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方法文章

全基因组分析 HDAC 抑制剂对诱导 B 细胞发生类别转换 DNA 重组及浆细胞分化过程中 microRNA 和 mRNA 的调控作用

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DOI：

10.3791/55135

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2017年9月20日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, University of Texas Long School of Medicine at San Antonio, 2Xiangya School of Medicine, Cental South University, 3Greehey Children’s Cancer Research Institute, University of Texas Long School of Medicine at San Antonio

本文内容

摘要

表观遗传因素可与遗传程序相互作用，从而调控基因表达并调节B细胞功能。通过结合 体外 B细胞刺激、qRT-PCR以及高通量microRNA测序和mRNA测序方法，可用于分析B细胞中miRNA和基因表达的表观遗传调控。

摘要

抗体反应通过多种B细胞内在的关键过程实现，包括体细胞高频突变（SHM）、类别转换DNA重组（CSR）以及浆细胞分化。近年来研究表明，表观遗传修饰或因子（如组蛋白去乙酰化和微小RNA（miRNA））可与B细胞的遗传程序相互作用，从而调控抗体反应；而表观遗传因子的功能障碍则被发现可导致自身抗体反应的发生。分析B细胞在表观遗传调节剂作用下全基因组miRNA和mRNA的表达情况，对于理解B细胞功能及抗体反应的表观遗传调控机制具有重要意义。本文中，我们展示了一种诱导B细胞进行类别转换重组和浆细胞分化的实验方案，对这些B细胞使用组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂（HDI）处理，并分析mRNA和miRNA表达水平的方法。在该方案中，我们直接利用下一代mRNA测序（mRNA-seq）和miRNA测序（miRNA-seq）技术对互补DNA（cDNA）序列进行分析，将测序读段比对至基因组，并结合定量反转录（qRT）-PCR进行验证。通过这些方法，我们明确发现，在诱导发生类别转换重组和浆细胞分化的B细胞中，作为表观遗传调控因子的HDI可选择性地调节miRNA和mRNA的表达，并影响类别转换重组及浆细胞分化过程。

引言

表观遗传标记或因子（如DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰以及非编码RNA（包括microRNA））通过调控基因表达来调节细胞功能1。表观遗传修饰可调控B淋巴细胞的功能，例如免疫球蛋白类别转换DNA重组（CSR）、体细胞高频突变（SHM）以及向记忆B细胞或浆细胞的分化，从而影响抗体和自身抗体的应答2,3。CSR和SHM过程高度依赖于活化诱导的胞苷脱氨酶（AID，由Aicda编码），该酶在B细胞中响应T细胞依赖性和非T细胞依赖性抗原时被强烈诱导表达4。发生类别转换和高频突变的B细胞进一步分化为浆细胞，后者以大量分泌抗体的方式发挥作用，这一过程关键依赖于B淋巴细胞诱导成熟蛋白1（Blimp1，由Prdm1编码）5。B细胞中异常的表观遗传改变可能导致异常的抗体/自身抗体应答，进而引发过敏反应或自身免疫性疾病1,4。了解miRNA等表观遗传因子如何调控B细胞内在的基因表达，不仅对疫苗研发具有重要意义，而且对于揭示潜在的异常抗体/自身抗体应答机制也至关重要。

组蛋白乙酰化和去乙酰化通常是由组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）催化的组蛋白蛋白上赖氨酸残基的修饰。这些修饰可增加或减少染色质的可及性，从而允许或阻止转录因子或蛋白质与DNA的结合，并改变基因表达5,6,7,8。HDAC抑制剂（HDI）是一类干扰HDAC功能的化合物。在此，我们使用HDI（VPA）来研究HDAC对B细胞内在基因表达谱及其作用机制的调控。

miRNA是一类长度约为18至22个核苷酸的小分子非编码RNA，其生成经历多个阶段。miRNA宿主基因被转录后形成发夹结构的初级miRNA（pri-miRNA）。这些pri-miRNA被转运至细胞质，在其中进一步加工为前体miRNA（pre-miRNA）。最终，pre-miRNA经过剪切形成成熟的miRNA。miRNA通过识别靶mRNA 3'非翻译区（3' UTR）中的互补序列发挥作用6,7。通过转录后沉默机制，miRNA调控细胞活动，如增殖、分化和凋亡10,11。由于多个miRNA可靶向同一条mRNA，而单个miRNA也可能靶向多条mRNA，因此要理解miRNA个体及其集体效应的意义，必须在特定生物学背景下全面了解miRNA的表达谱。研究表明，miRNA参与B细胞发育与外周分化过程，以及B细胞发育阶段特异性分化、抗体应答和自身免疫反应1,4,9。在Aicda和Prdm1基因的3' UTR区域，存在多个经验证或预测的进化保守位点，可被miRNA靶向8。

