方法文章

监测星形胶质细胞反应性与增殖 体外 在模拟缺血条件下

DOI：

10.3791/55108

⸱

2017年10月21日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 2Department of Biochemistry, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical Sciences, Campus, University of Puerto Rico

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

缺血性脑卒中是一种复杂的病理事件，其中星形胶质细胞在暴露于氧糖剥夺（OGD）的脑区所发挥的特定作用难以研究。本文介绍了一种获取分离星形胶质细胞的方法，并研究其在氧糖剥夺条件下的反应性及增殖能力。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

缺血性脑卒中是一种由血栓或栓子阻塞脑部血流引起的复杂脑损伤。这会导致脑组织缺氧和葡萄糖供应中断，进而引发能量衰竭和神经元死亡。在发生缺血性脑卒中后，星形胶质细胞会活化，并在损伤区域周围增殖。在此情况下，难以研究星形胶质细胞对缺血脑区所起的特定作用。因此，本文介绍了一种用于研究原代星形胶质细胞在缺血条件下活化与增殖反应的方法 体外 模拟缺血样环境，称为氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation, OGD）。星形胶质细胞从出生后1至4天的大鼠幼鼠中分离获得，并通过星形胶质细胞特异性标记物胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP）及细胞核染色评估非特异性星形胶质细胞的数量。星形胶质细胞接受OGD处理的时间可自定义，其所暴露的氧气浓度百分比也可调节。这种灵活性使科研人员能够在不同细胞组中表征缺血样条件持续的时间 体外本文讨论了通过增殖细胞核抗原（PCNA）免疫荧光检测所评估的氧糖剥夺（OGD）诱导星形胶质细胞活化、肥大形态改变及增殖的时间进程。除增殖外，星形胶质细胞还会经历能量与氧化应激，并通过向细胞培养基中释放可溶性因子来响应OGD。该培养基可被收集并用于分析星形胶质细胞释放的分子对原代神经元培养物的影响，且无需细胞间直接接触。综上所述，该原代细胞培养模型可有效用于理解损伤条件下孤立星形胶质细胞的作用。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脑卒中被定义为"一种血管源性的急性神经功能障碍，其症状和体征突然或迅速出现，对应于脑部局部区域的受累"1,2。脑卒中分为两种类型：出血性脑卒中和缺血性脑卒中。当血管功能障碍由动脉瘤或动静脉畸形引起，并伴有动脉壁薄弱继而破裂时 ，称为出血性脑卒中3，这种情况多数会导致死亡。当血栓或栓子阻塞血流，导致脑区暂时性缺氧和葡萄糖供应不足时，则称为缺血性脑卒中4。若受累区域周围细胞无法获得足够营养，即缺血核心周围的组织出现稳态和代谢失衡、能量功能障碍、神经元死亡及炎症反应5，可导致患者终身残疾6。

缺血性脑卒中是一种多因素损伤，涉及多种细胞类型，这些细胞在不同时间点发生反应并发挥各自的作用。众多相互作用使得研究单个细胞的行为变得困难。那么，在如此复杂的环境中，我们如何研究特定细胞类型的贡献呢？一种被广泛接受的 体外 缺血模型包括将细胞暴露于无氧无糖（OGD）环境中一定时间，随后将细胞恢复至常氧环境。该系统模拟缺血性脑卒中后血流再灌注的过程。在此方法中，细胞或组织被置于无葡萄糖培养基中，并在经特殊低氧舱去除氧气的环境中进行培养。OGD孵育时间可根据研究假设的不同，从数分钟至24小时不等。研究表明，根据OGD处理时间及恢复常氧环境的时间不同，可产生特定的脑卒中表型即，可实现急性或亚慢性损伤。原代分离的星形胶质细胞在氧糖剥夺后恢复至常氧条件，是模拟脑卒中广泛研究的细胞模型 体外7使用氧糖剥夺（OGD）可以揭示孤立细胞在类似中风环境下的独立分子机制。

