方法文章

暴露在生理条件下的氧气在人体细胞中帽结合蛋白质分析

DOI：

10.3791/55112

⸱

2016年12月28日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们提出了人类细胞培养方案，以分析在生理氧条件下结合 mRNA 5' 帽的翻译起始因子。该方法利用琼脂糖连接的 m7GTP 帽类似物，适用于研究帽结合因子及其相互作用的伴侣。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

翻译控制是基因调控的焦点，尤其是在细胞应激期间。迄今为止，通过 eIF4F 复合物的帽依赖性翻译是真核细胞中启动蛋白质合成的最常见途径，但该复合物的应激特异性变体现在正在出现。使用由琼脂糖连接的 m7GTP（一种 5' mRNA 帽类似物）组成的亲和树脂纯化帽结合蛋白是鉴定参与翻译起始调节的因子的有用工具。缺氧（低氧）是胎儿发育和肿瘤进展过程中遇到的一种细胞应激，高度依赖于翻译调节。此外，最近有报道称，人类成人器官的氧含量较低（生理 1-9% 的氧），比常规培养细胞的环境空气更接近缺氧。随着缺氧 eIF4F 复合物 （eIF4FH） 的持续表征，人们对通过 5' mRNA 帽了解氧依赖性翻译起始越来越感兴趣。我们最近开发了一种人类细胞培养方法，用于分析受氧气可用性调节的帽结合蛋白。该方案强调在缺氧工作站中进行细胞培养和裂解，以消除暴露于氧气。细胞必须孵育至少 24 小时，以使液体培养基与工作站内的大气保持平衡。为避免此限制，如果需要更短的时间点，可以将预处理培养基（脱氧）添加到细胞中。某些帽结合蛋白需要与第二个碱基相互作用，或者可以水解 m7GTP，因此在纯化过程中可能会遗漏一些帽相互作用物。琼脂糖连接到酶抗性帽类似物可以在该方案中替代。该方法允许用户识别参与帽依赖性翻译的新型氧调节翻译因子。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

平移控制正在成为基因表达的转录调节同样重要的一步，尤其是在细胞应激1期。翻译调控的一个重点是在（M 7 GTP）5'的mRNA 2帽引发的限速步骤，其中的蛋白质合成的第一个步骤涉及真核细胞起始因子4E（eIF4E的）的结合到7-甲基。 eIF4E的是一个名为eIF4F三聚体复杂，包括eIF4A，一个RNA解旋酶和eIF4G，对其他翻译因子和核糖体40S 3招聘要求支架蛋白的一部分。在正常生理条件下，绝大多数的mRNA经由帽依赖性机制翻译，但在细胞应激期间人类mRNA的约10％含有5'非编码区，可能允许不依赖帽的翻译intiation 1,4。帽依赖性翻译在历史上同义词OU中与eIF4F，但是，eIF4F的特定压力变化已经成为一个热门话题5-8。

各种细胞应激引起雷帕霉素通过复杂1（mTORC1的）的哺乳动物目标受到抑制eIF4E的活动。这种激酶变得在压力下，这导致在其目标之一的增加的活性受损，所述4E结合蛋白（4E-BP）。非磷酸化4E-BP结合eIF4E与阻断其与eIF4G引起帽依赖性翻译9,10的压制交往的能力。有趣的是，一个名为eIF4E2（或4EHP）的eIF4E的同源物具有4E-BP 11低得多的亲和力，或许允许它逃避压力介导的镇压。事实上，最初表征为翻译阻遏由于其缺乏与eIF4G 12相互作用，eIF4E2发起数百包含在其3'端非编码区的RNA缺氧反应元件的mRNA的低氧应激6,13-在翻译。这种激活我s至与eIF4G3，RNA结合蛋白基序4，和低氧诱导因子（HIF）2α构成低氧eIF4F复杂，或eIF4Fħ6,13-相互作用来实现的。如正常条件下的阻遏，eIF4E2结合与GIGYF2和ZNF598 14。这些复合物，在部分地通过琼脂糖联M 7 GTP的亲和树脂识别。这种传统方法15在翻译领域的标准，是最好的，最常用的技术，在下拉隔离帽结合复合物和体外结合试验16-19。作为帽依赖性翻译机器正在成为灵活性和适应性与间变化部分6-8,13，这种方法是一个强大的工具，迅速查明参与应激反应小说帽结合蛋白。此外，eIF4F的变化可能有广泛影响几个真核模型系统出现使用eIF4E2同源的应激反应等如拟南芥 20， 裂殖酵母 21， 果蝇 22和线虫 23。