表观遗传调控，包括组蛋白转录后修饰和miRNA，表现出细胞类型和细胞阶段特异性的基因表达调控模式9。本文描述了定义组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDI）介导的miRNA和mRNA表达、类别转换重组（CSR）以及浆细胞分化的研究方法。这些方法包括诱导B细胞发生类别转换重组和浆细胞分化的实验方案；对B细胞进行HDI处理的方法；以及通过qRT-PCR、miRNA-seq和mRNA-seq分析miRNA和mRNA表达水平的技术流程10,11,12,8,13。

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方案

本方案遵循圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会的动物护理指南。

1. 小鼠B细胞的刺激以诱导类别转换重组、浆细胞分化及HDI处理

  1. 脾细胞悬液的制备
    注意：除小鼠安乐死和解剖步骤外，所有操作均须在超净工作台中进行。
    1. 通过 CO₂ 处死无特定病原体的 C57BL/6J 小鼠（8-12 周龄）2 吸入
    2. 将小鼠仰卧置于解剖板上，使用18号、1.5英寸皮下注射针固定小鼠四肢。
    3. 使用70%乙醇浸湿的擦拭巾对皮肤进行消毒。
    4. 使用一套灭菌手术器械（镊子和解剖剪），在肋骨下方切开皮肤，以暴露脾脏（位于腹腔左侧，肝脏下方）。
    5. 使用另一把无菌镊子和剪刀，通过镊子轻轻夹住位于胃大弯下方的脾脏，并用解剖剪切断所有连接组织，将脾脏取出。确保完全去除所有连接组织。
    6. 将脾脏放入含有1,000 µL完全RPMI1640培养基（RPMI 1640培养基添加10%热灭活胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 µg/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、0.25 µg/mL两性霉素B和50 µM β-巯基乙醇）的1.5 mL微量离心管中。
    7. 将70 µm细胞筛置于50 mL聚丙烯圆锥形离心管上，将微型离心管中的脾脏组织倒入细胞筛中。用15 mL聚丙烯圆锥形离心管的管尖轻轻碾压脾脏，使其通过细胞筛。用15至20 mL完全培养基冲洗细胞筛。
    8. 在 350 × g 离心 5 分钟，弃上清液。
    9. 从脾细胞悬液中去除红细胞。将细胞沉淀重悬于ACK裂解缓冲液中（每只脾脏5 mL），室温孵育4分钟，期间偶尔轻轻摇动，随后加入25 mL完全培养基终止反应。
    10. 在 350 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。用 1 或 10 mL 完全培养基重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板计数活细胞。
  2. B细胞分离
    注意：按照制造商说明书通过负向选择法分离B细胞。使用针对非B细胞（CD4、CD8、CD11b、CD43、CD49b、CD90.2、Ly-6C/G（Gr-1）和TER119）的生物素标记抗体及链霉亲和素包被的磁性颗粒，去除非B细胞。
    1. 制备 0.25 至2 mL浓度为1 × 10⁶的细胞悬液8 细胞/mL，加入完全培养基中，置于无菌的5 mL（12 x 75 mm）聚苯乙烯圆底试管中。向样品中加入正常大鼠血清（50 µL/mL）。
    2. 向样品中加入 50 µL/mL 分离试剂盒。轻轻吹打混匀细胞 上下颠倒混匀2-3次，室温孵育10分钟。
    3. 向样品中加入 75 µL/mL 链霉亲和素包被的磁性颗粒。轻轻吹打混匀 2–3 次，室温孵育 2.5 分钟。
    4. 加入完全 RPMI 1640 培养基，轻轻吹打细胞悬液 2–3 次以混匀。
    5. 将离心管（不加盖）放入磁力架中，室温孵育2.5分钟。倾去含有未结合B细胞的上清液至新的15 mL锥形管中。
    6. 使用血细胞计数板和台盼蓝染色计数活细胞。通过流式细胞术分析B细胞表面标志物（如B220和CD19）以评估B细胞纯度。
  3. B细胞刺激与HDI治疗
    1. 将纯化的B细胞重悬于完全RPMI 1640培养基中，终浓度为0.3 x 10⁶/mL6 cells/mL
    2. 使用48孔细胞培养板进行细胞培养。每孔加入1 mL纯化的B细胞悬液（0.3 × 10⁶细胞/mL）。6 细胞/毫升），脂多糖（LPS，终浓度为 3 µ克/毫升） 大肠杆菌，IL-4（终浓度5 ng/mL）以及0或500 µM HDI（丙戊酸；VPA）。
    3. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养细胞2 60小时用于qRT-PCR以及高通量mRNA和miRNA测序分析，或96小时用于流式细胞术分析。
  4. 流式细胞术分析类别转换重组和浆细胞分化
    1. 培养96小时后，通过反复吹打使各孔中的细胞脱落，将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中。使用台式离心机在350 × g下离心5分钟，沉淀细胞后弃去上清液。
    2. 用含1% BSA和0.5 ng/mL荧光素的100 µL HBSS缓冲液重悬细胞 (FITC)-结合的山羊抗-小鼠IgM抗体（Ab）, 0.2 ng/mL 别藻蓝蛋白（APC）标记的大鼠抗小鼠 IgG1 单克隆抗体（mAb），0.2 ng/mL 藻红蛋白（PE）标记的大鼠抗小鼠 B220 单克隆抗体（mAb），0.2 ng/mL PE-Cy7 标记的大鼠抗小鼠 CD138 单克隆抗体（mAb），以及 2 ng/mL 7-氨基放线菌素 D（7-AAD）。
    3. 将细胞与荧光标记的抗体（步骤1.4.2）在室温避光条件下孵育30分钟。
    4. 用含1% BSA的HBSS溶液洗涤细胞，每次1 mL。
    5. 在台式离心机中以1,500 × g离心5分钟，沉淀细胞，弃去上清液。
    6. 将细胞重悬于300 µL含1% BSA的HBSS中，并将细胞悬液转移至圆底聚苯乙烯管中。用铝箔包裹试管以避免光照。
    7. 对单细胞悬液进行流式细胞术分析。每个补偿样本收集50,000个事件，其他样本收集250,000个事件。使用仪器配套软件分析数据。
    8. 通过脉冲几何门（FSC-H × FSC-A 和 SSC-H × SSC-A）去除碎片和双联体。对 7-AAD 图进行适当设门以排除死细胞。

