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利用酵母双杂交筛选解析不可培养植物病原菌效应子的功能

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DOI：

10.3791/55150

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2017年1月20日

 , 
1Department of Molecular Biology - Functional Genomics, Laimburg Research Centre

本文内容

摘要

细菌效应蛋白对于成功建立感染至关重要。本实验方案描述了在细菌效应蛋白的天然植物宿主中，鉴定其蛋白质类结合伴侣的方法。鉴定这些效应蛋白的相互作用 通过 酵母双杂交筛选已成为揭示分子致病策略的重要工具。

摘要

揭示疾病表型的分子机制对于理解植物科学中的病理过程和症状发展至关重要。细菌已进化出多种策略，以操控其宿主的代谢过程，从而利于自身生存。这种细菌介导的操控通常伴随着严重症状的出现，甚至导致受感染植物的死亡。确定负责操控宿主的特定细菌分子已成为微生物学研究的重要领域。在鉴定出这些被称为“效应子”（effectors）的细菌分子后，阐明其功能显得尤为关键。确定效应子功能的一种直接方法是通过酵母双杂交（Y2H）筛选，鉴定其在天然宿主中的蛋白质结合伴侣。通常情况下，宿主含有大量潜在的结合伴侣，而这些伴侣无法通过任何in silico算法充分预测。因此，最理想的方法是利用假设的效应子对表达宿主蛋白的完整文库进行筛选。当病原体为难以培养的生物（如植原体）时，这一过程尤为具有挑战性。本实验方案提供了从植原体感染的木本宿主植物中提取DNA、扩增潜在效应子基因，以及随后通过Y2H筛选鉴定植物分子互作伴侣的逐步操作指南。尽管Y2H筛选技术已被广泛使用，但目前存在将其外包给提供有偿Y2H服务的生物技术公司的趋势。本方案旨在指导如何在任何具备基本条件的分子生物学实验室中，利用常规实验技术自主完成Y2H筛选。

引言

酵母双杂交筛选（Y2H）技术大约在27年前被开发出来1，并自此广泛应用于多个领域，以确定特定的蛋白质-蛋白质相互作用2,3,4,5,6,7,8,9,10,11。细菌效应子与宿主靶蛋白之间的物理相互作用通常是该靶蛋白功能被调控的前提条件。分析这类相互作用已成为感染生物学多个研究领域的重点12,13,14,15,16,17,18。Y2H筛选的基本原理是：两个蛋白质的相互作用导致功能性转录因子的重建，从而驱动报告基因的表达。已知的效应子（“诱饵”）在翻译水平上与转录因子的DNA结合域（DBD）融合，而潜在的相互作用蛋白（“猎物”）则与相应转录因子的激活域（AD）融合。由于相互作用的蛋白未知，需将一个潜在互作蛋白的文库克隆至所谓的“猎物文库”中。通常，该文库通过将cDNA克隆到适当的猎物载体表达质粒中构建而成，该质粒编码与诱饵载体所编码DBD相容的AD。当发生相互作用时，重建的转录因子将诱导报告基因的表达，这些基因通常可实现酵母的生长筛选。通过使用质粒特异性引物对猎物质粒进行测序，即可鉴定出相互作用蛋白。

细菌已进化出多种策略，以操控和利用宿主的代谢过程，或逃避宿主的防御机制，并通过不同的细菌分泌系统分泌效应分子19,20,21。因此，确定这些细菌效应分子的结合靶标是识别宿主中被操控通路的第一步，有助于更深入地理解特定的致病机制。

Y2H 筛选用于鉴定植原体病害过程中细菌效应子的相互作用，该方法通常是植原体研究中进一步表征分子致病机制的关键初步实验22,23。然而，大多数文献中对该方法的描述较为简略，且这些技术常被外包给生物技术公司。为了突出该方法的可行性，本实验方案提供了在自然宿主中鉴定细菌效应子分子相互作用伙伴的逐步操作指南。

尽管酵母双杂交（Y2H）筛选技术应用广泛且具有快速推进研究的优势，但必须注意的是，某些相互作用在酵母系统中可能无法发生。这是由于酵母细胞被用作一种 "在体内 反应容器" 存在一定的生物学局限性。多位作者已探讨了酵母双杂交技术及其衍生方法的优缺点。11,24,25,26,27需要考虑的一般因素包括，酵母细胞可能无法为所研究的特定蛋白质提供适当的基因表达、（翻译后）翻译或转运条件。这可能导致筛选中出现假阴性结果。相反，阳性相互作用可能是人为假象，在自然情况下可能并不发生。即， 在效应子与其合适宿主的情况下，必须利用更接近的生物系统中的独立相互作用实验，验证来自异源酵母表达系统的相互作用结果。

本研究鉴定了不可培养的植物病原体Candidatus Phytoplasma mali（P. mali）的效应子ATP_00189的结合伴侣。研究结果为苹果增生病症发生背后的分子机制提供了重要见解28，该病害在欧洲受感染的苹果种植区造成严重的经济损失29。