有证据表明，在eIF4F变化可能不严格限于强调的条件，但参与正常生理学24。氧气供给到组织中（在毛细管两端）或组织中（通过微电极测定）从2-6％在脑中25而变化，在肺26 3-12％，在肠道27，在4％3.5-6％肝脏28，在肾脏29 7-12％，在肌肉30 4％，在骨髓中31 6-7％。细胞线粒体含有比1.3％的氧气少32。这些值比周围的空气，其中细胞常规培养更接近缺氧。这表明什么以前被认为是特定缺氧细胞过程可以是在生理环境相关。有趣的是，eIF4F和eIF4F ^ h 积极参与不同池或mRNA的类的翻译起始于暴露于生理氧或"physioxia"24几个不同的人细胞系。低氧也推动适当的胎儿发育33和电池通常具有较高的增殖率，寿命长，少的DNA损伤和physioxia 34较少的一般应激反应。因此，eIF4F H是可能在生理条件下选择的基因的表达的关键因素。

这里，我们提供了一个协议，以在固定的生理氧条件下或在这是可能的更具代表性的组织微环境的动态波动范围培养的细胞。这种方法的一个优点是，细胞在缺氧工作站内裂解。它是不是经常不清楚如何从缺氧细胞培养细胞裂解转变在其他协议执行。细胞常常首先从一个小缺氧孵化器中删除是前的裂解，但是这种暴露于氧气可能影响生化途径以氧气的细胞反应是快速（一个或两个分）35。某些帽结合蛋白需要用第二碱相互作用或能水解第m 7 GTP，因此一些帽交互件可在纯化过程被遗漏。琼脂糖联以酶促抗帽类似物可以在该协议被取代。探索通过这里描述的方法的活性和eIF4F H和eIF4F的其它变型的组合物将在该细胞中的生理条件或胁迫应答利用复杂的基因表达的机械线索。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.准备细胞培养

  1. 购买人细胞的市售股票。
    注:此协议利用HCT116结直肠癌和初级人肾小管上皮细胞（HRPTEC）。
  2. 使对HCT116的培养500毫升培养基:Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中补充有7.5％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素（P / S）/高葡萄糖培养基。
  3. 作出HRPTEC的培养500毫升培养基:补充有5％FBS，1％的上皮细胞生长添加物上皮细胞培养基和1％P / S。
  4. 制成500毫升之1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的:140 mM氯化钠，3毫米氯化钾，10毫的 Na 2 HPO 4，15mM的KH 2 PO 4。调节pH至7.4，并通过高压灭菌121℃40分钟灭菌。

2.细胞培养启动

  1. 小心吸从80-90％汇合盘介质，而不会干扰Ť他的细胞。
  2. 每培养皿等分试样3-5毫升1×PBS中，每个烧瓶轻轻摇动以覆盖培养皿的表面面积，并小心地吸出1×PBS中。重复第二1X PBS洗。
  3. 等分试样的3ml的0.05％胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（EDTA）到各培养皿并轻轻摇动以均匀涂层用胰蛋白酶-EDTA细胞。孵育在37℃下2-3分钟。
  4. 转移分离的细胞入15ml离心管中并离心以4,000 xg离心90秒。
  5. 在1毫升完全DMEM中悬浮细胞沉淀。
  6. 算使用血球细胞。计算需要多少无热原和聚苯乙烯百毫米细胞培养皿以达到每平方厘米大约2,500-5,000细胞的初始接种密度。
  7. 在步骤在37℃水浴中30-45分钟1.2或1.3制成预暖完整细胞培养基。
  8. 净化培养基瓶和细胞小瓶，用70％的乙醇。从这点向前所有操作要无菌条件下进行。
  9. 等分试样6毫升完全DMEM成使用在步骤2.6中提到的接种密度内冷冻细胞的整个体积需要作为100多MM细胞培养皿。
  10. 传送在步骤2.6到每个100mm的培养皿计算细胞悬浮液的体积。手动摇动每个板到板的表面上均匀地分布的细胞。
  11. 放置在孵化器中播种百毫米细胞培养皿于37℃在5％CO 2气氛中 。允许的下一步骤之前细胞孵育至少24小时。

