体与细胞外环境）的 S-1 读数具有可比性。误差棒表示均值 ± 标准差（SD）。在细胞质（“Cytoplasm”）中测定时，S-1 比值/pH 曲线变短，图像分析时应考虑此因素。本图经 Levine et al.5 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：吞噬体 pH 值与面积的定量分析。本图展示了一个数据呈现示例，图表使用编程软件 R 生成。A：显示 Hvcn1-/- 小鼠骨髓中性粒细胞的吞噬体比值及其对应的 pH 值；B：野生型小鼠骨髓中性粒细胞；C：人外周血中性粒细胞；D：经 5 µM DPI 处理的人中性粒细胞（n = 3/300）。单个测量值以小方块表示，并叠加显示中位数和四分位间距的箱形图，红线表示均值。如 图 1 所示，与野生型小鼠和人中性粒细胞相比，Hvcn1-/- 细胞的吞噬体明显更偏碱性。此外，其吞噬体面积也更大（图 4B，n = 3/300）。人中性粒细胞的吞噬体略比野生型小鼠中性粒细胞更偏碱性且体积更大，而经 DPI 孵育的人中性粒细胞则表现出非常酸性且较小的吞噬体。请点击此处查看该图的放大版本。
| 平衡盐溶液（BSS）缓冲液 | |||
| NaCl | 156 mM | ||
| KCl | 3 mM | ||
| MgSO4 | 2 mM | ||
| KH2PO4 | 1.25 mM | ||
| CaCl2 | 2 mM | ||
| 葡萄糖 | 10 mM | ||
| Hepes | 10 mM | ||
| 用 NaOH 或 HCl 调节 pH 至 7.4 | |||
| YPD 培养液 | |||
| YPD 培养液 | 50 g | ||
| 蒸馏水 | 1 L | ||
| 121 °C 高压灭菌 15 分钟 | |||
| YPD 琼脂：灭菌前加入 15 g/L 琼脂 | |||
| 10% 右旋糖酐溶液 | |||
| 临床级右旋糖酐 | 50 g | ||
| NaCl | 4.5 g | ||
| 蒸馏水 | 500 mL | ||
| 加入玻璃瓶中，121 °C 高压灭菌 15 分钟 | |||
| 2× 生理盐水溶液 | |||
| NaCl | 18 g | ||
| 蒸馏水 | 1 L | ||
| 加入玻璃瓶中，121 °C 高压灭菌 15 分钟 | |||
| 10% 皂苷储备液 | |||
| BSS 缓冲液 | 50 mL | ||
| 皂苷 | 5 g | ||
| 将 BSS 缓冲液加热至 37 °C，加入皂苷并混匀。 | |||
| 加入 0.1% 叠氮化钠作为防腐剂，4 °C 保存。 | |||
| 校准缓冲液 | |||
| 白色念珠菌标准曲线 | |||
| 首先配制每种缓冲液的 0.15 M 储备液 | |||
| 配制 0.15 M NaCl 溶液 | |||
| 最终体积 15 mL：5 mL 所需缓冲液的 0.15 M 溶液 + 10 mL 0.15 M NaCl 溶液 | |||
| pH 3 | 100 mM NaCl | 50 mM 甘氨酸 | |
| pH 4 | 100 mM NaCl | 50 mM 醋酸盐 | |
| pH 5 | 100 mM NaCl | 50 mM 醋酸盐 | |
| pH 6 | 100 mM NaCl | 50 mM 醋酸盐 | |
| pH 7 | 100 mM NaCl | 50 mM Tris | |
| pH 8 | 100 mM NaCl | 50 mM Tris | |
| pH 9 | 100 mM NaCl | 50 mM Tris | |
| pH 10 | 100 mM NaCl | 50 mM 甘氨酸 | |
| pH 11 | 100 mM NaCl | 50 mM 磷酸盐 | |
| pH 12 | 100 mM NaCl | 50 mM 磷酸盐 | |
| pH 13 | 100 mM NaCl | 50 mM 磷酸盐 | |
| 胞质标准曲线 | |||
| 使用先前配制的 0.15 M 储备缓冲液 | |||