方案

1. 采集感染苹果树的根和叶片样本

注意：可以从根部或叶片中纯化出病原体特异性DNA。以下部分提供了这两种样品的取样方案。

  1. 用于DNA制备
    1. 从根部采集和制备样品
      1. 鉴定表现出“苹果增生病”特异性症状30,31的感病树木以及无症状的对照树木。使用洁净的修枝剪，剪取直径为0.5 - 1 cm、长度约5 cm的根部样本。从根系三个不同且相距较远的位置取样，并将样本放入适当标记的塑料袋中。
        1. 将样本置于带有冷藏冰袋的冷藏箱中，并在4 °C冰箱中保存，直至进一步处理。
          注意：根系结构和形态可能因树木生理状态而异。应在三个不同位置取样，且避免取过细的根。样本可在4 °C下保存数天，但长期储存会增加霉变风险。霉变样本不可用于DNA制备。
      2. 用水冲洗根部样本以去除土壤。将其放入无菌培养皿中，使用灭菌解剖刀去除根表皮和皮层。
        1. 用干净无绒的擦拭纸清洁解剖刀，浸入70% (v/v) 乙醇水溶液中，并在明火（例如本生灯）上进行灼烧灭菌。用解剖刀刮取韧皮部，将其切碎，并将30 - 100 mg切碎的韧皮部分装至无菌的2.0 mL离心管中。样本可在-80 °C下保存数月。
    2. 从叶片采集和制备样品
      1. 如步骤1.1.1.1所述，鉴定一棵感病树和一棵无症状对照树，每棵树选取十片完好的叶片。每种条件下一棵树已足够。
      2. 用水冲洗叶片，并喷洒70% (v/v) 乙醇溶液清洁表面。将叶片放入无菌培养皿中，使用无菌解剖刀分离每片叶的叶脉（主脉）。去除叶脉的表皮和皮层，将叶脉切成小段，分装100 mg叶脉组织至无菌2.0 mL离心管中。样本可立即用于DNA制备，或在-80 °C下保存数月。
        注意：将植物材料以100 mg为一份进行分装并冷冻保存较为方便。每份样品可直接用于DNA提取。称量深度冷冻的植物材料较为困难，因为冷冻后的组织容易结块。

2. 基于十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的DNA制备

注意：可以使用任何基于柱的植物材料DNA纯化方法来纯化DNA。本节描述了一种基于CTAB的DNA纯化方法。DNA纯化操作依据先前报道的改良方案进行32。

  1. 准备以下缓冲液：
    1. CTAB缓冲液：将1% w/v十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，Mr：364.45 g/mol）、100 mM三（羟甲基）氨基甲烷（Tris，Mr：121.14 g/mL）、1.4 M氯化钠（NaCl，Mr：58.44 g/mol）和20 mM乙二胺四乙酸二钠盐（NaEDTA，Mr：372.24 g/mol）溶于水中，并调节pH至8.0。
    2. N-月桂酰肌氨酸钠缓冲液：将10% w/v N-月桂酰肌氨酸钠盐33（Mr：293.38 g/mol）、100 mM Tris和20 mM NaEDTA溶于水中，并调节pH至8.0。
    3. Tris-EDTA（TE）缓冲液：将10 mM Tris和1 mM NaEDTA溶于水中，并对溶液进行高压灭菌。
    4. 乙酸铵溶液：在水中配制5 M乙酸铵（Mr：77.0825 g/mol）溶液，并在120 °C、1.2 bar条件下高压灭菌20分钟。
  2. 将30–100 mg新鲜或冷冻切碎的植物材料（步骤1.1.2.2.）与300 µL CTAB缓冲液、30 µL N-月桂酰肌氨酸钠缓冲液、6 µL蛋白酶K（10 µg/µL）和12 µL 2-巯基乙醇34（Mr：78.13 g/mol）混合。在60 °C下振荡60分钟。待混合物冷却至室温后再进行后续操作。
  3. 加入360 µL乙酸铵溶液并剧烈混匀。静置5分钟，然后在室温下以15,000 × g离心10分钟。将上清液转移至洁净离心管中，加入720 µL冰冻异丙醇35。在-20 °C下沉淀DNA至少30分钟。
  4. 在4 °C下以15,000 × g离心30分钟，弃去上清液。用500 µL冰冻70%乙醇洗涤沉淀，在4 °C下以15,000 × g离心5分钟。
  5. 弃去乙醇上清液，立即将离心管在干净的纸巾上轻蘸以去除残留液滴。确保尽可能去除液体。将沉淀在空气中干燥15–20分钟，或在真空浓缩离心机中干燥2–3分钟。避免通过过度加热或长时间蒸发导致沉淀过度干燥。
  6. 将沉淀重悬于700 µL TE缓冲液中，必要时加热至37 °C以促进溶解。加入10 µL RNase（10 µg/µL），在37 °C孵育15分钟，同时以300 rpm振荡。
  7. 加入700 µL氯仿:异戊醇36（24:1），充分混匀。在4 °C下以20,000 × g离心10分钟，将上清液的上层转移至新的洁净离心管中。
  8. 通过加入700 µL 2-丙醇35（异丙醇，Mr：60.1 g/mol）沉淀上清液中的DNA，并在-20 °C孵育至少30分钟。在4 °C下以12,000 × g离心30分钟，弃去上清液。
  9. 用500 µL 70%乙醇洗涤沉淀，在4 °C下以12,000 × g离心5分钟。按照步骤2.5所述方法干燥沉淀，将其溶解于50 µL TE缓冲液中。

