通过神经残端将钙染料载入蛙类神经末梢：蛙类神经肌肉接头中钙瞬变的记录

摘要

本文介绍了一种通过蛙类神经残端将钙敏感性染料加载至神经末梢的方法。同时，我们还提供了一套用于记录和分析外周神经末梢快速钙瞬变的实验方案。

摘要

测量突触前神经末梢内突触前钙水平最可行的方法之一是光学记录法。该方法基于使用钙敏感性荧光染料，其发射光的强度或波长会随细胞内游离钙浓度的变化而改变。目前有多种方法可用于将钙染料标记到细胞中，最常见的是通过微移液管将染料注入细胞，或预先用染料的乙酰氧基甲酯（acetoxymethyl ester）形式进行孵育。然而，由于方法学上的限制，这些方法在神经肌肉接头（NMJs）中的应用受到一定限制。本文介绍一种通过蛙类神经残端将钙敏感性染料导入神经末梢的方法。由于外部钙离子进入神经末梢并结合钙染料的过程发生在毫秒时间尺度内，因此必须使用快速成像系统来记录这些动态相互作用。本文中，我们描述了一种利用高速CCD相机记录钙瞬变的实验方案。

引言

钙离子（Ca²⁺）参与多种神经元信号传导过程，包括递质释放的启动、维持以及可塑性^1,2,3,4,5。当动作电位到达时，细胞外的 Ca²⁺ 进入神经末梢，从而启动神经递质的释放。在某些突触中，钙电流可通过电生理学方法直接测量^6,7,8。然而，在神经肌肉接头（NMJ）处，由于神经末梢尺寸极小，无法使用直接的膜片钳或双电极电压钳技术进行测量。

可通过间接电生理学方法记录神经肌肉接头（NMJ）神经末梢的内向Ca²⁺电流^9,10。然而，这些方法需要预先使用钠离子和钾离子通道阻断剂处理突触。光学方法则无需对神经末梢中的离子电流进行药理学分离，能够记录由动作电位触发的Ca²⁺内流以及随后轴浆中Ca²⁺离子浓度的升高^11,12,13,14。这些方法基于特异性Ca²⁺敏感性染料在结合游离Ca²⁺离子后荧光信号变化的记录^{15,16,17,18,19}。

根据实验目的的不同，可通过多种方法将Ca²⁺指示剂载入细胞。研究人员常采用灌流方式施加膜通透性染料^20,21、通过膜片钳电极加载²²，或进行显微注射^23,24,25。然而，由于神经肌肉接头（NMJ）在突触结构上的特殊性，上述所有方法在应用于NMJ时均存在一定局限性。对于NMJ而言，最方便且成功的方法是通过神经残端加载染料，即顺向填充法^26,27,28,29。该技术可用于将多种荧光染料载入外周神经末梢。此方法已成功应用于果蝇（Drosophila）神经末梢²⁸、蜥蜴运动神经²⁸以及蛙类运动神经末梢^17,26,27,30。根据研究对象的不同，具体操作细节可能有所调整。对于幼虫的小神经，可使用玻璃微电极进行操作²⁸。已有若干研究人员描述过一种方法^27,28，即将支配肌肉的神经新鲜切断端浸入预先盛有染料的小孔中，随后将标本静置数小时以使染料充分浸入。染料被轴突吸收后，可顺向运输至神经末梢。本文中，我们介绍一种通过神经残端将荧光指示剂载入蛙类运动神经末梢的方法。本实验方案采用塑料移液器吸头作为组织与染料共孵育的容器。同时，我们也描述了如何采集和分析Ca²⁺ 荧光瞬变信号。

方案

实验采用Rana ridibunda蛙的musculus cutaneous pectoris（胸皮肌）离体神经-肌肉标本进行。雌雄个体体长约为5–9 cm。实验操作遵循喀山联邦大学和喀山医科大学关于实验动物使用指南，并符合美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》的要求。实验方案符合欧洲共同体理事会指令86/609/EEC的规定，并经喀山医科大学伦理委员会批准。