2. 高通量 mRNA 测序

  1. 培养 60 小时后，使用可回收小 RNA 的总 RNA 提取试剂盒，按照制造商说明书从 2 - 4 × 106 个细胞中提取总 RNA。包括 DNase I 处理步骤。
  2. 按照制造商说明书，使用生物分析仪检测 RNA 的完整性。
  3. 使用 500–1,000 ng 高质量的总 RNA（RNA 完整性数值 RIN > 8.0），按照制造商说明书，利用商业化的 RNA 样本制备试剂盒进行 RNA-seq 文库构建。
  4. 根据各个 mRNA-seq 文库接头中相应的 6 个碱基索引序列对文库进行混合，并以 50 bp/序列的读长进行测序。按照制造商的操作规程使用高通量 DNA 测序系统。
  5. 测序完成后，使用 CASAVA 进行去多重分析，为每个样本生成 fastq 文件。随后进行序列比对和生物信息学分析，具体步骤如前所述11。
  6. 使用 TopHat2 默认参数将所有测序读段比对至参考基因组（UCSC 小鼠基因组 mm9 版本）14。利用 HTSeq-count 对比对生成的 bam 文件进行处理，获得所有样本中每个基因的读段计数。

3. 高通量miRNA测序

  1. 使用步骤 2.1 中制备的高质量总 RNA（100 ng–1 µg），采用商用小 RNA-seq 试剂盒进行小 RNA-seq 文库构建。
  2. 使用商用连接试剂盒，将简并的 3' 接头连接至起始小 RNA 分子的 5′ 端，再将简并的 5' 接头连接至其 3′ 端。通过逆转录将 RNA 转化为 cDNA，并使用商用试剂盒通过 PCR 扩增小 RNA-seq 文库。
  3. 使用 6% TBE 天然 PAGE 凝胶分离最终的小 RNA-seq 文库。以 1× TBE 缓冲液在 200 V 条件下电泳，直至溴酚蓝示踪染料条带接近凝胶底部（距底边 0.5–1 cm）。
  4. 将凝胶从玻璃板上取下，置于洁净容器中，用溴化乙锭（水中浓度 0.5 µg/mL）染色 2–3 分钟。在紫外透射仪或其他凝胶成像系统上观察凝胶条带。
  5. 使用洁净的剃刀切下约 150 bp 的条带，并将其放入 1.7 mL 离心管中。
  6. 按照生产商说明书，使用凝胶回收试剂盒提取 DNA。
  7. 按照生产商说明书，使用商用高灵敏度 DNA 检测试剂对最终文库的片段分布进行检测，并使用商用双链 DNA 检测试剂测定其浓度。
  8. 按照生产商方案，将文库混合后进行扩增，并使用商用高通量 DNA 测序系统进行后续测序。
  9. 按照生产商方案，使用 CASAVA 进行数据解复用，为每个样本生成 fastq 文件。
  10. 针对每个样本的小 RNA-seq 数据分析，按照生产商方案使用 Flicker 进行小 RNA 比对。
    1. 去除比对至污染物（如线粒体序列、rRNA、引物等）的读段。
    2. 将数据比对至成熟 miRNA 序列。
    3. 将数据比对至发夹环序列（前体 miRNA）。
    4. 将数据比对至其他小 RNA 序列（使用 fRNA 数据库）15。
  11. 在所有样本完成定量后，确定不同组别/样本间差异表达的 miRNA。使用在线 miRNA 靶标预测工具（如 TargetScan16、MicroCosm17 和 PicTar18）预测靶向特定 mRNA 的 miRNA，或可被特定 miRNA 靶向的 mRNA。
  12. 若需进行功能注释或通路分析，可将预测的基因提交至 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）或 DAVID 工具进行分析。

4. mRNA 和 miRNA 的定量 RT-PCR（qRT-PCR）

  1. mRNA 的 qRT-PCR 分析
    1. 使用可回收小 RNA 的商品化总 RNA 提取试剂盒，按照制造商说明书从 0.2–5 × 106 个细胞中提取 RNA。包括 DNase I 处理步骤。
    2. 以寡聚 dT 引物，利用第一链 cDNA 合成系统由总 RNA 合成 cDNA。
    3. 使用适当的引物，通过 qRT-PCR 对 cDNA 进行定量，采用 2× 实时 PCR 预混液，反应程序如下：95 °C 预变性 15 秒，随后进行 40 个循环（94 °C 变性 10 秒，60 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒）。
    4. 在 72 °C 延伸步骤期间采集数据，并进行 72 至 95 °C 的熔解曲线分析。
  2. miRNA 的 qRT-PCR 分析
    1. 分装步骤 4.1.1 中制备的样品 RNA。
    2. 将 RNA 反转录为 cDNA。使用商品化的 microRNA 反转录试剂盒，并遵循制造商说明书操作。
    3. 使用 SYBR Green 实时 PCR 预混液，结合 250 nM 成熟 miRNA 特异性正向引物和通用反向引物，进行 microRNA 的实时 PCR 扩增。
      1. 将 2× PCR 预混液、miRNA 特异性正向引物和通用反向引物在室温下解冻，混合各溶液。
      2. 按以下配方配制每孔 25 µL 反应体系（适用于 96 孔 PCR 板）：
        2× PCR 预混液 12.5 µL
        miRNA 正向引物（2.5 μM）2.5 µL
        通用反向引物（2.5 μM）2.5 µL
        无 RNase 水 5 µL
      3. 向 96 孔 PCR 板中每孔加入 22.5 μL 反应混合液，再向各孔加入 2.5 μL 模板 cDNA（50 pg–3 ng）。
      4. 用密封膜紧密封板，在室温下以 1,000 × g 离心 1 分钟。
      5. 将 PCR 板放入实时荧光定量 PCR 仪中，运行以下扩增程序：95 °C 预变性 5 分钟，随后进行 40 个循环（94 °C 变性 15 秒，55 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒）。
    4. 使用电子表格软件，采用 ΔΔCt 法对 qRT-PCR 数据进行分析。将目标 miRNA 的表达水平归一化至小核/核仁 RNA（Rnu6/RNU61/2、Snord61/SNORD61、Snord68/SNORD68 和 Snord70/SNORD70）的表达水平。
  3. 统计学分析
    1. 使用电子表格软件，通过配对和非配对 Student's t-检验计算 p 值，并将 p 值 <0.05 视为具有统计学显著性。