3. 通过 PCR 检测Candidatus Phytoplasma mali 特异性 DNA

  1. 将从植物材料中纯化的DNA用无核酸酶水按1:10稀释，并使用病原体特异性引物进行PCR扩增37。
    1. 通过使用针对P. mali植原体的定量PCR方案（包含特异性引物和探针）验证植物材料中是否存在P. mali特异性DNA37。同时使用相应的探针分别对Cand. P. prunorum和Cand. P. pyri DNA进行相同的PCR反应，以确认其他16SrX组植原体成员不存在37。
      注意：应同时检测未感染植株的DNA作为对照，以确认该对照样本中无病原体存在。此步骤中必须确保样本不含其他亲缘关系相近的植原体物种DNA，否则会增加从非P. mali植原体物种扩增出效应子的风险。通过使用相应探针分析样本，可排除与P. mali亲缘关系相近的其他16SrX组植原体的混合感染。由于预期其他16SrX组植原体的检测结果应为阴性，因此必须设置适当的阳性对照，以验证PCR反应的有效性。

4. 扩增潜在效应子基因并亚克隆至Y2H诱饵载体

  1. 使用引物 5ˈ-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3ˈ（正向）和 5ˈ-TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3ˈ（反向），扩增苹果植原体（P. mali）的植原体基因 atp_00189（不含信号肽部分），引物5'端和3'端分别引入 EcoRI 和 SalI 限制性酶切位点。采用基于柱的DNA纯化方法纯化PCR产物。
  2. 通过 EcoRI 和 SalI 酶切连接，将扩增产物克隆至酵母双杂交诱饵载体 pLexA-N 中。
    注：此处将100 ng经EcoRI和SalI线性化的pLexA-N载体与15 ng经相同酶切处理的atp_00189 PCR扩增片段以及1 U T4连接酶混合。连接反应在总反应体积为10.0 µL的缓冲液中于16 °C过夜（14–20 h）进行，缓冲液组成为：40 mM Tris-HCl（25 °C时pH 7.9）、10 mM MgCl2、10 mM 二硫苏糖醇（DTT，Mr：154.25 g/mol）和0.5 mM 三磷酸腺苷（ATP，Mr：507.18 g/mol）。使用相同引物对未感染植原体的植株DNA进行分析，以排除引物与Malus x domestica DNA发生非特异性结合的可能性。
  3. 取1 µL连接反应混合物转化至大肠杆菌（E. coli）电转感受态细胞中，并在添加50 µg/mL硫酸卡那霉素的Luria-Bertani（LB）平板上筛选卡那霉素抗性克隆38。
  4. 根据制造商说明书，使用基于柱的质粒小提试剂盒从筛选出的细菌克隆中提取质粒DNA，并通过测序验证插入片段是否成功整合及其方向正确39。