随着我们对星形胶质细胞生物学的认识不断加深，已明确它们在维持突触功能以及神经修复、发育和可塑性方面起着至关重要的作用8。在正常条件下，星形胶质细胞会释放并响应细胞因子、趋化因子、生长因子和胶质递质，以维持突触内的代谢平衡和稳态5,9。在急性神经炎症（如缺血性卒中）中，这些细胞可转变为反应性状态，长期过表达胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP），并在形态上表现出肥大5,10,11,12。随着缺血性梗死的发展，星形胶质细胞所提供的稳态功能受到影响，包括正常的谷氨酸摄取、能量代谢、活性分子交换以及抗氧化活性13。

活化的星形胶质细胞在梗死组织周围增殖，同时白细胞向损伤区域迁移14。星形胶质细胞的增殖可通过增殖细胞核抗原（PCNA）、Ki67 和溴脱氧尿苷（BrdU）等标记物进行检测15。这种增殖反应呈时间依赖性，并有助于形成胶质瘢痕，即在损伤后于受损部位实质周围排列的一层不可逆活化的星形胶质细胞9。该瘢痕的初始功能之一是限制免疫细胞从此区域外渗。然而，研究表明，瘢痕会成为轴突延伸的物理障碍，因其释放抑制轴突生长的分子，并形成物理屏障，阻止轴突在损伤区域周围延伸16。尽管如此，已有科学证据表明，在脊髓损伤后，完全阻止胶质瘢痕的形成可能损害轴突的再生17。因此，在研究特定损伤模型的背景下，必须考虑所测量的星形胶质细胞反应的具体情境。

所介绍的方法可用于研究星形胶质细胞在缺氧缺糖后的个体化功能，并可根据研究者希望回答的问题进行相应修改。例如，除了观察不同缺氧缺糖时间下的形态学变化及标志物表达外，还可进一步分析经缺氧缺糖处理的星形胶质细胞的上清液，以鉴定这些细胞释放的可溶性因子，或将其用作条件培养基来评估其对其他脑细胞的影响。该方法有助于开展关于星形胶质细胞反应性的研究，进而揭示在缺血性脑卒中情境下调控其反应的关键因素。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

采用出生后1至4天的幼年大鼠（Sprague Dawley品系）分离大脑皮层。安乐死方法为断头法，该方法已获美国国立卫生研究院（NIH）指南批准。

1. 手术器械和材料的准备

  1. 使用钢盒或快速封口灭菌袋，将器械在高压灭菌器中灭菌（温度：121 ºC，压力：15 psi，时间：30 分钟）。参见材料表中的材料。

2. 完全DMEM培养基的制备

  1. 在含有 700 mL 经高压灭菌水的一升烧杯中，于室温下加入 Dulbecco 改良 Eagle 培养基粉末。
  2. 在使用磁力搅拌器搅拌溶液的同时，加入 3.7 g/L 碳酸氢钠。
  3. 用高压灭菌水将体积补至 1 L，同时调节 pH 至 7.4，然后过滤。用于培养时，按所需体积补充 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素，并在 37 ˚C 下预热。参见材料表中的材料。
    注意：通过将 pH 计电极插入培养基中将 pH 调节至 7.4。调节过程中培养基必须持续搅拌，并使用滴管缓慢加入 1 M NaOH。

3. 原代星形胶质细胞培养

注意： 接种后，细胞培养基必须每三天更换一次，细胞可培养至汇合状态（11-13天）。第三天时，轻拍培养瓶数次，使小胶质细胞和少突胶质前体细胞从培养物中脱落，移除所有“旧”培养基，用10 mL PBS洗涤两次，吸除PBS，然后加入新鲜培养基。参见材料表中的材料。