| 配制 0.15 M KCl 溶液 | |||
| 最终体积 15 mL：5 mL 所需缓冲液的 0.15 M 溶液 + 10 mL 0.15 M KCl 溶液 | |||
| 尼日霉素乙醇储备液（10 mM），向每种最终体积溶液中加入 15 µL | |||
| pH 3 | 100 mM KCl | 50 mM 甘氨酸 | 10 µM 尼日霉素 |
| pH 4 | 100 mM KCl | 50 mM 醋酸盐 | 10 µM 尼日霉素 |
| pH 5 | 100 mM KCl | 50 mM 醋酸盐 | 10 µM 尼日霉素 |
| pH 6 | 100 mM KCl | 50 mM 醋酸盐 | 10 µM 尼日霉素 |
| pH 7 | 100 mM KCl | 50 mM Tris | 10 µM 尼日霉素 |
| pH 8 | 100 mM KCl | 50 mM Tris | 10 µM 尼日霉素 |
| pH 9 | 100 mM KCl | 50 mM Tris | 10 µM 尼日霉素 |
| pH 10 | 100 mM KCl | 50 mM 甘氨酸 | 10 µM 尼日霉素 |
| pH 11 | 100 mM KCl | 50 mM 磷酸盐 | 10 µM 尼日霉素 |
| pH 12 | 100 mM KCl | 50 mM 磷酸盐 | 10 µM 尼日霉素 |
| pH 13 | 100 mM KCl | 50 mM 磷酸盐 | 10 µM 尼日霉素 |
| 用 HCl 或 NaOH 调节所有校准溶液的 pH | |||
表1：缓冲液的组成。 本表描述了本实验方案中所用各种缓冲液的适当组分。
补充代码文件。 该文件包含由 A. P. Levine 编写的多个宏，用于图像分析所必需。作者乐意尽力解答使用此代码过程中遇到的任何问题。请点击此处下载该文件。
讨论
一旦准备好适当的试剂、显微镜设置和校准实验，该方法的实施相对简单。关键步骤包括：使用 S-1 对 Candida 进行标记，以确保染料没有过载，以及校准和图像分析。
S-1 是一种适用于偏碱性 pH 环境的试剂，这对于中性粒细胞尤为重要21，但限制了其在某些细胞类型中的应用。对于偏酸性环境，例如巨噬细胞的吞噬体，由于 SNARF-4（或 S-4）具有较低的 pKa，因此更为适用22。此外，为了获得更准确的胞质 pH 读数，使用 S-4 更为理想，因为 S-1 的标准曲线显示，当 pH 低于 6 时，荧光比值开始趋于平缓（图 3）。其他染料，如 2',7'-双(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素（BCECF）或 pHrodo Red，在预期为酸性环境的情况下也可能更为合适。然而，为了正确识别含有 Candida 的吞噬体，胞质染色仍然是必要的。
吞噬体pH指示剂的一个重要特性是，它不会因吞噬体内的活性环境而发生不可逆的改变。S-1似乎对中性粒细胞的微环境具有耐受性。Levine et al.5 的研究结果（参见参考文献5的补充视频4）对此进行了证明，该研究显示了一个被S-1标记的Candida颗粒被Hvcn1-/-中性粒细胞吞噬后又释放出来的过程。当颗粒被吞噬时，其颜色由黄/橙色变为红色（中性至碱性pH），但当颗粒被中性粒细胞释放后，颜色又恢复至原始状态。
需要指出使用S-1染料存在的一些局限性。尽管该染料具有两个发射光谱，可实现比率测量，这是一个优势，但需要专用设备来获取图像；用于实验的显微镜必须能够同时或以可忽略的时间延迟连续采集两幅图像。作者假定尝试本方案的研究人员已具备共聚焦显微镜使用经验，或可获得经过培训的专业人员协助。我们无法列出所有具体的显微镜参数，因为这些参数会因不同显微镜而异，需由研究人员自行优化。S-1所连接的乙酰氧基甲酯（acetoxymethyl ester）使其能够扩散进入细胞质，随后被细胞质中的非特异性酯酶降解，生成荧光分子。诸如碱性磷酸酶等酯酶存在于人血清和胎牛血清中，而这些血清常用于补充细胞培养基。因此，细胞负载S-1-AM（第4.5节）时所用的培养基中不得含有血清。如果所用细胞需要比本方案中使用的平衡盐溶液更富含营养的培养基才能维持存活，则这一点可能带来挑战。类似地，其他荧光培养基成分（如酚红）也可能干扰S-1的测量结果。