5. 检测潜在效应蛋白的自激活（自动激活）

  1. 准备以下缓冲液和培养基：
    注意：酵母选择性平板的命名法使用连字符“-”连接培养基中缺失的氨基酸缩写。例如，SD-trp-leu-his 平板含有除色氨酸（trp）、亮氨酸（leu）和组氨酸（his）以外的所有氨基酸。
    1. 10x 脱落混合液：称取200 mg盐酸L-精氨酸（Mr：210.66 g/mol）、300 mg L-异亮氨酸（Mr：131.17 g/mol）、269 mg单水合L-赖氨酸（Mr：164.21 g/mol）、200 mg L-甲硫氨酸（Mr：149.21 g/mol）、500 mg L-苯丙氨酸（Mr：165.19 g/mol）、2 g L-苏氨酸（Mr：119.12 g/mol）、300 mg L-酪氨酸（Mr：181.19 g/mol）、200 mg L-尿嘧啶（112.09 g/mol）和1.5 g L-缬氨酸（Mr：117.15 g/mol）。将上述物质溶于1 L双蒸水中，高压灭菌溶液，并于4 °C保存。
      注意：也可直接购买预混的相应脱落混合液。
    2. 10x L-腺嘌呤补充液：称取100 mg硫酸半盐L-腺嘌呤（ade，Mr：184.17 g/mol），溶于50 mL双蒸水中，用0.22-µm孔径滤膜过滤除菌。
    3. 10x L-组氨酸补充液：称取100 mg单盐酸单水合L-组氨酸（his，Mr：209.63 g/mol），溶于50 mL双蒸水中，用0.22-µm孔径滤膜过滤除菌。
    4. 10x L-亮氨酸补充液：称取500 mg L-亮氨酸（leu，Mr：113.17 g/mol），溶于50 mL双蒸水中，用0.22-µm孔径滤膜过滤除菌。
    5. 10x L-色氨酸补充液：称取100 mg L-色氨酸（trp，Mr：204.23 g/mol），溶于50 mL双蒸水中，用0.22-µm孔径滤膜过滤除菌。
    6. SD-trp-leu-his-ade培养基及平板：将0.67% w/v酵母氮源基础（不含氨基酸）和2% w/v D-葡萄糖一水合物（Mr：198.17 g/mol）溶于双蒸水中，高压灭菌。若制备琼脂平板，则在高压灭菌前加入2% w/v琼脂（微生物级）。
    7. 制备选择性平板时，向高压灭菌后的SD-trp-leu-his-ade培养基中加入1x氨基酸储备液。制备平板时，确保琼脂冷却至约50 °C后再加入氨基酸。保持储备液无菌状态。
    8. YPAD培养基：将1% w/v酵母提取物、2% w/v蛋白胨（微生物级）、0.004% w/v硫酸半盐腺嘌呤（Mr：184.17 g/mol）和2% w/v葡萄糖一水合物溶于双蒸水中，高压灭菌。若制备YPAD琼脂平板，则在高压灭菌前加入2% w/v琼脂。制备2x YPAD时，使用上述各成分浓度的两倍。 
      注意：（可选）由于培养基中葡萄糖浓度较高，2x YPAD在高压灭菌后会变为深棕色。作为替代方案，可制备40%（w/v）葡萄糖储备液，并通过0.22-µm滤膜过滤除菌。然后在无菌条件下将过滤除菌的葡萄糖储备液加入已高压灭菌但不含葡萄糖的2x YPAD中。为避免体积误差，在制备2x YPAD时需考虑后续将加入10x葡萄糖溶液。例如，应先制备900 mL不含葡萄糖的培养基（含其他所有成分），高压灭菌后，再加入100 mL葡萄糖储备液，最终总体积为1 L。
  2. 通过乙酸锂介导的酵母转化检测自激活
    1. 从冷冻甘油菌种中划线接种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）报告菌株NMY5140（NMY51:MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4）至YPAD琼脂平板，于30 °C培养48小时。从该平板上挑取单菌落，接种至50 mL YPAD培养基中，培养酵母并定期测定OD600以监测生长情况。
    2. 使酵母生长至最终OD600为0.5–0.8。在700 x g条件下离心5分钟收集细胞，用2.5 mL高压灭菌的双蒸水重悬细胞沉淀。
    3. 取六份100 µL酵母悬液，分别加入240 µL 50% w/v聚乙二醇4000（PEG，Mr：3,500–4,000 g/mol）、36 µL 1 M二水合乙酸锂（LiOAc，Mr：102.02 g/mol）和25 µL 2% w/v鲑精DNA（已溶解）。所有试剂均使用双蒸灭菌水配制。
    4. 将含酵母悬液的六个离心管标记为“a”至“f”，并加入以下质粒载体DNA：阴性对照：(a) 1.5 µg含效应子的诱饵质粒（pLexA-N-atp0018928），(b) 1.5 µg空捕获质粒pGAD-HA41，(c) 1.5 µg空诱饵载体pLexA-N41，(d) 1.5 µg空诱饵载体pLexA-N和1.5 µg空捕获质粒pGAD-HA；阳性对照：(e) 1.5 µg阳性对照诱饵质粒DNA pLexA-p5341和1.5 µg阳性捕获质粒pACT-largeT41；自激活检测：(f) 1.5 µg含效应子的诱饵质粒（pLexA-N-atp00189）和1.5 µg空捕获质粒pGAD-HA。
    5. 剧烈混匀反应体系，在42 °C水浴中孵育45分钟。在700 x g条件下离心5分钟收集细胞，弃去上清液。用250 µL 0.9%（w/v）氯化钠溶液（NaCl，Mr：48.44 g/mol）重悬细胞，取50 µL涂布于以下选择性平板：SD-trp、SD-leu、SD-trp-leu、SD-trp-leu-his和SD-trp-leu-his-ade。
    6. 于30 °C培养3–4天。培养第一天后，用塑料封口膜密封平板，防止干燥。
    7. 观察酵母在各平板上的生长情况。 

6. 检测效应子的表达

  1. 通过 Western 印迹法检测效应子的表达，使用针对 Lex-A 标签的抗体进行检测；当效应子由 pLexA-N 表达时，Lex-A 标签位于其 N 末端42。
    注意：需注意翻译融合的 Lex-A 标签会使目标蛋白的实际分子量增加约 24 kDa。在 Western 印迹中鉴定蛋白大小时，这一点至关重要。