3.继代培养

  1. 查看在显微镜下各细胞培养皿以确定细胞汇合的（％细胞覆盖培养皿的面积）的比例。返回细胞的孵化器和预温完全培养基和1x PBS。继续进行下一步骤，如果所述细胞是80-100％汇合。
  2. 小心吸出用过的培养基，而不会干扰细胞在每个培养皿中。
  3. 每培养皿等分试样3-5毫升1×PBS中，每个烧瓶轻轻摇动以覆盖培养皿的表面面积，并小心地吸出1×PBS中。重复第二1X PBS洗。
  4. 等分试样3毫升0.05％胰蛋白酶-EDTA的到各培养皿并轻轻摇动以均匀涂层用胰蛋白酶-EDTA细胞。孵育在37℃下2-3分钟。
  5. 在此孵化，分装在规定的10 ml完全培养基到尽可能多的培养皿获得每平方厘米2 2,500-5,000细胞的细胞密度。
  6. 当细胞已经从板取下，迅速加入3毫升1×定义胰蛋白酶抑制剂和轻轻摇动培养皿1分钟，以确保所有的胰蛋白酶-EDTA的已中和。
  7. 转移分离的细胞进入无菌15ml离心管中，放在一边。添加3毫升1×PBS中的菜，以收集任何残留的细胞，并传送到相同的15ml离心管中。
  8. 通过离心150 XG颗粒细胞5分钟。
  9. 吸出上清液，重悬细胞沉淀在3毫升完全培养基。
  10. 算使用血球细胞和种子含有15 ml完全培养基，得到每平方厘米2,500-5,000细胞的细胞密度150毫米培养皿。使用两个150毫米每个帽结合试验。
    注:通过液体介质氧扩散到细胞是依赖于量36。它建议保持实验之间保持一致的介质的体积是否使用在悬浮粘附细胞或细胞。媒体可以预调节（在工作站孵育如讨论讨论24小时），以避免在扩散这些变异。
  11. 放置在孵化器中播种培养皿于37℃在5％CO 2气氛中 。允许在进行下一步骤之前，细胞孵育至少24小时。

4. Physioxic曝光

  1. 查看在显微镜下的细胞。对于BES吨的结果，确保细胞是一个24小时曝光70-80％汇合，50-60％汇合为一个48小时的曝光，而对于72小时曝光40-50％汇合。
  2. 放置细胞进入所需时间（24，48，或72小时取决于实验）缺氧工作站。
  3. 设置工作站到适当physioxia。
    注:例如，3％O 2的设置将5％ 的 CO 2和92％N 2陪同。
    注:如果动态范围内的氧气波动具体时间表，节目时间表所希望的过到仪器或手动调节在所需的时间间隔中的氧设置。
  4. 湿度设定为60％。该工作站的气氛非常干燥尽管如此，和媒体将在很长的实验（> 48小时）显着蒸发。保持在细胞培养烧瓶介质储备在工作站内（使介质与工作站中平衡），以补充介质在细胞培养DIS他是。
    注意:任何解决方案，将与之前的裂解（例如PBS和胰蛋白酶-EDTA）的细胞相互作用应预调节24小时的缺氧工作站内使用前，使溶解氧与大气中的氧气36达到平衡。
  5. 保持工作站，直到裂解细胞内。