1. 溶液的配制

1. 任氏液的配制。
   1. 配制任氏液：113.0 mM NaCl、2.5 mM KCl、3.0 mM NaHCO₃ 和 1.8 mM CaCl₂。调节 pH 至 7.2–7.4。
   2. 配制低 Ca²⁺ 高 Mg²⁺ 的任氏液：113.0 mM NaCl、2.5 mM KCl、3.0 mM NaHCO₃、6.0 mM MgCl₂、0.9 mM CaCl₂。调节 pH 至 7.2–7.4。
2. 染料负载溶液的配制。
   1. 配制含 10 mM HEPES-Na 的水溶液（pH 7.2–7.4）。
   2. 向含有染料³⁰的小瓶中加入 14 µL HEPES 溶液。
      注意：Ca²⁺ 指示染料为每瓶 500 µL，含 500 µg 粉末。
   3. 涡旋混匀后离心，确保充分混合。
   4. 稀释溶液，使 Ca²⁺ 指示剂的终浓度为 30 mM。避免光照，于 -20 °C 保存。

2. 染料负载步骤

1. 用一块组织分离胸皮肌 胸肌 proprius 神经
   注意：解剖步骤详见Blioch发表的论文免费下载版本 等, 1968³¹.
   1. 解剖操作时，使用两把精细镊子和角膜剪（参见 材料表将解剖后的组织转移至预先加入林格液的硅胶弹性体包被培养皿中，并用细不锈钢针固定组织，使其在培养皿中呈轻微拉伸状态。
   2. 重新用一份新鲜的任氏液填充培养皿。去除结缔组织，注意不要损伤神经。
2. 准备填充移液管：使用剃刀刀片，从标准塑料10 µL移液器吸头的锥形部分切下一段长约2 mm的片段。
3. 准备一块油灰用于将充液毛细管固定在培养皿上。
4. 通过硅胶管和由移液枪头制成的塑料连接适配器，将填充移液管的后端连接至塑料注射器。
5. 在染料加载程序之前，使用塑料移液管从培养皿中移除任氏液。用精细的注射器将肌肉-神经标本吸干；这可以防止钙指示剂被稀释²⁺ 染料在随后填充移液管的上样过程中。
6. 去除 Ca²⁺ 从冷冻箱中取出指示剂小瓶，置于避光处室温下解冻。
7. 在体视显微镜下以低倍率（10×）观察，辨认肌肉与神经的连接处。使用精细镊子和剪刀剪断 胸肌 proprius 神经靠近肌肉表面处（见步骤2.1），保留约2 mm长的神经残端。
8. 使用油灰固定连接在管路和注射器上的填充移液管，并将其固定在培养皿上。
9. 将移液器尖端移至靠近神经残端处。
10. 在不夹捏的情况下，轻柔地将神经残端吸入灌注移液管的尖端。
11. 将吸液管从填充移液管的钝端取下。
12. 使用带有长针头的注射器小心吸除填充移液管中的多余溶液（参见 材料表不要夹捏神经残端。
13. 将灌注移液管的尖端略微垂直上提，同时保持神经残端被吸入在尖端内。
14. 使用凡士林将神经残端被抽吸部分与填充移液管尖端外部隔绝。
15. 必要时干燥填充移液管中绝缘的神经残端：使用带长针头的注射器轻轻抽吸填充移液管中多余的溶液。
16. 使用带有长枪头的移液器吸取0.5 µL染料加载溶液（见步骤1）。
17. 将装有上样溶液的移液枪头轻轻插入灌注毛细管中，直接将混合液排出至神经残端。
18. 用凡士林密封填充移液管的开口端。
19. 向培养皿中加入少量林格氏液，以保持标本湿润。
20. 在室温、避光且湿润的条件下孵育样品5小时。
21. 移除装有加载溶液的填充移液管，用任氏液冲洗制备样本，并于4 °C冰箱中过夜保存。