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结果

采用本实验方案，将纯化的B细胞与LPS（3 µg/mL）和IL-4（5 ng/mL）共同培养96小时，可诱导30–40%的类别转换重组（CSR）至IgG1，并诱导约10%的浆细胞分化。经HDI（500 µM VPA）处理后，向IgG1的类别转换重组下降至10–20%，浆细胞分化下降至约2%（图1）。HDI介导的类别转换重组抑制作用进一步通过重组后Iμ-Cγ1和成熟VHDJH-Cγ1转录本数量的减少得以证实，这些转录本是完成类别转换重组的标志性产物。通过qRT-PCR检测发现，对类别转换重组和体细胞高频突变（SHM）至关重要的Aicda基因，以及对浆细胞分化重要的Prdm1和Xbp1基因，其表达均被VPA抑制（图2）。

HDI 对 B 细胞中 mRNA 表达的调控具有高度选择性。通过 LPS...

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讨论

本方案提供了诱导B细胞类别转换和浆细胞分化的全面方法；分析表观遗传调控因子（特别是组蛋白去乙酰化酶抑制剂，HDI）对这些过程的影响；以及检测HDI对这些细胞中mRNA和miRNA表达的作用。其中大多数方法也可用于分析表观遗传因子对人B细胞功能及mRNA/miRNA表达的影响。qRT-PCR以及mRNA-seq/miRNA-seq方法还可用于分析从经表观遗传调控剂（如HDI）处理的小鼠体内分离的B细胞。