  1. 新生大鼠脑组织解剖
    1. 在组织培养罩内进行解剖操作。取出生后1至4天的新生大鼠幼崽（每75 cm2培养瓶使用2只大鼠脑组织）。
    2. 准备三个60 mm的培养皿，每个培养皿中加入5 mL完全DMEM培养基。
      注意：可按以下方式分配：#1用于放置每只大鼠的完整脑组织，#2用于收集所有脑组织的皮层，#3用于盛放已去除脑膜的皮层组织。
    3. 抓取幼鼠并喷洒70%乙醇消毒。剪下头部，将身体部分弃置于小型生物危害废物容器中。
    4. 使用显微解剖镊夹住头部，沿头顶剪开皮肤以暴露颅骨。
    5. 用另一把剪刀从颅骨后部向鼻部方向做“T”形切口。用镊子轻轻移除颅骨。
    6. 用镊子取出暴露的脑组织，并将其放入先前盛有培养基的培养皿之一中。
    7. 后续步骤需更换为另一套无菌器械。
    8. 使用显微解剖镊将一个脑组织轻轻放置于60 mm培养皿的倒置皿盖上。当培养皿置于无菌纱布上时，可清晰观察脑组织，便于解剖操作。
    9. 用显微解剖镊固定脑组织，并用镊子尖端沿中线裂隙轻轻分离大脑半球。
    10. 将皮层组织掀开并剥离，保留白质部分，并将剥离的皮层转移至事先标记为#2的培养皿中。对所有脑组织重复此操作，将所有解剖得到的皮层集中于#2培养皿中。
    11. 从每个皮层下方取出海马体并弃去。
    12. 使用显微解剖镊和60 mm培养皿，轻轻剥离各个皮层叶的脑膜，并将去膜后的皮层组织放入标记为#3的培养皿中。
  2. 组织解离：匀浆器搅拌法
    1. 将组织/培养基悬浮液（已去膜的脑皮层）倒入无菌搅拌袋中，并加入足够量的培养基，使袋内总体积达到5 mL。
    2. 将搅拌袋放入匀浆器中，关闭舱门时保留约2 cm袋体露在外部。以高速匀浆2.5分钟完成细胞解离。
      注意：也可选择将搅拌袋封口后，在生物安全柜内用烧杯轻轻敲击袋体进行解离。操作时应在袋与烧杯之间垫一块布，以防摩擦破损。
    3. 将细胞悬液倒入60目筛网，滤过后再倒入100目筛网，依靠重力自然过滤。
    4. 使用15 mL离心管，在临床离心机（建议使用水平转子）中以200 × g离心5分钟。
    5. 将上清液倒入烧杯中，然后用移液管加入最多5 mL培养基，重悬并进一步解离细胞沉淀。
  3. 细胞计数
    1. 用微量移液器吸取100 µL细胞悬液至1.5 mL微量离心管中，加入100 µL台盼蓝染液。
    2. 取10 µL上述混合液加入血细胞计数板，计数方格四个角区域内的所有活细胞。
    3. 在制备培养瓶前计算细胞密度的公式如下：
      用于确定样本中细胞浓度的活细胞计数公式示意图。
      细胞稀释计算公式，所需总细胞数与每毫升活细胞数之比，实验室计算
    4. 每25 cm2培养瓶接种至少50万个细胞。向每个培养瓶中加入最多5 mL DMEM培养基，液体不应超过瓶颈。将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养3天后更换培养基。
  4. 星形胶质细胞纯化技术：培养基更换、机械法及化学法策略
    注意：与其他细胞类型相比，星形胶质细胞的代谢速率较高，因此在营养缺乏条件下，这些细胞在数天后存活率较低。而小胶质细胞不受营养剥夺影响，反而可在该环境中增殖18。为减少小胶质细胞数量，作者每3天更换一次星形胶质细胞培养基。这种持续的培养基更换还可减少在培养瓶中星形胶质细胞单层表面生长的小胶质细胞数量19。
    1. 使用巴斯德吸管从每个培养瓶中吸除含有非贴壁小胶质细胞的培养基。用无菌过滤的PBS逐滴清洗残留碎片（每瓶5 mL）。
    2. 逐滴向每个培养瓶中加入无菌过滤的DMEM培养基（含抗生素和胎牛血清）（每瓶5 mL）。轻轻以环形方式晃动，使液体均匀覆盖整个表面。
    3. 将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中培养8–10天，直至培养瓶达到汇合状态（>95%孔板覆盖率）。
      注意：已有多种方案表明，当星形胶质细胞达到汇合状态时，采用机械方法（如震荡培养2–24小时）可使位于星形胶质细胞上层的细胞（主要为小胶质细胞和前体细胞）脱落19,20。
    4. 通过以180 rpm转速进行轨道振荡30分钟，减少非星形胶质细胞。去除上清液后，向培养瓶中加入新鲜培养基（约15 mL）。
    5. 为清除少突胶质前体细胞，将振荡速度提高至200 rpm，持续6小时21,22,23，吸除上清液后加入新鲜培养基。
      注意：为减少培养物中小胶质细胞的污染，可在原代细胞培养过程中依次（非同时）使用两种化学方法：阿糖胞苷（Ara-C）和L-亮氨酸甲酯（LME）24。
    6. 在细胞达到完全汇合（100%）后立即处理（即机械去除小胶质细胞后3–4天），使用8 µM抗有丝分裂化合物阿糖胞苷（Ara-C）溶于DMEM中处理5天（每日更换含Ara-C的新鲜DMEM）。
      注意：添加Ara-C的时间点至关重要，因为该化合物为抗有丝分裂药物，可减少快速增殖的细胞（如小胶质细胞19,25和成纤维细胞26）的数量。相比之下，星形胶质细胞在汇合后会因接触抑制而停止增殖27。
    7. 给予细胞2天时间从Ara-C处理中恢复。
    8. 为进一步减少小胶质细胞污染，在细胞达到汇合状态后，使用50 mM L-亮氨酸甲酯（LME）溶于pH 7.4的DMEM中，在37 °C处理1小时。
      注意：LME可穿透细胞膜和细胞器膜，水解后产生的L-亮氨酸在细胞溶酶体内积聚。该氨基酸的积累可导致溶酶体渗透性肿胀并破裂28,29。与其他细胞相比，LME在清除小胶质细胞方面具有高效性20,30。