3. 显微镜观察前的组织制备

1. 将制备好的样本放入涂有硅胶弹性体的腔室中，并用钢制微针固定，使其轻微拉伸。
2. 用一份新鲜的任氏液冲洗组织。
3. 使用吸吮电极刺激神经；电极的构建方法可从Kazakov et al., 2015³² 的论文免费下载获取。将电极尖端置于神经切断端附近，并将神经残端吸入电极孔中。
4. 将制备腔室安装在显微镜载物台上。将温度探头以及灌流液的进液和出液管路置于腔室内。
5. 将电源线连接至帕尔贴元件。
6. 采用简单的重力驱动系统对样本进行灌流。为去除多余液体，开启灌流吸引泵。
7. 打开温控装置。
8. 将温度设定为 20 °C。
9. 安装紫外防护罩。
10. 将刺激导线电极连接至电刺激器，并在显微镜下使用 4× 物镜观察肌肉收缩。
11. 用低 Ca²⁺、高 Mg²⁺ 的任氏液填充灌流系统。
    注意：该溶液用于防止肌肉收缩。降低细胞外钙浓度并提高细胞外镁浓度可减小 Ca²⁺ 瞬变的幅度。然而，根据以往经验，0.9 mM CaCl₂ 和 6 mM MgCl₂ 仍足以可靠地检测 Ca²⁺ 瞬变的幅度。需要指出的是，也存在其他一些在不降低 Ca²⁺ 浓度的情况下抑制肌肉收缩的方法。例如，使用 d-筒箭毒碱或 α-银环蛇毒素（烟碱型乙酰胆碱受体的特异性阻断剂）可完全或部分阻断肌肉抽搐^17,27,28,30。然而，添加这些毒素也可能影响突触前钙离子内流³³。为避免此问题，可使用 µ-芋螺毒素 GIIIA²⁷。
12. 启动泵，开始用低 Ca²⁺、高 Mg²⁺ 的任氏液对样本进行灌流。
13. 切换至显微镜的 40× 物镜。
14. 打开单色器（参见材料表）。
15. 在单色器控制软件中选择 488 nm 的发射波长，并设置为连续照明模式。
16. 在荧光模式下使用高倍镜观察，确认神经末梢已成功加载染料。

图1：载有Ca²⁺指示剂的神经及神经末梢。（A）加载程序完成后，神经内充满Ca²⁺指示剂。比例尺 = 200 µm。（B）神经末梢中充满Ca²⁺指示剂。比例尺 = 20 µm。（C）神经末梢中可清晰观察到Ca²⁺指示剂的荧光信号。比例尺 = 20 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

17. 将制备物置于低Ca²⁺高Mg²⁺溶液中，至少平衡30分钟。

4. 使用数字CCD相机进行视频采集

注意：捕获荧光信号的细节因显微镜和相机类型的差异而有所不同，但关键因素是图像采集速度。

1. 在记录神经肌肉接头（NMJ）单个 Ca²⁺ 瞬变时，应使用 1 kHz 作为最低采集频率。
   注意：荧光成像需要使用高速数字 CCD 相机（参见材料表）。此处使用数据采集系统及配套软件（参见材料表）实现相机、单色器和刺激器的同步。简而言之，本方案通过数据采集系统的数字输出生成同步脉冲，以控制快门开启、视频信号采集和刺激启动。所有时间参数均可在实验协议和/或设备上进行设置。典型的采集方案为以 1 kHz 采集 500 帧图像（80 × 80 像素）。激发光照射可能导致 Ca²⁺ 指示剂漂白并对细胞组织造成光损伤，因此应避免长时间暴露于激发光下。在本方案中，快门仅在采集视频所需的时间内开启。每个特定神经末梢需采集 20 组序列。本步骤的目标是在对照组和给药后持续监测相同位点。
2. 在显微镜 4X 物镜下，使用明场模式观察肌肉和神经分支。
3. 切换至 40X 物镜，使用落射荧光模式并设置激发波长为 488 nm，寻找染料标记的神经末梢，确定感兴趣的神经末梢区域。
4. 在显微镜三目镜筒上，选择光路切换档位：100% 光线导向相机。
5. 启动 CCD 相机的采集软件。
6. 在“实时”模式下，找到感兴趣区域（ROI）并调节焦距。
7. 选择菜单中的“更改”设置。
8. 使用“基本配置”，设置帧速率为每秒 1,000 帧（fps），分辨率为 80 × 80。
9. 设置输入帧数为 500 帧。
10. 输入实验名称。
11. 选择“外部触发”模式。
12. 将触发前时间设置为 10 ms。
13. 设置重复次数为 20 次。
14. 在单色器控制软件中，选择发射波长为 488 nm，并启用“外部触发照明”模式。
15. 运行数据采集软件。
16. 加载刺激方案。
17. 在录制视频前，使用视频采集软件采集暗场图像。
18. 运行刺激方案。
19. 选择感兴趣区域（ROI）并检查所记录的信号。

