表观遗传因素可与遗传程序相互作用，从而调控基因表达并调节B细胞功能。通过结合 体外 B细胞刺激、qRT-PCR以及高通量microRNA测序和mRNA测序方法，可用于分析B细胞中miRNA和基因表达的表观遗传调控。
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方法文章
全基因组分析 HDAC 抑制剂对诱导 B 细胞发生类别转换 DNA 重组及浆细胞分化过程中 microRNA 和 mRNA 的调控作用
本文内容
摘要
摘要
抗体反应通过多种B细胞内在的关键过程实现，包括体细胞高频突变（SHM）、类别转换DNA重组（CSR）以及浆细胞分化。近年来研究表明，表观遗传修饰或因子（如组蛋白去乙酰化和微小RNA（miRNA））可与B细胞的遗传程序相互作用，从而调控抗体反应；而表观遗传因子的功能障碍则被发现可导致自身抗体反应的发生。分析B细胞在表观遗传调节剂作用下全基因组miRNA和mRNA的表达情况，对于理解B细胞功能及抗体反应的表观遗传调控机制具有重要意义。本文中，我们展示了一种诱导B细胞进行类别转换重组和浆细胞分化的实验方案，对这些B细胞使用组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂（HDI）处理，并分析mRNA和miRNA表达水平的方法。在该方案中，我们直接利用下一代mRNA测序（mRNA-seq）和miRNA测序（miRNA-seq）技术对互补DNA（cDNA）序列进行分析，将测序读段比对至基因组，并结合定量反转录（qRT）-PCR进行验证。通过这些方法，我们明确发现，在诱导发生类别转换重组和浆细胞分化的B细胞中，作为表观遗传调控因子的HDI可选择性地调节miRNA和mRNA的表达，并影响类别转换重组及浆细胞分化过程。
引言
表观遗传标记或因子（如DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰以及非编码RNA（包括microRNA））通过调控基因表达来调节细胞功能1。表观遗传修饰可调控B淋巴细胞的功能，例如免疫球蛋白类别转换DNA重组（CSR）、体细胞高频突变（SHM）以及向记忆B细胞或浆细胞的分化，从而影响抗体和自身抗体的应答2,3。CSR和SHM过程高度依赖于活化诱导的胞苷脱氨酶（AID，由Aicda编码），该酶在B细胞中响应T细胞依赖性和非T细胞依赖性抗原时被强烈诱导表达4。发生类别转换和高频突变的B细胞进一步分化为浆细胞，后者以大量分泌抗体的方式发挥作用，这一过程关键依赖于B淋巴细胞诱导成熟蛋白1（Blimp1，由Prdm1编码）5。B细胞中异常的表观遗传改变可能导致异常的抗体/自身抗体应答，进而引发过敏反应或自身免疫性疾病1,4。了解miRNA等表观遗传因子如何调控B细胞内在的基因表达，不仅对疫苗研发具有重要意义，而且对于揭示潜在的异常抗体/自身抗体应答机制也至关重要。
组蛋白乙酰化和去乙酰化通....
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方案
本方案遵循圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会的动物护理指南。
1. 小鼠B细胞的刺激以诱导类别转换重组、浆细胞分化及HDI处理
- 脾细胞悬液的制备
注意：除小鼠安乐死和解剖步骤外，所有操作均须在超净工作台中进行。- 通过 CO₂ 处死无特定病原体的 C57BL/6J 小鼠（8-12 周龄）2 吸入
- 将小鼠仰卧置于解剖板上，使用18号、1.5英寸皮下注射针固定小鼠四肢。
- 使用70%乙醇浸湿的擦拭巾对皮肤进行消毒。
- 使用一套灭菌手术器械（镊子和解剖剪），在肋骨下方切开皮肤，以暴露脾脏（位于腹腔左侧，肝脏下方）。
- 使用另一把无菌镊子和剪刀，通过镊子轻轻夹住位于胃大弯下方的脾脏，并用解剖剪切断所有连接组织，将脾脏取出。确保完全去除所有连接组织。
- 将脾脏放入含有1,000 µL完全RPMI1640培养基（RPMI 1640培养基添加10%热灭活胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 µg/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、0.25 µg/mL两性霉素B和50 µM β-巯基乙醇）的1.5 mL微量离心管中。
- 将70 µm细胞筛置于50 mL聚丙烯圆锥形离心管上，将微型离心管中的脾脏组织倒入细胞筛中。用15....