5.准备缓冲器，用于帽结合测定

  1. 制备1×Tris-缓冲盐水（TBS）。
    1. 在800毫升的dh 2 O中，溶解8.76克NaCl和6.05克Tris碱。
    2. 使溶液以使用1M的HCl的7.4的最终pH值。
    3. 使终体积到使用DH 2 O 1升
  2. 制备非变性裂解缓冲液。制备裂解缓冲帽结合测定当天。作出额外的裂解液洗空白琼脂糖珠和γ氨基苯基M 7 GTP琼脂糖C10联珠（步骤7.9和7.13）。
    1. 7毫升的dh 2 O，加160微升5米NAC升，160微升的1M的Tris-HCl pH 7.4的40微升的200mM的NaF，40微升的1M MgCl 2的，和40微升1 1mM原钒酸钠。
    2. 添加40微升的Igepal至7 ml溶液。切吸管尖，以帮助找回的Igepal，因为它是非常粘稠。
    3. 吹打向上和向下，或涡流混合，7 ml溶液，直到所有的Igepal已经解散。
    4. 升高溶液至8毫升的最终体积，并保持在冰上。
  3. 准备4X十二烷基硫酸钠（SDS）-PAGE样品缓冲液。
    1. 在一个烧杯中，将结合16毫升的1M的Tris-HCl pH 6.8的，12.64毫升甘油，和8毫升二硫苏糖醇（DTT）。
    2. 添加3.2克SDS和0.16g溴酚蓝。允许粉末通过用磁力搅拌棒混合充分溶解。
    3. 分装成的1.5 ml离心管中并储存在-20°C。

6.细胞裂解

  1. 制备非变性裂解缓冲液，并保持在冰上日的日Ë帽结合试验。
  2. 预暖1×PBS中和胰蛋白酶在37℃水浴中30分钟。
  3. 正在执行等分试样980微升裂解缓冲液成每个帽结合测定1.5ml微量离心管中。
  4. 添加4-（2-氨基乙基）苯磺酰氟盐酸盐的10微升和10微升100×蛋白酶抑制剂鸡尾酒的到980微升裂解缓冲液中。置于冰上。
  5. 丢弃以150毫米的菜媒体在缺氧工作站内的废弃物容器中。
  6. 清洗细胞3-4毫升温1X PBS，并放弃所有的液体。
  7. 1毫升温暖0.05％胰蛋白酶-EDTA添加到每个培养皿让坐在2分钟，或直至细胞不再附着到板上。
  8. 使用移液管，一个板的细胞转移到1.5ml微量离心管中。根据需要，使细胞的每个板被转移到一个单独的1.5 ml离心管重复。
  9. 离心1.5 ml离心管在6000 XG 90秒ŤØ颗粒细胞。
  10. 吸用吸管胰蛋白酶，而不会干扰沉淀。如果颗粒被干扰，重新离心1.5 ml离心管在6000×g离心90秒。
  11. 轻轻吹打200微升PBS的入管刚好沉淀上述要用温水1X PBS细胞。重新离心如果粒料被干扰。
  12. 吸出PBS，而不会干扰沉淀。
  13. 从1毫升吸管将500μl制备的裂解缓冲溶液到第一蜂窝沉淀。完全由上下吹打悬浮颗粒。
  14. 结合重悬的细胞与所述第二细胞沉淀并通过上下抽吸悬浮所述第二沉淀。直到所有的粒料已经被组合和再悬浮每个样品重复此过程。
  15. 结合裂解物与在1.5ml微量离心管中剩余的500μl的裂解缓冲液中。
  16. 从缺氧工作站删除样本。
    注:加入裂解缓冲液之后，将LL后续步骤如缺氧工作站被设定为37℃及以下的步骤将被执行的冷（4℃或冰上）在环境空气中进行。
  17. 裂解用轻轻搅动在4℃下旋转样品1.5-2小时的细胞。
  18. 离心裂解的细胞以12,000 xg离心15分钟，在4℃以除去细胞碎片。
  19. 转移裂解物到新的1.5 ml离心管并弃沉淀。
  20. 保留上清的一部分（5-10％），以用作将来Western印迹分析全细胞裂解物的输入控制。