表观遗传修饰可能影响多种不同的细胞功能，例如细胞增殖和存活率，从而可能影响类别转换重组（CSR）及浆细胞分化。因此，应分析经或未经组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDI）处理的B细胞的增殖、存活率以及细胞周期。通过qRT-PCR分析HDI或其他表观遗传调节因子对mRNA和miRNA表达水平调控时，一个挑战在于选择合适的看家基因或小RNA作为内参。许多常用的看家基因可能在不同程度上受到表观遗传修饰剂的影响。应检测多种不同看家基因的表达水平，并用于qRT-PCR中对特定基因表达的标准化。该问题也可通过mRNA测序（mRNA-seq）和miRNA测序（miRNA-seq）加以解决，其中单个mRNA...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AI 105813 和 AI 079705（授予 PC）、狼疮研究联盟狼疮靶点识别资助项目 ALR 295955（授予 PC）以及关节炎国家研究基金会研究资助（授予 HZ）的支持。TS 得到了中国长沙中南大学湘雅医学院第二湘雅医院儿科医学中心的支持，该支持来自湘雅-德克萨斯大学圣安东尼奥医学中心医学生访问项目。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
C57BL/6 小鼠Jackson Labs664
Corning cellgro RPMI 1640 培养基（改良型）1X 含 L-谷氨酰胺（规格：6 × 500 mL；含 L-谷氨酰胺）费舍尔科技MT 10-040-CV 
FBSHycloneSH300
HyClone 抗生素-抗真菌溶液 100 mL费舍尔科技 - HycloneSV3007901 
β-巯基乙醇费舍尔科技44-420-3250ML
Falcon 细胞筛费舍尔科技21008-952  
台盼蓝染液 0.04%GIBCO/生命技术/英维沃15250
ACK 裂解缓冲液 费舍尔科技BW10-548E 
Hausser Scientific Bright-Line 计数板费舍尔科技02-671-51B
EasySep 磁力架干细胞科技18000
Falcon 圆底聚苯乙烯带盖试管费舍尔科技14-959-1A
EasySep 小鼠 B 细胞分离试剂盒干细胞科技19854
BD 18 号针头 1.5 英寸短斜面 100/盒 BD 生物科学 305199
PE/Cy7 抗小鼠 CD138（Syndecan-1）抗体BioLegend 142513 (25 ug)
PE-Cy7 B220 抗体BioLegend103222
7-AAD (1 mg)西格玛-奥德里奇A9400-1MG
APC 抗小鼠/人 CD45R/B220 抗体Biolegend103212
小鼠 APC-IgG1 200 µgBiolegend406610
FITC 抗小鼠 IgM 抗体Biolegend406506
FITC 抗小鼠/人 CD45R/B220 抗体Biolegend103206
PE 抗人/小鼠 CD45R (B220) (RA3-6B2)Biolegend103208
HBSS 1X费舍尔科技MT-21-022-CM
牛血清白蛋白，第五组分，热激处理 费舍尔科技BP1600-100
LPS 25mg（来自大肠杆菌 O55:B5 的脂多糖）西格玛-奥德里奇L2880-25MG
重组小鼠 IL-4（无载体）BioLegend574302 (规格：10 ug)
丙戊酸钠盐西格玛-奥德里奇P4543
SterilGARD e3 II 级 A2 型生物安全柜Baker 公司SG404
大容量立式 CO2 培养箱 赛默飞世尔科技3950
Isotemp 数字控制水浴锅：型号 205费舍尔科技15-462-5Q