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结果
采用本实验方案，将纯化的B细胞与LPS（3 µg/mL）和IL-4（5 ng/mL）共同培养96小时，可诱导30–40%的类别转换重组（CSR）至IgG1，并诱导约10%的浆细胞分化。经HDI（500 µM VPA）处理后，向IgG1的类别转换重组下降至10–20%，浆细胞分化下降至约2%（图1）。HDI介导的类别转换重组抑制作用进一步通过重组后Iμ-Cγ1和成熟VHDJH-Cγ1转录本数量的减少得以证实，这些转录本是完成类别转换重组的标志性产物。通过qRT-PCR检测发现，对类别转换重组和体细胞高频突变（SHM）至关重要的Aicda基因，以及对浆细胞分化重要的Prdm1和Xbp1基因，其表达均被VPA抑制（图2）。
HDI 对 B 细胞中 mRNA 表达的调控具有高度选择性。通过 LPS.......
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讨论
本方案提供了诱导B细胞类别转换和浆细胞分化的全面方法；分析表观遗传调控因子（特别是组蛋白去乙酰化酶抑制剂，HDI）对这些过程的影响；以及检测HDI对这些细胞中mRNA和miRNA表达的作用。其中大多数方法也可用于分析表观遗传因子对人B细胞功能及mRNA/miRNA表达的影响。qRT-PCR以及mRNA-seq/miRNA-seq方法还可用于分析从经表观遗传调控剂（如HDI）处理的小鼠体内分离的B细胞。
表观遗传修饰可能影响多种不同的细胞功能，例如细胞增殖和存活率，从而可能影响类别转换重组（CSR）及浆细胞分化。因此，应分析经或未经组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDI）处理的B细胞的增殖、存活率以及细胞周期。通过qRT-PCR分析HDI或其他表观遗传调节因子对mRNA和miRNA表达水平调控时，一个挑战在于选择合适的看家基因或小RNA作为内参。许多常用的看家基因可能在不同程度上受到表观遗传修饰剂的影响。应检测多种不同看家基因的表达水平，并用于qRT-PCR中对特定基因表达的标准化。该问题也可通过mRNA测序（mRNA-seq）和miRNA测序（miRNA-seq）加以解决，其中单个mRNA.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AI 105813 和 AI 079705（授予 PC）、狼疮研究联盟狼疮靶点识别资助项目 ALR 295955（授予 PC）以及关节炎国家研究基金会研究资助（授予 HZ）的支持。TS 得到了中国长沙中南大学湘雅医学院第二湘雅医院儿科医学中心的支持，该支持来自湘雅-德克萨斯大学圣安东尼奥医学中心医学生访问项目。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 小鼠 | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 培养基（改良型）1X 含 L-谷氨酰胺（规格：6 × 500 mL；含 L-谷氨酰胺） | 费舍尔科技 | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone 抗生素-抗真菌溶液 100 mL | 费舍尔科技 - Hyclone | SV3007901 | |
| β-巯基乙醇 | 费舍尔科技 | 44-420-3250ML | |
| Falcon 细胞筛 | 费舍尔科技 | 21008-952 | |
| 台盼蓝染液 0.04% | GIBCO/生命技术/英维沃 | 15250 | |
| ACK 裂解缓冲液 | 费舍尔科技 | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line 计数板 | 费舍尔科技 | 02-671-51B | |
| EasySep 磁力架 | 干细胞科技 | 18000 | |
| Falcon 圆底聚苯乙烯带盖试管 | 费舍尔科技 | 14-959-1A | |
| EasySep 小鼠 B 细胞分离试剂盒 | 干细胞科技 | 19854 | |
| BD 18 号针头 1.5 英寸短斜面 100/盒 | BD 生物科学 | 305199 | |
| PE/Cy7 抗小鼠 CD138（Syndecan-1）抗体 | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 抗体 | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | 西格玛-奥德里奇 | A9400-1MG | |
| APC 抗小鼠/人 CD45R/B220 抗体 | Biolegend | 103212 | |
| 小鼠 APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC 抗小鼠 IgM 抗体 | Biolegend | 406506 | |
| FITC 抗小鼠/人 CD45R/B220 抗体 | Biolegend | 103206 | |
| PE 抗人/小鼠 CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | 费舍尔科技 | MT-21-022-CM | |
| 牛血清白蛋白，第五组分，热激处理 | 费舍尔科技 | BP1600-100 | |