7. 酵母双杂交筛选

  1. 将含有 pLexA-atp00189（效应子）的 NMY51 菌株划线接种于新鲜的 SD-trp 平板上，于 30 ℃ 培养 2–3 天 °C，直至出现红色菌落。
  2. 从琼脂平板上挑取一个红色菌落，接种于装有3 mL SD-trp培养基的小型摇瓶中，30℃过夜培养 °37°C，120 - 150 rpm 摇床培养。
  3. 在摇瓶中，将1 mL过夜培养物接种至20 mL SD-trp培养基中，培养8小时。
  4. 调节培养物至 OD600 = 0.2，加入SD-trp培养基，并将10 mL起始培养物分别接种至两份100 mL的摇瓶培养基中。在30℃下振荡培养过夜 °C.
    注意：确保酵母的生长未达到 OD600 > 0.5，并用新鲜的 SD-trp 稀释。
  5. 测量OD600 以及沉淀物 120 OD600 "单位" 例如，如果 OD600 测得OD600为1.2时，将100 mL菌液离心，弃上清，将菌体沉淀重悬于800 mL预热的2x YPAD培养基中，置于含磁力搅拌子的摇瓶内。
    1. 离心2 mL样品，弃去上清液，并将沉淀重悬于水中。确保OD600 酵母悬液的浓度应在0.15至0.2之间。若不符合，可用2x YPAD调整，或添加更多过夜培养的酵母。
      注意：2x YPAD 呈深棕色，可能影响 OD 测定结果。因此，在测定 OD 前必须将酵母细胞重悬于水中。作为替代方案，可参照步骤 5.1.8 的注释，将葡萄糖单独灭菌后配制 2x YPAD，以防止培养基颜色变深。
  6. 将剩余的酵母培养物置于适当大小的摇瓶中（800 mL 置于 2 L 摇瓶中，或 2 × 400 mL 分装至两个 1 L 摇瓶中），在 30 ℃ °C，120 - 150 rpm。测定OD600 约每1.5小时一次，直至OD600 当OD600达到0.6时（需4–6小时）。在此期间，准备下一步中所述的溶液。
  7. 乙酸锂介导的转化
    1. 将2% w/v的鲑鱼精子DNA溶于水中，煮沸500 µL，于100℃水浴中加热5分钟 °C. 将离心管置于冰上 2 分钟，然后重复加热步骤。DNA 在进一步使用前需始终保持在冰上。
    2. 配制以下混合液：
      1. TE/LiOAC 混合液：取 3.08 mL 1 M LiOAC、3.08 mL 100 mM Tris/10 mM EDTA（pH：7.5）和 21.84 mL 无菌双蒸水，混匀。
      2. PEG/LiOAc 混合液：将 4.2 mL 1 M LiOAc、4.2 mL mM Tris/10 mM EDTA（pH：7.5）和 33.6 mL 50%（w/v）PEG 4000 混合。
    3. 将800 mL酵母培养物（OD600 在700 × g下离心5分钟（OD600 = 0.6），使细胞沉淀。弃去上清液，将沉淀重悬于200 mL无菌双蒸水中。再次在700 × g下离心5分钟，收集细胞沉淀并弃去上清液。注意：如有需要，可将悬液分装至多个离心管中进行离心。7.7.3和7.7.4步骤中的液体体积均指来自800 mL悬液所获得的完整沉淀。
    4. 将沉淀重悬于16 mL TE/LiOAc混合液中（见步骤7.7.1.1）；在700 × g离心5分钟，弃上清。将沉淀重悬于9.6 mL TE/LiOAc混合液中。
    5. 在适当大小的聚丙烯反应管中配制以下反应混合物：12 个含有 7 的小管 µpGAD-HA-cDNA文库载体100 g µ2%鲑鱼精DNA（见步骤7.7）1 L，PEG/LiOAc混合液2.5 mL。加入600 µ将步骤7.10中的酵母细胞悬浮液各1 L加入12个试管中，剧烈振荡混合1分钟。
    6. 将反应混合物在 30 °C 下孵育 45 分钟 °在水浴中于 C 条件下孵育，每 15 分钟剧烈振荡混合一次。加入 160 µL DMSO 加入每个小管中，充分混匀。在 42 ℃ 下再孵育混合物 20 分钟 °C.
    7. 在 700 × g 离心 5 分钟，弃上清，将每份沉淀重悬于 3 mL 2x YPAD 中。将所有细胞（共 12 个管，总计 36 mL）合并至一个 100 mL 摇瓶中，在 30 °C 振荡培养 90 分钟。 °C 和 120 rpm。
    8. 离心5分钟（700 × g），收集菌体沉淀，弃上清液。将沉淀重悬于4.5 mL无菌0.9%（w/v）NaCl溶液中，用10 mL血清移液管轻轻吹打数次，充分混匀。吸取50 μL µL，并用0.9% NaCl将样品从1:10至1:1,000进行十倍系列稀释。取100 μL稀释液涂布平板 µ每种稀释液取 L 接种于含 SD-trp-leu 琼脂的 90 mm 培养皿中。
    9. 将剩余未稀释的酵母重悬液涂布于直径为16 mm × 150 mm的SD-trp-leu-his-ade琼脂培养皿中。向培养基中加入3-AT以减少自激活现象。将SD-trp-leu平板和SD-trp-leu-his-ade平板分别在30 °C下培养3天和4天。 °C.
      注意：在选择性平板上出现的克隆为（潜在的）相互作用配对，含有编码与诱饵相互作用伴侣的pGAD-HA质粒。
    10. 通过计数不同梯度稀释液在 SD-trp-leu 选择平板上的菌落数量来确定转染效率。用无菌移液器吸头挑取单克隆并划线接种至新鲜的 SD-trp-leu-his-ade 选择平板上，以转移每个克隆。将平板置于 30 °C 培养 24 h。 °C. 每天重复此步骤，直至完成五次传代。

8. 选择性平板上克隆的分析

  1. 在无菌操作台中，为每个克隆准备一支无菌的2 mL离心管，每管加入1 mL SD-trp-leu-his-ade培养基。用灼热的针头在每支离心管盖上打一个小孔，并用透气封膜覆盖小孔。取第7.17步中获得的单个克隆的新鲜菌落材料，分别接种至各离心管中（使用转化后5th 传代）并在30℃下孵育24 h °C，150 rpm 摇床振荡。
    注意：必须从新鲜的平板上挑取克隆，因为从4℃保存数天的平板上获取的酵母可能会影响实验结果。 °C在液体培养基中24小时内无法充分生长。
  2. 在 4,000 × g 离心 5 分钟使酵母沉淀，弃去上清液。将沉淀物重悬于适当的重悬缓冲液（来自相应的质粒 DNA 小量提取试剂盒）中，并转移至新的 2.0 mL 反应管。加入 100 µ酸洗玻璃珠（425–600 微米）Lµm 直径）并剧烈混合 5 分钟。
  3. 加入相应的裂解缓冲液，然后按照试剂盒说明书使用质粒提取小型试剂盒进行质粒纯化。用50 μL洗脱液洗脱质粒DNA µ升水
  4. 使用第8.3步获得的DNA，以捕食质粒特异性引物GAL4ADseq进行测序反应41 5'- ACCACTACAATGGATGATG -3'
  5. 通过以下步骤验证相互作用 从头合成 共转化43,44 诱饵载体和猎物载体。在SD-trp-leu-his-ade选择培养基上筛选转化后的酵母。