误差线在 图3 表明在每个pH值下比率测量值存在一定变异。为克服不同液泡间的差异，每次实验需进行适当次数的重复（至少n = 3），并在每次独立实验中尽可能增加测量次数。因此，建议在每种条件下至少测量100个吞噬体的pH值，并尽可能选择明显仅含有一个吞噬体的区域进行测量 假丝酵母用于定量测量的吞噬体应为已完全吞噬颗粒的吞噬体 假丝酵母 颗粒（即， 那些完全被细胞质包围的结构）。为避免在选择用于定量的细胞或吞噬体时产生无意偏差，所有分析均应在对实验条件设盲的情况下进行。
本文介绍通过右旋糖酐沉降全血，随后将血浆层经密度梯度离心来分离中性粒细胞的方法。我们采用该技术是因为其能够快速、高效地获得高纯度（>95%）的中性粒细胞群体。尽管也存在其他方法，例如将全血通过其他密度梯度介质进行离心，或使用特异性抗体或磁珠试剂盒对中性粒细胞进行阴性筛选。然而，对于常规分离中性粒细胞的大多数研究团队而言，后一类方法成本可能过高。此外，我们在采血管中使用肝素作为抗凝剂，而其他研究人员可能更习惯使用乙二胺四乙酸（EDTA）或酸性枸橼酸钠（ACD）。由于可选方法众多，具体选择取决于研究者的个人偏好。
此外，在分离和操作中性粒细胞时，应小心处理，以避免过度活化。预防措施包括：仅使用塑料器皿，不得使用玻璃器皿；所有缓冲液均需经滤膜除菌，以去除可能污染的内毒素；离心中性粒细胞时，务必确保离心机平衡良好，以避免过度振动；尽量缩短中性粒细胞在离心后处于沉淀状态的时间；中性粒细胞在溶液中的浓度不应超过 5 × 106/mL；分离后应尽快进行实验。
通过将显微镜的加热载物台设定为37 °C，并按照校准步骤中所述，每隔30-60秒从同一位置拍摄图像，该方法可被调整用于随时间测量pH值和吞噬体面积的变化。理论上，该方法也可适用于高通量实验，例如在96孔板中进行的实验，以及流式细胞术实验，其中S-1可用作pH指示剂23。然而，在这些实验条件下，对单个细胞活性的关注将被对细胞群体更广泛的总体效应所取代。
该方法旨在提供一个相对简单的实验体系，研究人员可根据自身研究领域对其进行调整。例如，研究者可能希望在测量其他离子运动的同时，探究中性粒细胞吞噬体的pH值和面积，如细胞内钙离子浓度。目前已有多种可用于共聚焦显微镜的荧光Ca2+指示剂，例如Indo-1，其在400 nm和475 nm处具有双发射光谱24。这些发射波长与S-1的发射光谱不重叠，但其激发波长位于紫外（UV）光谱区域，可能对细胞造成损伤，且并非所有显微镜都配备紫外激光器。Takahashi et al.25 和 Hillson et al.26 对用于检测细胞内钙离子流的不同指示剂进行了全面综述。
总之，尚有其他方法可利用不同的荧光染料来测定吞噬体的pH值，如Nunes所述 等已证明13 以及其他团队27,28其他研究人员也使用 S-1 来测量细胞质 pH29 或吞噬体pH14然而，本实验方案的独特之处在于可同时测量细胞质和吞噬体的pH值，从而能够观察吞噬体横截面积的变化，并区分野生型与 Hvcn1-/- 小鼠中性粒细胞，以及具有和不具有正常NADPH氧化酶功能的人类中性粒细胞
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由惠康信托基金、生物技术和生物科学研究理事会以及欧文·乔夫纪念奖学金资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Candida albicans ATCC 10231 Vitroids 80 CFU | 西格玛-奥德里奇 | RQC14003-10EA | 根据制造商说明，直接放置于涂布琼脂平板上 |
| YPD 肉汤 | 西格玛-奥德里奇 | Y1375 | 遵循制造商说明，存在多个供应商 |
| 临床级葡聚糖，分子量 = 200,000–300,000 | MP Biomedicals | 2101514 | 使用手套 |