| LPS 25mg（来自大肠杆菌 O55:B5 的脂多糖） | 西格玛-奥德里奇 | L2880-25MG | |
| 重组小鼠 IL-4（无载体） | BioLegend | 574302 (规格：10 ug) | |
| 丙戊酸钠盐 | 西格玛-奥德里奇 | P4543 | |
| SterilGARD e3 II 级 A2 型生物安全柜 | Baker 公司 | SG404 | |
| 大容量立式 CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 3950 | |
| Isotemp 数字控制水浴锅：型号 205 | 费舍尔科技 | 15-462-5Q | |
| 5 mL 圆底聚苯乙烯试管 | 费舍尔科技 | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15 mL 离心管 | 费舍尔科技 | 05-538-59A | |
| 1.7 mL 微量离心管，透明 | Genesee | 22-282 | |
| 高速 Easy Reader 塑料离心管 50 mL | 费舍尔科技 | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| 6M 转子 | ELMI | 6M | |
| 6M.06 转子 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond 便携式 Pipet-Aid XP 移液控制器 | Drummond 科学 | 4-000-101 | |
| 25 mL 移液管吸头 | 费舍尔科技 | 89130-900 | |
| 10 mL 移液管吸头 | 费舍尔科技 | 89130-898 | |
| 5 mL 移液管吸头 | 费舍尔科技 | 898130-896 | |
| 48 孔板 | 费舍尔科技 | 07-200-86 | |
| Allegra 6 台式离心机，非制冷型 | 贝克曼库尔特 | 366802 | |
| GH-3.8A 转子，水平转子，ARIES 智能平衡 | 贝克曼库尔特 | 366650 | |
| Allegra 25R 台式离心机，制冷型 | 贝克曼库尔特 | 369434 | |
| TA-15-1.5 转子，固定角度 | 贝克曼库尔特 | 368298 | |
| 费舍尔科技 AccuSpin Micro 17 | 费舍尔科技 | 13-100-675 | |
| 费舍尔科技模拟涡旋混合器 | 费舍尔科技 | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini 试剂盒 (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep 试剂盒 | Zymo Research | R2050 | |
| 氯仿（约含 0.75% 乙醇作为防腐剂，分子生物学级） | 费舍尔科技 | BP1145-1 | |
| RNase-Free DNase 试剂盒 (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | ND-2000 | |
| Superscript III 第一链合成系统 RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96 孔半裙边 PCR 板，每箱 25 块 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' 粘性封膜 | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ 光学模块 | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler 机箱 | Bio-Rad | 170-8701 | |
| 光学组件套件 | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II 流式细胞仪分析仪 | BD 生物科学 | ||
| FACSDiva 软件 | BD 生物科学 | ||
| FlowJo 10 | BD 生物科学 | ||
| 2100 生物分析仪 | 安捷伦科技 | G2943CA | |
| S200 聚焦超声破碎仪 | Covaris | S200 | |
| SPRIworks 片段文库系统 I（适用于 Illumina） | 贝克曼库尔特 | A288267 | |
| cBot 簇生成工作站 | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 基因组测序仪 | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA 文库制备试剂盒 v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq 小 RNA 文库制备试剂盒 | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina 小 RNA 测序试剂盒 v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | 安捷伦 | G2964AA |
参考文献
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P.
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