5. 数据分析

注意：进行数据分析时，使用CCD相机软件和ImageJ；数据在电子表格程序中以曲线形式呈现。在CCD相机软件中，对20次重复进行平均，并将结果导出为ImageJ支持文件。在ImageJ中，选择感兴趣区域（ROI）和背景区域。从ROI中减去背景信号。将数据表示为比率形式：(ΔF/F₀ -1) × 100%，其中ΔF为刺激期间的荧光强度，F₀为静息状态下的荧光强度。

1. 在CCD相机的采集软件中，点击文件 > 平均文件。选择文件并对其进行平均处理。
2. 点击“另存为Fit文件”，将平均后的文件保存为.fit文件。
3. 运行ImageJ软件。执行以下步骤：
4. 点击图像 > 调整 > 亮度/对比度。
5. 点击图像 > 图像栈 > 工具 > 图像栈排序器。
6. 点击分析 > 工具 > ROI管理器。
7. 将平均后的.fit文件拖放到ImageJ窗口中。
8. 放大窗口以获得更清晰的视图。
9. 通过移动光标，选中最后一帧并将其删除（此为暗帧）。
10. 在被认为属于背景的区域上选择一个矩形ROI，并将其添加到ROI管理器中。
11. 点击更多 > 多次测量，以测量背景。记录MEAN值。复制数据并导出至电子表格程序，计算用于比率的阈值平均值。
12. 点击处理 > 主要功能 > 减去，从图像栈中减去该阈值。输入计算得到的阈值平均值。
13. 在神经末梢周围选择一个矩形ROI，并将其添加到ROI管理器中。
14. 点击更多 > 多次测量进行测量。记录MEAN值，并将其复制并导出至电子表格程序。
15. 对信号的偏移量进行平均。
    注意：使用前几十个未受刺激时显示基础染料荧光的点；此即静息状态下的荧光。
16. 将信号除以静息状态下的荧光值。
17. 减去“1”后乘以100%。
18. 绘制信号曲线，并计算Ca²⁺瞬变信号的幅度。

结果

染料负载后，在运动神经受到刺激时，可在神经末梢检测到荧光信号（Ca²⁺瞬变）幅度的增加（见图2）。Ca²⁺瞬变的参数列于表1。定量而言，本研究中测得的Ca²⁺瞬变参数与先前其他科研人员在冷血动物突触上获得的数据相近^15,34。Ca²⁺瞬变的参数取决于Ca²⁺与染料结合及其后续解离的速率。Ca²⁺进入神经末梢的速率、与染料的相互作用以及在细胞质中的扩散均会影响Ca²⁺瞬变上升时间。荧光信号的衰减时间则取决于染料的亲和力、Ca²⁺与细胞内缓冲物质相互作用的速度以及离子泵的清除速率³⁵。通过分析Ca²⁺瞬变的幅度，可用于研究各种物质对参与神经递质释放的钙离子内流的影响³³。

图2：在蛙类神经肌肉接头处测得的平均Ca²⁺ 瞬变信号。 Ca²⁺瞬变信号是基于13个蛙类神经肌肉接头信号的平均值计算得出的。请点击此处查看该图的放大版本。

峰值 ΔF/F (%)	上升时间 20%-80% (ms)	τ (ms)
12.6 ±1.1 (n = 13)	4.6 ±0.5 (n = 13)	115.3 ±8.3 (n = 13)

表1：Ca²⁺瞬变的平均参数。 数据以均值 ± 标准误表示；n 为不同神经肌肉接头（NMJ）中的测量次数。峰值 ΔF/F 为 ΔF/F 的平均振幅。

讨论

在本文中，我们介绍了进行 Ca²⁺-通过神经残端将对敏感性染料加载至蛙类神经末梢。在染料加载过程结束时，神经近端部分的所有末梢均显示出显著的荧光水平。据估计，末梢内的探针浓度在40至150 µM之间¹⁷.