4. 在6孔板中培养星形胶质细胞

  1. 用多聚赖氨酸包被盖玻片
    1. 将一个盖玻片放入每个35 mm培养皿中，然后向每个盖玻片加入100 µL稀释的多聚赖氨酸（Poly-D-Lysine）溶液，静置1小时。
    2. 去除多聚赖氨酸溶液，用2 mL无菌水洗涤两次。
    3. 去除水分，将盖玻片在超净台内晾干。将盖玻片储存于-20 °C，最多可保存两周。
      注意：将稀释后的多聚赖氨酸溶液冷冻保存，可存放最多两周。
  2. 胰酶消化
    1. 使用巴斯德吸管从培养瓶中吸除培养基。每瓶加入5 mL经无菌过滤的PBS，轻轻冲洗细胞。
    2. 吸除PBS，然后每瓶加入5 mL经无菌过滤的0.25%胰酶和0.5 mM EDTA溶液。将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育10分钟。
      注意：在细胞孵育期间，将每瓶5 mL的新鲜完全DMEM培养基在37 °C预热。
    3. 孵育10分钟后，轻轻振荡以确保所有细胞从瓶壁脱落。迅速向每瓶中加入5 mL预热的完全DMEM培养基，以中和胰酶活性。
    4. 轻柔吹打细胞数次，以分散任何“团块”。将两个培养瓶中的悬浮细胞转移至一个15 mL锥形离心管中。
    5. 以200 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。将沉淀重悬于500 µL培养基中，并立即接种至培养瓶中。
      注意：可用于细胞分析的示例包括：1）逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）分析基因表达；2）蛋白质印迹法（Western blot）评估蛋白表达水平；3）流式细胞术分析神经前体细胞数量及目标蛋白表达；4）免疫荧光染色分析蛋白表达与定位。
  3. 星形胶质细胞接种
    1. 将原代星形胶质细胞经胰酶处理后（参见4.2步骤），取100 μL细胞悬液至1.5 mL微量离心管中，加入100 μL 0.5%台盼蓝溶液。
    2. 取10 μL经台盼蓝染色的细胞悬液加入血细胞计数板，计数所有活细胞。
    3. 使用步骤3.3中的公式计算接种前细胞密度。
    4. 在多孔板的每个孔中放入一个无菌的、经多聚赖氨酸包被的盖玻片，用移液器加入50,000个细胞，并用新鲜培养基补足每孔体积至约2 mL。
    5. 将多孔板置于37 °C、5% CO2培养箱中培养，5–7天后星形胶质细胞可生长并覆盖整个盖玻片表面。