结果

在进行实际的酵母双杂交筛选之前，必须先检测诱饵蛋白是否存在自激活作用。这一步通过将诱饵表达载体与空的猎物文库载体共同转化酵母细胞，并检测其在选择性培养板上的生长情况来实现。

为了分析植原体蛋白ATP_00189是否具有自激活能力，按照第5节所述进行自激活检测。诱饵质粒可互补S. cerevisiae NMY51的色氨酸（trp）营养缺陷型，而猎物质粒可互补其亮氨酸（leu）营养缺陷型40。因此，成功的共转化表现为酵母在缺乏色氨酸和亮氨酸的筛选平板上生长。若诱饵蛋白与猎物蛋白之间发生相互作用，则可实现对NMY51组氨酸（his）和腺嘌呤（ade）营养缺陷型的互补。如果诱饵蛋白在无相互作用的情况下出现自激活，则酵母可在缺乏组氨酸和腺嘌呤的筛选平板上生长。自激活可分为强自激活和弱自激活两种情况：强自激活表现为共转化酵母在缺乏trp、leu、his和ade的筛选平板上生长；弱自激活则表现为酵母在缺乏trp、leu和his的平板上生长，但在缺乏trp、leu、his和ade的平板上不生长。适当的阳性对照对于正确解读自激活实验结果至关重要。自激活实验的预期结果及其解释总结于表1，并展示于图1中。

酵母双杂交实验结果；培养基平板上的生长模式表明蛋白质相互作用。
图1： 在进行酵母双杂交筛选前诱饵自激活检测的示例. S. cerevisiae 将NMY51与相互作用的诱饵质粒（pLEX-p53）和猎物质粒（pACT-largeT）共转化作为阳性对照（左侧面板：a-c），一个微弱自激活的诱饵载体和一个空的猎物文库载体（中图：d-f）以及一个非自激活的诱饵与空猎物文库载体（右侧面板：g-i）。共转化的酵母在缺乏色氨酸和亮氨酸的SD平板上培养（上图：a，d，g）、trp、leu 和 his（中间面板：b，e，h）以及 trp、leu、his 和 ade（下图：c，f，i）。在缺乏色氨酸（trp）和亮氨酸（leu）的培养基上筛选是共转化成功的阳性对照，因为诱饵载体可弥补NMY51菌株的色氨酸营养缺陷，而猎物载体可弥补其亮氨酸营养缺陷（在SD-trp-leu培养基上生长）。当诱饵与猎物之间存在相互作用，或诱饵发生自激活时，NMY51的报告基因表达被激活，从而弥补组氨酸（his）和腺嘌呤（ade）的营养缺陷（在SD-trp-leu-his-ade培养基上生长）。弱自激活表现为在SD-trp-leu-his培养基上生长中图，d-f）。在进行酵母双杂交筛选前，必须先减弱诱饵蛋白的弱自激活作用， 例如 通过向选择性培养基中添加3-AT实现。氨基酸缺失在相应培养基名称中以“-”表示。 请点击此处以查看此图的放大版本。

pLexA-N-atp00189无菌落无生长无生长无生长无生长
无pGAD-HA无生长菌落无生长无生长无生长
pLexA-N无菌落无生长无生长无生长无生长
pLexA-NpGAD-HA菌落菌落菌落无生长无生长
pLexA-p53pACT-largeT菌落菌落菌落菌落菌落
pLexA-N-atp00189pGAD-HA菌落菌落菌落无生长无生长

表1：诱饵自激活实验的预期结果。 将不同特性的诱饵和猎物共转化至S. cerevisiae NMY51菌株后，在选择性培养基上表现出差异性生长。在30 °C下培养72小时后，评估不同载体组合（a-f）转化后的生长情况。弱自激活表现为酵母在SD-trp-leu-his培养基上生长，强自激活则表现为在无互作伙伴存在时，酵母在SD-trp-leu-his-ade选择性培养基上生长。由pLexA-N编码的植原体效应子ATP_00189不表现出自激活特性，即当诱饵载体转化NMY51后，在缺乏组氨酸和腺嘌呤的条件下无法生长。

根据诱饵的不同，酵母双杂交筛选可能获得大量在选择性平板上生长的酵母克隆。所有克隆都必须进行分析，并检查是否存在可能的冗余。即使使用了均一化的cDNA文库，一个互作蛋白仍很可能在多个不同的克隆中出现。根据文库构建的克隆技术，某些猎物载体中可能仅插入了完整基因的部分片段。因此，建议从cDNA出发重新扩增（de novo）并亚克隆互作蛋白的全长基因，并在一对一酵母双杂交分析中验证该相互作用（图2）。

