我们描述了一种利用靶向外周照射在小鼠中诱导类似疲劳行为的方法。选定的非致死照射剂量可导致小鼠自主转轮跑动活动减少，持续约一周时间。
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本文内容
摘要
摘要
癌症相关性疲劳（CRF）是一种令人痛苦且代价高昂的病症，常影响接受癌症治疗（包括放射治疗）的患者。本文介绍一种利用靶向外周照射在小鼠中诱导疲劳样行为的方法。通过适当的屏蔽，照射靶向小鼠的下腹部/盆腔区域，同时保护脑部，以模拟盆腔癌症患者接受的放射治疗。我们给予的照射剂量足以在小鼠中诱导疲劳样行为，通过自主转轮跑动活动（VWRA）进行评估，且不会引起明显的疾病表现。由于转轮跑动是小鼠正常的自主行为，因此其使用对其他行为学测试或生物学指标的干扰较小。因此，转轮跑动可作为理解疲劳行为与生物学相关性的可行结局指标。CRF是一种复杂的病症，常伴随多种共病，其病因可能与癌症本身及其多种治疗方式均有关。本文所述方法有助于研究导致CRF发生的放射诱导变化，更广泛而言，也有助于探索能够解释由外周触发但中枢驱动的行为（如疲劳）发生与持续的生物学网络。
引言
癌症相关性疲劳（CRF）是一种令人痛苦且代价高昂的状况，常影响接受癌症治疗的患者1。这种疲劳与近期活动量不成比例，且无法通过休息缓解，常伴随情绪、动机、注意力和认知功能等多方面的紊乱2。尽管CRF的生物学成因尚不明确，但已有研究表明，在许多情况下其与炎症和细胞因子水平相关，某些情况下也与血红蛋白水平及多种内分泌系统功能相关（参见Saligan et al.3 对CRF生物学研究的综述）。
使用动物模型进行的对照研究对于理解这种复杂状况相关的行为和生物学机制十分必要。尽管已有研究利用啮齿类动物模型探讨了肿瘤相关4或化疗相关5,6的疲劳，但癌症相关疲劳（CRF）的病因可能具有特定治疗方式的特异性。为了研究与放射治疗相关的CRF，我们课题组近期建立了一种辐射诱导疲劳的小鼠模型7。与现有的涉及脑部或全身照射的CRF模型8,9不同，该模型旨在探索外周靶向照射如何触发由中枢驱动的行为改变，例如疲劳。
本文所述实验方法旨在模拟对盆腔癌症患者进行的放射治疗，通过使用铅屏蔽材料将辐射靶向小鼠的下腹部/盆腔区域。然而，通过调整铅屏蔽的形状或其相对于实验动物的放置位置，该方法也可适用于模拟对身体其他部位的照射。本研究采用自主转轮跑动活动（VWRA）来评估类似疲劳的行为表现；由于该行为属于自主性且为正常行为10，因此可与其他行为学和生物学检测方法同时进行。我们发现，仅对周围组织进行照射即足以降低小鼠的自主转轮跑动活动，且不会引起明显的病态表现7。未来利用该模型开展的研究有望揭示外周照射对免疫系统及其他生物学信号通路的影响，以及由此引发的中枢神经系统下游改变，这些改变可能与癌症相关疲劳（CRF）的症状密切相关。
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方案
伦理声明：本研究经美国国立卫生研究院（NIH）动物护理与使用委员会批准。所有参与动物操作及研究结果测量的研究人员均经过美国国立卫生研究院动物护理与使用办公室以及国家心肺血液研究所小鼠表型分析核心的正规培训。本研究中动物实验、饲养及环境条件的各个方面均符合《实验动物护理与使用指南》11 的要求。
1. 动物饲养与实验动物
注意：实验期间将雄性 C57BL/6 小鼠单独饲养（到达时约五周龄），并自由摄食和饮水。ad libitum 所有笼子均维持 12 小时光照/12 小时黑暗循环，光照期从上午 6 点开始，黑暗期从下午 6 点开始。
- 对小鼠进行编号，并将其分别安置于标准的通风小鼠笼中。编号操作后，让小鼠恢复24小时。
注意：建议采用尾部纹身作为识别方法，以避免耳标被转轮卡住的风险。在每只小鼠的尾部纹上编号，尾部编号需与其笼子上标注的编号一致。 - 让小鼠在笼中至少再适应三天，每天轻柔地抓握每只小鼠三分钟。
2. 跑轮适应与基线测定
- 将小鼠分别放入个体自愿转轮活动（VWRA）笼中，每个笼子配备一个连接电子计数器的转轮，用于持续记录。
注意：所有转轮计数器通过单个USB接口连接至计算机（参见材料列表）。计算机软件会计算每个指定时间段内的转轮旋转次数、移动距离和平均速度，并在记录结束后自动将数据保存为文本文件和电子表格格式。 - 通过计算机软件界面启动VWRA记录。设置记录时间间隔为1小时，持续时间至少为5天。持续记录VWRA至少5天。
注意：在步骤2.2结束时，所有小鼠的每日转轮活动量应达到相对稳定的状态。若未达到，则识别并剔除异常值个体。 - 通过软件界面停止VWRA记录，并将小鼠移回步骤1.1中所述的标准笼具（无转轮的笼子）。
- 将小鼠随机分配至假照射对照组或照射组。
3. 照射
注意：对两组中的所有小鼠，每天进行一次以下步骤，连续三天。每天以相同的顺序处理小鼠。
- 通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物使每只小鼠麻醉。
- 通过脚趾夹捏确认麻醉效果，并在眼睛上涂抹眼膏以防止麻醉期间眼睛干涩。
- 将麻醉后的小鼠放入铅屏蔽装置中，调整小鼠在屏蔽装置内的位置，使仅下腹部/盆腔区域暴露。
注意：屏蔽装置由两块铅板组成 "盒子，" 其间留有狭窄的开口，可使辐射暴露于小鼠的特定小区域（参见 图1). - 使用医用胶带将小鼠尾巴根部固定在屏蔽装置内。
注意：步骤 3.4 为可选操作，但执行此步骤有助于确保小鼠在后续步骤中的位置不发生改变。 - 将屏蔽装置移入辐照仪中，确保动物在屏蔽装置内的位置保持不变。
- 若小鼠属于照射组，则以约110 cGy/min的剂量率给予800 cGy辐照；若小鼠属于假照射对照组，则将小鼠置于未激活的辐照仪中相同时间。
注意：最佳辐照仪设置取决于具体设备。以110 cGy/min的剂量率递送的辐照 137铯源是本实验所用辐照仪的中心剂量率。通过调整照射时间，使总剂量达到预期的800 cGy。 - 将小鼠从辐照仪和屏蔽装置中取出，然后放回第1.1步中提到的原始标准饲养笼中。
- 持续监测小鼠，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。