5. 原代星形胶质细胞的氧糖剥夺（OGD）方案

  1. OGD 培养基的制备
    1. 在无葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium-free glucose）中添加 3.7 g/L 碳酸氢钠和 1% 青霉素/链霉素。参见表4中的材料。
    2. 将 20 mL 无葡萄糖培养基置于气体系统中，插入移液管，通入 95% N2/5% CO2 混合气体 10 分钟，气体流速为 15 L/min（通过流量计指示）。
      注意：在去除培养基中的氧气后，调节 pH 至 7.4（参见步骤2.1的注释）。
    3. 使用 50 mL 滤器系统过滤已脱氧的无葡萄糖培养基。
      注意：每次实验均需新鲜配制 OGD 培养基，并在使用前用 95% N2/5% CO2 气体混合物吹扫，以确保细胞暴露于无氧环境中。
  2. 实验步骤
    1. 在组织培养超净台内，移除先前制备的盖玻片上的星形胶质细胞培养基（参见步骤 4.3.5），并用细胞用 PBS 洗涤两次，以去除细胞表面残留的葡萄糖。
    2. 向每孔加入 2 mL OGD 培养基，将多孔板放入缺氧室中，并打开盖子。
    3. 将气体混合物连接至进气阀，保持出气阀开放，以 15 L/min 的流速用 95% N2/5% CO2 气体混合物冲洗缺氧室 5 分钟。
    4. 停止供气，首先关闭出气阀上的夹子，然后关闭进气管路上的夹子。
      注意：用肥皂水涂抹缺氧室密封处，检查是否漏气。若密封良好，则不应产生气泡。
    5. 将整个缺氧室放入 37 °C 细胞培养箱中，进行 1 小时或 6 小时的 OGD 处理。
    6. 孵育结束后，吸除 OGD 培养基，并小心地向每个 4.67 cm2 孔中加入 2 mL 完全 DMEM 培养基，进行常氧条件下 24 小时的恢复培养。

原代星形胶质细胞免疫荧光制备方案

注意：为评估星形胶质细胞纯度，可使用不同细胞标志物通过免疫荧光检测神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞等不同类型的脑细胞。对于经历氧糖剥夺（OGD）后恢复常氧条件的原代星形胶质细胞，可使用增殖标志物PCNA和碘化丙啶（PI）进行检测。参见材料表中的材料。