| 肝素钠输注溶液（无防腐剂），1,000 IU/mL | Fannin，Wockhardt UK Ltd | FP1077 | 我们从UCH住院药房采购 |
| SNARF-1 羧酸，乙酸盐，琥珀酰亚胺酯 - 特殊包装 | 赛默飞世尔科技/英维特罗根 | SS22801 | 使用手套 |
| 5-(和-6)-羧基 SNARF-1，乙酰氧甲基酯，乙酸盐 | 赛默飞世尔科技/英维特罗根 | C1272 | 使用手套 |
| Vivaglobin 人IgG 160 mg/mL 溶液 | CSL Behring | 作为赠品获得 | 存在多个供应商 |
| 正常小鼠血清 | Abcam | ab7486 | 存在多个供应商 |
| Lymphoprep（密度梯度介质） | Alere Ltd | 1114547 | 保持无菌并避免直接阳光照射，可用Ficoll-Paque替代 |
| 尼日里菌素（Nigericin） | 西格玛-奥德里奇 | N7143 | 有毒，使用手套，存在多个供应商 |
| 皂苷（Saponin） | 西格玛-奥德里奇 | 47036 | 有毒，使用手套，存在多个供应商 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | 西格玛-奥德里奇 | D8418 | 有毒，使用手套，存在多个供应商 |
| 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES） | 西格玛-奥德里奇 | H3375 | 存在多个供应商 |
| 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris） | 西格玛-奥德里奇 | T1503 | 存在多个供应商 |
| 氯化钾（KCl） | 西格玛-奥德里奇 | P9333 | 存在多个供应商 |
| 氯化钠（NaCl） | 西格玛-奥德里奇 | S7653 | 存在多个供应商 |
| 氯化镁（MgCl2） | 西格玛-奥德里奇 | M8266 | 存在多个供应商 |
| 硫酸镁（MgSO4） | 西格玛-奥德里奇 | M7506 | 存在多个供应商 |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | 西格玛-奥德里奇 | P9791 | 存在多个供应商 |
| 氯化钙（CaCl2） | 西格玛-奥德里奇 | C1016 | 存在多个供应商 |
| 葡萄糖 | 西格玛-奥德里奇 | D9434 | 存在多个供应商 |
| 无水乙醇 | 西格玛-奥德里奇 | 2860 | 存在多个供应商 |
| 二苯基碘鎓（DPI） | 西格玛-奥德里奇 | D2926 | 存在多个供应商 |
| 氯化锌 | 西格玛-奥德里奇 | 208086 | 存在多个供应商，切勿用磷酸盐缓冲液稀释，否则会沉淀 |
| 聚-L-赖氨酸 | 西格玛 | P4707 | 存在多个供应商 |
| 激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss LSM 700） | 卡尔·蔡司 | 显微镜必须能够在555 nm处激发，并同时在两个通道检测发射光（560–600 nm，>610 nm） | |
| Ibidi µ slide 8孔 ibiTreat | Thistle Scientific | IB-80826 | 其他合适的成像培养皿可替代 |
| Soniprep 150 | MSE | 任何合适的超声破碎仪均可 | |
| TC20 自动细胞计数仪 | BioRad | 存在多个供应商 | |
| 1.5 mL 蛋白低吸附管（Protein LoBind Tubes） | 西格玛-奥德里奇 | Z666505-100EA | 特别用于防止Candida黏附于普通离心管 |
参考文献
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