孵育过程分为两个步骤：首先在室温下进行，然后在冰箱中较低温度下继续。控制组织在室温下与染料孵育的时间非常重要。根据神经残端的实际长度、所用染料的种类以及温度的不同，孵育时间可能有所变化。如果孵育时间过长，靠近神经残端近端的末梢可能会过度负载。然而，在神经的中段，仍有可能找到染料负载情况满意的末梢。在冰箱中长时间孵育过程中，染料会均匀分布于神经末梢。

我们自己的观察结果^33,35以及其他研究者的数据³⁰均证明，染料加载过程对突触后反应的幅度或微型终板电位的频率均无明显影响。在已加载的标本中，观察到了良好的长期存活性。我们希望强调一些重要的注意事项。在神经切除后数分钟内必须将神经残端放入染料加载溶液中，以使染料能够进入切断的神经轴突；延迟操作可能导致加载效率低下，这可能是由于神经轴突发生再封闭所致^27,36。一些研究者在切除神经后立即将其残端浸入100 mM EDTA（一种Ca²⁺和Mg²⁺螯合剂）中，以防止切断的轴突再封闭。1-2分钟后去除缓冲液，并替换为染料加载溶液³⁷。在加载过程中使用石蜡油围成的凹槽而非塑料套管，可允许使用更短的神经残端。采用该方法时，在神经浸入含染料的HEPES溶液后才进行切断，由于染料溶液中缺乏二价离子，轴突不会发生再封闭^27,28。

在本研究中，我们采用了水溶性的 Ca²⁺ 指示剂盐形式，而非葡聚糖形式。与盐形式相比，葡聚糖偶联物在轴突中的扩散速度较慢。然而，使用葡聚糖偶联物可减少染料在神经及神经肌肉接头处的区室化现象和细胞处理。钙绿素 Green 1-3,000 MW 葡聚糖偶联物具有良好的扩散速率，并表现出较低的区室化倾向³⁸。

避免对组织进行长时间的荧光照射非常重要，因为这会影响其健康和存活。我们在可见光通道中使用诺马尔斯基光学器件来寻找神经末梢。在记录过程中，我们使用光圈来限制照明视野。

值得注意的是，这种加样方法仅适用于能够耐受长时间孵育的样本。当对较为脆弱的组织（例如，温血动物的突触）进行研究时，为缩短染料加载时间，有必要缩短神经残端长度，并使用微管吸头进行加样^29,39。

这种加载技术非常适合在单次神经刺激和节律性突触活动条件下，利用荧光指示剂对胞质内Ca²⁺的变化进行成像^17,27,35。通过分析Ca²⁺瞬变幅度，可用于研究不同物质对参与神经递质释放的钙离子内流的影响³³。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ca2+ 指示剂	Molecular Probes, USA	Oregon Green 488 BAPTA-1 六钾盐, O6806	500 μg
硅橡胶弹性体	Dow Corning, USA	Sylgard 184 弹性体
移液器	Biohit, Russia	720210	0.5-10µL
移液器吸头	Fisher Scientific, USA	02-707-175	10µL
移液器吸头	Biohit, Russia	781349	10µL
剃须刀片	Fisher Scientific, USA	12-640
微型固定针	Fine Science Tools, Canada	26002-20
角膜微型剪刀	MT MEDI CORP, Canada	S-1111
珠宝匠镊子	MT MEDI CORP, Canada	F-9610
珠宝匠镊子	MT MEDI CORP, Canada	F-9611
模型黏土	本地生产商		可由任何本地生产商的产品替代
凡士林	本地生产商		可由任何本地生产商的产品替代
Microspin FV 2400	Biosan, Latvia	BS-010201-AAA
Multi-spin MSC 3000	Biosan, Latvia	BS-010205-AAN
一次性皮下注射针头	Bbraun	100 Sterican	0.4×40 mm
注射器	本地生产商		0.5 ml
HEPES	Sigma-Aldrich, USA	H0887	100 ml
显微镜，BX51	Olympus, Japan
数据采集系统	Molecular Devices, USA	Digitdata 1550
软件	Molecular Devices, USA	pClamp 软件，版本 10	协议可从以下网址下载：http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro
浴槽及浴槽温度控制器	Experimental Builder		可用任何带温度控制的灌流槽替代。例如来自 https://www.warneronline.com/
单色仪	Till Photonics, Germany	Polychrome V	已不再供应，可由其他适用于 488 nm 的稳定光源替代
单色仪控制软件	Till Photonics, Germany	Polycon
数字 CCD 相机	Redshirt Imaging, USA	Neuro CCD SMQ
Model 2100 隔离脉冲刺激器	A-M Systems, USA
CCD 相机采集软件	Redshirt Imaging, USA	Turbo SM 软件
ImageJ	美国国立卫生研究院，USA		http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
电子表格程序	Microsoft, USA	Microsoft Office Excel