  1. 免疫荧光样品制备
    注意： 这是一份通用的免疫荧光实验方案，可进行少量修改以获得最佳信号（例如，更长的孵育时间，孵育温度）。每种标志物来自 表1 可根据制造商的说明书使用。
    1. 为评估细胞活力，可将细胞在37 °C下用PI（5 µM，溶于完全DMEM中）孵育5分钟，随后用2 mL PBS洗涤两次，每次5分钟。出现PI染色的细胞活力较低。
      注意： 使用在步骤 5.2.6 中处理的细胞。
    2. PI 染色后固定细胞，每 4.67 cm² 加入 2 mL 4% 甲醛溶液2 在4 ˚C下孵育20分钟。对于标记PCNA的样品，建议使用甲醇在4 ˚C下固定10分钟。
      注意： 甲醛和甲醇具有毒性。
      注意： 始终查阅各公司提供的特异性抗体实验方案。
    3. 用 2 mL 磷酸盐缓冲液洗涤细胞，每次 5 分钟，重复此步骤 3 次。
    4. 在室温下，将细胞置于封闭液（含0.5%非离子型表面活性剂和10%胎牛血清的PBS溶液）中孵育30分钟，并轻轻振荡。
    5. 用 2 mL PBS 洗涤细胞 5 分钟，重复洗涤 3 次。
    6. 4 °C 下孵育过夜（16 小时），使用含 1% FBS 的 PBS 溶液稀释的一抗（PCNA、GFAP）。
    7. 移除一抗溶液，加入2 mL PBS清洗5分钟，重复此步骤3次。
    8. 在含1% FBS的PBS溶液中，室温下与荧光标记的二抗孵育1小时。
    9. 用 2 mL PBS 洗涤细胞 5 分钟，重复此步骤 3 次。加入 1 µg/mL DAPI（4',6'-二脒基-2-苯基吲哚）染色细胞核，孵育 5 分钟。
    10. 用 2 mL PBS 洗涤细胞 5 分钟，重复该步骤两次，最后将细胞置于 PBS 中保存。
    11. 使用封片剂在显微镜载玻片上制备盖玻片。
  2. 共聚焦显微镜
    1. 显微镜设置完成后，将盖玻片朝下放置在显微镜载物台上。
    2. 使用软件选择543 nm激光束用于GFAP-Cy3偶联抗体。

7. 细胞活力检测

  1. 按照步骤 4.3 和 4.4 对星形胶质细胞进行胰酶消化并计数。
  2. 将 1×104 个细胞/孔接种至 96 孔板中，并培养至细胞融合。
  3. 采用步骤 5 的方法，将培养的 96 孔板分别暴露于常氧、1 小时氧糖剥夺（OGD）或 6 小时氧糖剥夺（OGD）条件下。
  4. OGD 处理后，向所有细胞中加入常氧培养基，继续培养 24 小时，并使用 MTT 试剂法检测细胞活力（按照试剂盒说明书操作）。
  5. 从 5 mg/mL 的 MTT 溶液中，加入总体积的 10% 至每孔，于 37 ˚C 孵育 3 小时。
  6. 移除培养基，加入 200 µL 二甲基亚砜（DMSO）重悬结晶，使用分光光度计在 570 nm 波长处读取吸光值。
    注意：与对照组细胞相比，吸光度降低表明细胞活力下降。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

原代星形胶质细胞培养的主要问题之一是存在其他类型的细胞，例如神经元、少突胶质细胞、成纤维细胞和小胶质细胞。图1显示，从大鼠皮层分离的细胞每3天更换一次培养基，部分细胞未接受处理，另一部分则添加LME处理1小时。24小时后，对细胞进行GFAP免疫染色，并用DAPI复染。未处理组中非GFAP阳性细胞平均占39%，而LME处理组中仅为8%。这些结果表明，LME处理结合换液可使非GFAP阳性细胞减少4.75倍，从而获得富集的星形胶质细胞培养物。为了确定1小时或6小时氧糖剥夺（OGD）在此方法学背景下是否影响星形胶质细胞的存活率，图2展示了损伤后24小时星形胶质细胞培养物的MTT检测结果。各组之间细胞存活率无显著差异，表明两种OGD时间均可用于研究星形胶质细胞的反应性。细胞增殖是OGD在星形胶质细胞中诱导的效应之一。图3中的增殖细胞核抗原（PCNA）表达水平从常氧条件下细胞的10%上升至1小时OGD后的3...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了从大鼠大脑皮层中分离星形胶质细胞的方法。该方法的关键在于减少小胶质细胞、少突胶质细胞和成纤维细胞等其他细胞类型的污染。为减少小胶质细胞的数量，可采取多种措施：更换培养基、轨道振荡以及化学处理。一旦通过免疫荧光法使用特异性细胞标志物或针对主要污染细胞类型的标志物确认培养物的纯度，即可开展实验。例如，可使用针对离子化钙结合接头分子1（Iba-1）的抗体来检测小胶质细胞。神经元死亡在培养早期即开始发生，这些细胞以及少突胶质前体细胞（OPCs）会在第3天敲击培养瓶并更换培养基后被清除。31 可使用如olig2或NG2等抗体来鉴定少突胶质前体细胞。GalC可用于鉴定未成熟或成熟的少突胶质细胞，但在该培养阶段，这些细胞不太可能存在。此外，也可通过定量非GFAP阳性细胞来估算污染细胞的比例。这种最后一种方法虽不能区分具体的细胞类型，但是一种更快且更经济的评估培养物中非星形胶质细胞比例的方法。