7.帽结合测定

  1. 对于每个样品，转移空白琼脂糖珠控制浆料的50微升和50微升γ氨基苯基-间7 GTP琼脂糖C10联珠浆液以分离1.5ml微量管中。用剪刀取出吸移管的尖端，以便于珠浆的汇编。
  2. 颗粒珠bý离心在500 xg离心浆液30秒。
  3. 小心地取出上清，500微升TBS重悬珠。
  4. 重复步骤7.2和7.3。沉淀小珠，在500×g离心30秒，并去除上清。
  5. 从步骤6.19传送包含裂解物上清液到包含空白琼脂糖珠的1.5 ml离心管。
    注:空白琼脂糖珠充当信息预先步骤，以从非特异性地与胎圈交互的裂解物除去蛋白质。
  6. 孵育在4℃下10分钟，温和搅拌。
  7. 通过在500 xg离心离心30秒沉淀空白琼脂糖珠。
  8. 转移裂解物到含有γ氨基苯基-间7 GTP琼脂糖C10联珠的1.5 ml离心管。
  9. 通过再悬浮于500μl裂解缓冲液的珠子，通过在500 xg离心离心30秒造粒的珠，并丢弃superna洗空白琼脂糖珠重要的。重复此四次总共五个洗涤。
  10. 重悬在1×SDS-PAGE样品缓冲液空白琼脂糖珠，并在95℃下沸腾的珠90秒。储存在-20℃下以供将来Western印迹分析，观察感兴趣的蛋白质是否结合非特异性到胎圈。
  11. 孵育轻轻摇动的γ氨基苯基-间7 GTP琼脂糖C10联珠1小时的溶胞产物在4℃下以捕获帽结合蛋白。
  12. 通过在500 xg离心离心30秒沉淀γ氨基苯基-间7 GTP琼脂糖C10联的珠。弃去上清液。
  13. 通过重复步骤7.9洗γ氨基苯基-间7 GTP琼脂糖C10联的珠。
  14. 重悬在600微升裂解缓冲液的珠子。
  15. 添加GTP到1mM的终浓度。
  16. 孵育γ氨基苯基-间7 GTP琼脂糖C10联珠+ 1mM的GTP轻轻搅动在4℃下1小时。注:此将离解非特异性具有m 7 GTP相互作用的蛋白质（ 即，也与非甲基GTP交互）。
  17. 通过在500 xg离心离心30秒沉淀γ氨基苯基-间7 GTP琼脂糖C10联的珠。
  18. 将上清转移至新的1.5 ml离心管，加入200微升4×SDS-PAGE样品缓冲液（50mM的Tris-HCl，100mM的DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝和10％甘油）中的。储存在-20℃下对GTP对照样品供将来免疫印迹分析37。重复步骤7.9洗珠。
  19. 重悬在1×SDS-PAGE样品缓冲液（50mM的Tris-HCl，100mM的DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝和10％甘油）中，并煮沸珠粒在95℃下90秒。储存在-20℃第m 7 GTP结合的级分以供将来免疫印迹分析37。

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结果

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在一个m 7 GTP亲和柱的响应eIF4E与eIF4E2氧帽结合力分析