酵母双杂交实验结果。BD-ATP_00189 与 AD-MdTCP 蛋白的相互作用。
图2： 酵母双杂交实验中诱饵与猎物相互作用的示例 酵母双杂交（Y2H）筛选实验完成后，提取阳性互作克隆中的质粒。对捕获载体进行测序，并对 Malus x domestica 鉴定出与宿主相互作用的蛋白伙伴MdTCP24和MdTCP25。作为阴性对照，同时对酵母双杂交文库筛选中未发现互作蛋白的MdTCP34进行亚克隆。从苹果cDNA中扩增获得全长基因，亚克隆至捕食载体（共顺反子表达激活结构域AD）中 从头合成 与表达细菌效应子ATP_00189与DNA结合域（BD）融合的诱饵载体共转化。该图来自 28. 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

在酵母双杂交（Y2H）筛选中，将潜在的效应蛋白与不同的假定相互作用蛋白共同表达（步骤7）。每个生长的酵母克隆均含有诱饵，但可能含有不同的相互作用蛋白。这些相互作用蛋白由克隆至猎物质粒中的cDNA文库编码。诱饵质粒和猎物质粒各自共转录编码酵母转录因子的一部分。当诱饵（效应蛋白）与猎物质粒编码的相互作用蛋白发生物理相互作用时，转录因子的两个部分（DNA结合域和激活域）得以结合，从而诱导报告基因的表达。酵母因此能够在缺乏组氨酸和腺嘌呤的SD选择培养基上生长。猎物cDNA文库的类型取决于被筛选的效应蛋白，需据此合理选择。猎物与诱饵载体以及酵母菌株之间必须相互兼容。本实验中采用LexA DNA结合域和Gal4激活域作为相容的酵母转录因子元件。cDNA文库可自行构建、定制或商业获取。cDNA猎物文库的制备不属于本实验方案的内容。本方案中使用的cDNA文库为基于中国台湾地区感染植原体的木本寄主植物RNA自行构建的均一化cDNA文库 Malus x domestica 叶片被使用并克隆至pGAD-HA中41将表达效应子（诱饵）的酵母菌株与猎物文库共转化，并在缺乏组氨酸和腺嘌呤的SD选择培养板上筛选克隆。为从酵母菌落中提取质粒DNA，建议使用基于柱式的细菌质粒小提试剂盒，并结合使用玻璃珠进行机械破碎以提高酵母细胞裂解效率（步骤8）。在此质粒纯化过程中，诱饵载体和猎物载体将同时被纯化，浓度相对较低。然而，所获得的质粒DNA量足以通过测序直接鉴定相互作用蛋白，无需预先扩增质粒（步骤8.4）。作为替代方案，步骤8.4中纯化的DNA可转入感受态 E. coli 并利用猎物载体介导的抗生素抗性进行筛选（例如， 氨苄青霉素（若使用pGAD-HA载体） E. coli 菌落仅携带 pGAD-HA 文库质粒，可利用这些克隆进行高产量质粒纯化。

成功转化pLexA-N和pGAD-HA载体可弥补NMY51菌株的色氨酸和亮氨酸营养缺陷型。效应子与一种蛋白质（由pGAD-HA编码）之间的相互作用会激活NMY51菌株中的报告系统。在自激活的情况下，将表达效应子的pLexA-N载体与空文库载体pGAD-HA共转化至NMY51中，会因NMY51报告系统的非预期激活而在缺乏trp-leu-his-ade的筛选培养基上生长40。自激活可能较弱，仅在缺乏trp-leu-his的条件下出现；也可能较强，表现为在trp-leu-his-ade平板上的明显生长41。自激活会在实际的酵母双杂交（Y2H）筛选中导致大量假阳性克隆背景。为避免此问题，必须对诱饵进行自激活检测，即将表达效应子的载体与空文库载体共转化。在此实验条件下，不应诱导报告基因的表达。若在检测中观察到自激活（即在选择性平板上出现生长），可在培养基中添加不同浓度的3-氨基-1,2,4-三唑45（3-AT）。3-AT是咪唑甘油磷酸脱水酶（HIS3）的抑制剂，而HIS3是组氨酸生物合成过程中的关键酶46。添加3-AT可减弱Y2H筛选中的弱自激活效应47,48。应测试不同浓度的3-AT，在本方案中使用了1–40 mM的3-AT。后续Y2H筛选应采用能够抑制自激活的最低3-AT浓度。自激活检测的选择性平板只有在共转化的SD-trp-leu平板上含有足够数量的克隆时方可评估。一般而言，每90 mm（直径）培养皿中不少于500个菌落即为充足。为准确测定转染效率，建议对共转化的酵母细胞进行系列稀释，并涂布于SD-trp-leu平板上。

为了降低自激活效应，可将效应子克隆至pLexA-C载体中，这是一种诱饵表达载体，可将LexA标签融合至目标蛋白的C末端。LexA标签的朝向可能减弱自激活效应24。然而，并非在所有情况下都能成功降低或消除自激活。出现红色或红褐色菌落表明可能存在微弱或假阳性相互作用。NMY51菌株中的ade2报告基因仅在发生蛋白-蛋白相互作用时被激活，从而阻止该酵母菌株中红色色素的积累40。在无相互作用的情况下，NMY51菌落呈红褐色，而携带强相互作用蛋白的菌落则为白色。因此，在筛选平板上观察菌落颜色可为进一步判断相应菌落是否为真阳性或假阳性相互作用提供重要依据。