星形胶质细胞富集培养建立后，可进行氧糖剥夺（OGD）实验以研究星形胶质细胞的反应性。通过向溶液中通入氮气以置换氧气，是一种常用的实验方案。

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢 Paola López Pieraldi 提供的技术支持。A.H.M. 感谢资助本出版物的基金项目 8G12MD007600 和 U54-NS083924。我们感谢 NIH-NIMHD-G12-MD007583 基金对实验设施的支持。D.E.R.A. 感谢 NIHNIGMS-R25GM110513 项目提供的博士后奖学金。我们感谢在 RCMI 项目基金 G12MD007583 支持下，使用共用仪器区以及 Priscila Sanabria 博士在光学成像设施使用过程中提供的帮助。此外，我们感谢 Jose Padilla 在视觉实验方案的拍摄与编辑工作中所做出的杰出贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>外科手术器械 - 第1步
操作剪刀 5.5”Roboz公司RS-6812用于断头处死大鼠的工具。
弯头镊子 7” Roboz公司RS-5271在移除大鼠颅骨时固定其皮肤。
微型解剖剪 4” Roboz 公司RS-5882同时切开大鼠的皮肤和颅骨。
显微解剖镊子 4” 倾斜的，精细锋利的 Roboz公司RS-5095在移除大鼠颅骨时固定其皮肤。
显微解剖镊 4” 轻度弯曲 0.8Roboz 公司RS-5135用于分离皮质的工具。
显微解剖镊Roboz 公司RS-4972剥离脑膜
解剖显微镜OlympusSZX16对去除大脑皮层的脑膜至关重要。
<强>DMEM 制备——步骤 2
杜尔贝科’s 改良伊格尔’DMEM培养基GibCo. 公司11995-065支持细胞生长。
碳酸氢钠Sigma-Aldrich 公司S7277细胞培养基添加剂
胎牛血清（FBS）GibCo. 公司10437-010细胞培养用血清补充剂
青霉素-链霉素 GibCo. 公司15140-148抑制细胞培养中细菌的生长。
1L滤器系统，孔径0.22μm康宁431098
<强>星形胶质细胞培养 - 步骤3
5 mL 血清移液管VWR89130-896将DMEM用移液器加入含有细胞的容器中。
10 mL 血清移液管VWR89130-898将DMEM用移液器加入含有细胞的容器中。
25 mL 血清移液管VWR89130-900将DMEM用移液器加入含有细胞的容器中。
离心15 mL锥形管Santa Cruz Biotechnologysc-200250
安全锁扣管 1.5 mLEppendorf022363204
200 µL 防污染吸头Santa Cruz Biotechnologysc-201725
屏障吸头 1 mLSanta Cruz Biotechnologysc-201727
生物危害橙色袋 14 x 19"VWR14220-048
60 mm 培养皿Falcon351007
无菌纱布垫霍尼韦尔安全防护89133-086
Stomacher 80 BiomasterSewar 实验室系统030010019匀浆脑组织。
Stomacher 80 均质器无菌袋Sewar 实验室系统BA6040拍击式均质器用无菌袋
400 mL烧杯Pyrex1000
无菌细胞分离筛，60目 Sigma-Aldrich 公司S1020获得均匀的单细胞悬液。
无菌细胞分离筛，孔径 #100Sigma-Aldrich 公司S3895获得均匀的单细胞悬液。