图1和2表示响应于氧的波动在两个人细胞系中两个主要的帽结合蛋白的典型M 7 GTP的亲和纯化的蛋白质印迹:原代人肾小管上皮F中igure 1和大肠癌细胞（HRPTEC）（ HCT116）在图2中。细胞维持在所指示的氧气供应24小时，以确保在液体介质中的溶解的氧已与缺氧工作站内的空气平衡。输入车道（IN）表示的全细胞裂解物的10％的M 7 GTP联琼脂糖珠加入到捕获帽结合蛋白之前。此输入车道用作基线测量富集的在第m 7 GTP下拉靶蛋白。对GTP车道是从m 7 GTP珠子用1mM GTP分别洗脱的洗脱物。这个步骤允许检测还识别非甲基化的GTP蛋白。...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在暴露于生理氧条件的人细胞帽结合蛋白质的分析可允许的新颖氧 - 调节翻译起始因子的鉴定。这些因素为mRNA或其它帽相关蛋白的5'帽的亲和性可以通过其关联的强度被测量到m 7 GTP联的琼脂糖珠。这种技术的一个需要注意的是它测量蛋白裂解后的帽结合的潜力，但它是该保持蛋白质 - 蛋白质相互作用和翻译后后修饰非变性条件下进行。几个蛋白 - 蛋白相互作用介导的eIF4E家族的5'帽的结合。该4E-BP结合并阻断其与eIF4G相互作用和防止43S-开始前38复杂的招聘压抑eIF4E的。所述的eIF4E / 4E-BP复杂保持结合到5'表达帽，从转录阻止任何引发，并能用作eIF4E的抑制以m 7 GTP亲和柱的标记。相反，eIF4E的与eIF4G对M 7 GTP列的相互作用可能是积极的翻译起始的标志。翻译后修饰是调节的翻译起始因子的活性的另一种方法。例如，通过抑制Mnk1的eIF4E的磷酸化可以增加其亲合力的5'的mRNA帽39。由干扰素刺激基因15（ISG15）编码的蛋白质改性剂是增加在经由病原体感染

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提交人声明，他们没有竞争的经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了加拿大自然科学与工程委员会和安大略省研究与创新部的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
&γ;-氨基苯基-m7GTP琼脂糖C10-连接珠子Jena BioscienceAC-1555琼脂糖连接m7GTP
100 mm培养皿康宁87722210 cm培养皿
150 mm培养皿Thermofisher13018315 cm培养皿
AEBSF HydrochlorideACROS有机物A0356829AEBSF
琼脂糖微珠Jena Bioscience AC-0015琼脂糖珠对照
溴酚蓝FisherBP112-25SDS-PAGE 上样缓冲液的成分
1.5 ml 离心管FroggaBio1210-00S用于离心小体积
15 ml 锥形离心管Fisher1495970C用于培养原代细胞
确定的胰蛋白酶抑制剂FisherR007100DTI
二硫苏糖醇FisherBP172-25DTT
上皮细胞培养基（完整试剂盒）ScienCell4101包括血清和生长因子补充剂）
甘油FisherBP229-1SDS-PAGE 上样缓冲液的成分
100 mM 鸟苷 5'-三磷酸，1 mlJena Bioscience272076-0251MGTP
HCT116结直肠癌ATCCCCL-247人癌细胞系
人肾近端肾小管上皮细胞ATCCPCS-400-010HRPTEC
Hyclone DMEM/高葡萄糖GE 生命科学SH30022.01人细胞培养标准培养基
Hyclone 青霉素-链霉素溶液GE 生命科学SV30010DMEM
H35 HypOxystationHypoxygenN/A缺氧工作站
Igepal CA-630MP 生物医学2198596裂解缓冲液的洗涤剂成分
磷酸二氢钾Fisher P288-500KH2PO4
氯化钾FisherP217-500KCl
氯化镁FisherM33-500MgCl<亚>2
氯化钠FisherBP358-10NaCl
氟化钠Fisher5299-100NaF（裂解缓冲液的磷酸酶抑制剂成分）
磷酸二钠Fisher5369-500Na2HPO4
Premium 级胎牛血清血清1500-500FBS
蛋白酶抑制剂混合物 （100x）细胞信号传导58715裂解缓冲液组分
十二烷基硫酸钠FisherBP166-100SDS
原钒酸钠Sigma56508Na3VO4
Tris 碱FisherBP152-5缓冲液
0.05% 胰蛋白酶-EDTA （1x）Life Technologies2500-067胰蛋白酶用于分离贴壁细胞
的抗生素成分组分

参考文献

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