5 mL 圆底聚苯乙烯试管费舍尔科技 14-959-5
Corning CentriStar 15 mL 离心管 费舍尔科技 05-538-59A
1.7 mL 微量离心管，透明Genesee22-282
高速 Easy Reader 塑料离心管 50 mL费舍尔科技06-443-18
ELMI SkySpin CM-6MTELMICM-6MT
6M 转子ELMI6M
6M.06 转子ELMI6M.06
Drummond 便携式 Pipet-Aid XP 移液控制器Drummond 科学4-000-101
25 mL 移液管吸头费舍尔科技89130-900
10 mL 移液管吸头费舍尔科技89130-898
5 mL 移液管吸头费舍尔科技898130-896
48 孔板费舍尔科技07-200-86
Allegra 6 台式离心机，非制冷型贝克曼库尔特366802
GH-3.8A 转子，水平转子，ARIES 智能平衡贝克曼库尔特366650
Allegra 25R 台式离心机，制冷型贝克曼库尔特369434
TA-15-1.5 转子，固定角度贝克曼库尔特368298
费舍尔科技 AccuSpin Micro 17费舍尔科技13-100-675
费舍尔科技模拟涡旋混合器 费舍尔科技02-215-365
miRNeasy Mini 试剂盒 (50)Qiagen217004
Direct-zol RNA MiniPrep 试剂盒Zymo ResearchR2050
氯仿（约含 0.75% 乙醇作为防腐剂，分子生物学级）费舍尔科技BP1145-1
RNase-Free DNase 试剂盒 (50)QIAGEN79254
NanoDrop 2000 分光光度计赛默飞世尔科技ND-2000
Superscript III 第一链合成系统 RT-PCRInvitrogen175013897
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-rad 172-5121
Fisherbrand 96 孔半裙边 PCR 板，每箱 25 块Fisher14-230-244
Microseal 'B' 粘性封膜Bio-RadMSB-1001
MyiQ 光学模块Bio-Rad170-9744
iCycler 机箱Bio-Rad170-8701
光学组件套件Bio-Rad170-9752
BD LSR II 流式细胞仪分析仪BD 生物科学
FACSDiva 软件BD 生物科学
FlowJo 10BD 生物科学
2100 生物分析仪安捷伦科技G2943CA
S200 聚焦超声破碎仪CovarisS200
SPRIworks 片段文库系统 I（适用于 Illumina）贝克曼库尔特A288267
cBot 簇生成工作站illuminaSY-312-2001
HiSeq 2000 基因组测序仪IlluminaSY-401-1001
TruSeq RNA 文库制备试剂盒 v2IlluminaRS-122-2001
TruSeq 小 RNA 文库制备试剂盒IlluminaRS-200-0012
NEXTflex Illumina 小 RNA 测序试剂盒 v3Bioo Scientific5132-05
2200 TapeStation安捷伦G2964AA

参考文献

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B HDAC mRNA miRNA RNA PCR
全基因组分析 HDAC 抑制剂对诱导 B 细胞发生类别转换 DNA 重组及浆细胞分化过程中 microRNA 和 mRNA 的调控作用
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