倒置相差显微镜尼康Eclypse Ti-S检测细胞是否存在污染或异常生长。
75 cm² 无菌培养瓶Falcon353136
多孔板Falcon353046
18毫米圆形盖玻片VWR48380-046
亮线血细胞计数板Sigma-Aldrich 公司Z359629
巴斯德吸管Fisher Scientific13-678-20D
乙醇 Sigma-Aldrich 公司E7023
L-亮氨酸甲酯盐酸盐 98%（LME）Sigma-Aldrich 公司L1002促进原代皮质星形胶质细胞培养物中小胶质细胞的清除。
胞嘧啶 β-D-阿糖呋喃糖苷（Ara-C）Sigma-Aldrich 公司C1768
聚-D-赖氨酸氢溴化物，分子量 70,000-150,000Sigma-Aldrich 公司P0899
胰蛋白酶/EDTAGibCo. 公司15400-054
台盼蓝Sigma-Aldrich 公司T8154
磷酸盐缓冲液（PBS）片剂Calbiochem524650
无菌水Sigma-Aldrich 公司W3500
<强> OGD 培养基制备——步骤 5
50 mL 圆锥形离心管离心VWR89039-658
杜尔贝科’s 改良的 Eagle’无糖培养基Sigma-Aldrich 公司D5030支持细胞生长。
碳酸氢钠Sigma-Aldrich 公司S7277细胞培养基添加剂
青霉素-链霉素 GibCo. 公司15140-148抑制细胞培养中细菌的生长。
200 mM  L-谷氨酰胺 GibCo. 公司25030-081促进细胞生长的氨基酸。
磷酸盐缓冲液（PBS）片剂Calbiochem524650
50 mL 0.22 μm 孔径滤器系统康宁430320
50 mL 圆锥形离心管离心VWR89039-658
单一流量计 Billups-RothenbergSMF3001测量氧气吹扫中的气体流量。
缺氧培养箱 干细胞27310为细胞培养提供低氧环境。
可追溯溶解氧测定仪VWR21800-022
95% N2 / 5% CO2 气体混合物Linde清除环境中的氧气。
<强>原代星形胶质细胞免疫荧光——步骤6
磷酸盐缓冲液（PBS）片剂Calbiochem524650
中性缓冲福尔马林溶液 10%Sigma-AldrichHT501128用于固定细胞的溶液。
甲醇 FisherA4544用于固定细胞的溶液。
非离子型表面活性剂（Triton X-100）Sigma-AldrichT8787
胎牛血清（FBS）GibCo. 公司10437-010细胞培养用血清补充剂
抗 NeuN细胞信号传导24307检测成熟神经元，用于验证星形胶质细胞培养。
抗PCNA细胞信号传导2586检测增殖细胞。
碘化丙啶（PI）Sigma-Aldrich 公司P4170细胞凋亡染色
抗Olig1AbcamAB68105检测成熟的少突胶质细胞。
抗Iba1+和光016-20001检测小胶质细胞。
抗GFAP-Cy3抗体 Sigma-Aldrich 公司C9205检测经处理细胞中的反应性星形胶质细胞。
Alexa Fluor 488分子探针生命科技A1101抗小鼠二抗
Alexa Fluor 555分子探针生命科技A21428抗兔二抗
4’,6’-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）Sigma-Aldrich 公司D9542细胞核染色
共聚焦显微镜Olympus

参考文献

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