4. 放射诱导疲劳的测量
- 在连续三天照射完成后的第二天，将小鼠转移至第2.1步中所述的个体化VWRA笼具中。
- 记录VWRA，操作如第2.2步所述，但此处将记录时长设置为超过15天。15天结束后，通过软件界面手动停止VWRA记录。
注意：每次记录期间的数据会自动保存为电子表格，每个表格均包含所有动物（列表示）在记录期间各时间点（行表示）的转数、距离和速度测量值。实验结束时，记录软件将生成两个电子表格：一个为照射前VWRA数据，另一个为照射后VWRA数据。
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结果
三批小鼠接受了上述方案处理。其中假手术组共16只，辐照组共20只（2,400 cGy，3 × 800 cGy/天）。在连续三天辐照后，辐照组小鼠的VWRA显著低于假手术组（混合重复测量方差分析：辐照处理的主效应，F1,13 = 19.233，p < 0.001）。该效应在辐照后前七天均具有显著性（简单主效应分析，经Bonferroni校正后p < 0.05），其中平均VWRA距离在辐照后第三天达到最低值（图2A）。在第25天和第26天，由于进行其他行为学测试，未采集数据。
图2B展示了辐照前后VWRA变化的分布情况。尽管大多数小鼠表现出类似疲劳的症状（转轮跑动活动减少），但仍有少数小鼠的VWRA变化较小，甚至出现增加（图2B，下图）。由于存在这种变异性，样本量较小的实验可能无法捕捉到类似疲劳的行为。
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讨论
我们描述了一种利用靶向外周照射来诱导小鼠VWRA降低的实验方案，且不引起混杂的疾病或死亡。重要的是，一种简单的屏蔽装置可确保本方案中的照射稳定地靶向特定区域，模拟盆腔癌症患者接受的放射治疗。与现有的涉及脑部或全身照射的慢性疲劳（CRF）模型8,9相比，该模型探讨了靶向外周的照射如何影响中枢驱动的疲劳行为。在我们的代表性结果中，我们证明了以这种方式实施的外周照射足以引发类似疲劳的行为，且大约一周后完全恢复。
作为疲劳程度的评估指标，VWRA 可对每日24小时的运动距离和速度进行简单且客观的评估，所需训练和实验时间极少。该方法需要将小鼠单独饲养在各自的笼子中，因此实验设施的空间可能成为限制因素。尽管单独饲养可能影响小鼠行为，导致焦虑12或活动过度13，但有证据表明跑轮运动可能减轻这些负面影响14。与其他体力活动评估方法相比，跑轮...
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披露
本研究由美国国立卫生研究院护理研究所所内研究部资助。
致谢
作者谨此感谢美国国立卫生研究院（NIH）下属国家心肺血液研究所（NHLBI）的Michele Allen，感谢她慷慨分享在小鼠表型分析方法方面的专业知识，并持续提供技术协助；同时感谢NHLBI的Timothy Hunt协助我们开发屏蔽装置。本研究由NIH下属国家护理研究所（NINR）院内研究部资助，部分验证试验获得了肿瘤护理学会基金会资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 小鼠 | Charles River | 品系编号 027 (http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/c57bl-6n-mouse) | |
| 盐酸氯胺酮 | Putney | 100 mg/mL 储存液 | |
| 盐酸赛拉嗪 | Lloyd Laboratories | 100 mg/mL 储存液 | |
| 啮齿类动物纹身标记系统 | AIMS | ATS-3 | http://animalid.com/lab-animal-identification-systems/ats-3-general-rodent-tattoo-system |
| 铅屏蔽装置 | （定制） | 由两块一英寸厚的铅板组成的屏蔽结构，中间留有一英寸宽的缝隙，用于靶向照射 | |
| 有机玻璃屏蔽容器 | （定制） | 装有聚苯乙烯泡沫的有机玻璃容器，泡沫内切割出固定铅屏蔽的凹槽 | |
| GammaCell 40 Exactor | Best Theratronics | http://www.theratronics.ca/product_gamma40.html | |
| RAD Disk Ultra | Best Theratronics | http://www.theratronics.ca/product_rad.html | |
| 小鼠单通道活动轮装置 | Lafayette Instrument Company | #80820 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=980 |
| 用于计算机监测的活动轮计数器 | Lafayette Instrument Company | #86061 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1052 |
| 活动轮计数器用模块化电缆 | Lafayette Instrument Company | #86051-7 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1046 |
| 活动轮计数器用 USB 计算机接口 | Lafayette Instrument Company | #86056A | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1047 |
| 活动轮监测软件 | Lafayette Instrument Company | #86065 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1053 |
参考文献
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