最终需要根据诱饵蛋白的性质及相互作用特征，对某些检测条件进行调整或改变。目前，针对常见的酵母双杂交系统，已建立多种改进方法和衍生技术，可用于在不同宿主系统中分析较难处理的蛋白质相互作用。Stynen et al.49 的综述详细讨论并描述了酵母双杂交技术的不同方面、其改进与适应性优化，为如何选择合适的相互作用检测方法提供了有益的信息。

Y2H 筛选及其衍生技术已广泛应用于需要鉴定二元蛋白质相互作用的各个研究领域。即使进行了关键性对照实验，例如诱饵的自激活检测以及对鉴定出的相互作用蛋白进行一对一的重新转化验证，Y2H 仍容易产生假阳性或假阴性结果26,50,51。酵母作为模型系统并不适用于所有类型的相互作用研究。酵母细胞环境不一定能够支持所有蛋白质的正确翻译后修饰和正确折叠24。此外，在 Y2H 实验中，蛋白质处于过表达状态，其表达不受天然启动子调控。Y2H 将蛋白质相互作用伙伴强制定位至细胞核内，而该位置未必是其天然的亚细胞定位。因此，酵母系统可能无法真实反映蛋白质在原生细胞环境中的相互作用情况，从而导致假阴性或假阳性结果。大多数 Y2H 实验基于酵母营养缺陷型互补作为筛选原理。这种营养选择具有高灵敏度，但与其它检测方法（例如，显色报告基因检测）相比，选择性较低49。若某个效应子存在无法消除的自激活现象（见上文）或其他限制因素，则 Y2H 并非合适的检测手段25。表 1 和 图 1 展示了自激活测试的预期结果。真实相互作用的缺失（即 假阴性）可能由蛋白毒性、翻译后加工异常、相互作用的空间位阻、猎物文库中特定互作蛋白丰度过低、诱饵蛋白定位于膜结构，或缺乏相互作用所必需的辅助因子等原因引起24。

建议从 cDNA 中从头扩增已鉴定的相互作用蛋白的全长基因，将其亚克隆至 pGAD-HA 载体中，并将构建好的 pGAD-HA 质粒转化至表达诱饵蛋白的 NMY51 菌株，以进行一对一相互作用检测。这是必要的，因为猎物文库中发现的相互作用蛋白可能仅为完整蛋白的一个片段。然而，仅当存在充足的基因组和转录组序列数据时，才可获得相应全长基因的信息。此处所述自激活检测的转化方案同样适用于此类一对一检测，且诱饵蛋白与相互作用蛋白之间的相互作用必须可重复验证。

酵母双杂交筛选中鉴定出的相互作用必须始终通过另一种独立的技术加以验证。该独立技术应更接近实际蛋白质-蛋白质相互作用的天然环境。对于植原体效应子ATP_00189而言，其与TCP转录因子之间的相互作用 Malus x domestica 已验证 在植物体内 双分子荧光互补（BiFC）实验中 Nicotiana benthamiana 原生质体28 （非本实验方案内容）。效应蛋白ATP_00189来源于植物病原菌P. mali。 在植物体内 因此选择BiFC来验证ATP_00189与目标蛋白的相互作用 Malus x domestica 转录因子 此前在酵母双杂交（Y2H）中已鉴定28BiFC 是一种蛋白质-蛋白质相互作用检测方法，其报告系统无需相互作用的蛋白质发生向细胞核的亚细胞转位即可被激活52此外， 在植物体内 表达与修饰机制模拟了植物细菌效应子在其植物宿主中自然相互作用的环境。然而，使用BiFC进行全局筛选并不可行。

本方案中有多个步骤必须仔细处理。在扩增目的基因时（步骤4），必须排除引物与植物DNA发生结合的可能性，因此需以未感染植株的DNA作为阴性对照。目的基因序列中不得含有用于定向克隆的EcoRI和SalI限制性酶切位点；若序列中包含这些位点，则必须选择其他限制性内切酶进行克隆。酵母转化是本方案中的核心方法，其转染效率取决于酵母细胞的感受态、活力、生长状态以及转染试剂的质量53,54。建议在进行转化操作时，使用新鲜平板培养的酵母，平板存放时间不应超过两周（4 °C保存）。若使用陈旧琼脂平板上的菌落接种选择性液体培养基，常会导致转化后酵母生长延迟。此外，建议使用液体预培养物作为实际实验的接种物，而非直接从平板取用酵母。当将猎物质粒转入表达诱饵蛋白的酵母细胞时，若转染效率过低，可能导致某些猎物蛋白（潜在互作蛋白）在文库中丰度不足，从而影响整个筛选结果的代表性。在本方案中，酵母转染效率达到约150,000 cfu/µg转染DNA时，Y2H筛选效果良好。

了解酵母双杂交（Y2H）技术的缺陷与局限性，并以批判性和恰当的方式解读实验结果，对于得出正确结论至关重要。Y2H实验及其衍生技术已应用多年，针对不同诱饵蛋白的特性、相互作用的亚细胞定位、预期的结合伙伴以及其他可能影响相互作用的因素，该技术已历经诸多改进与优化（参见Y3H55,56,57）。近年来，已开发出基于阵列的Y2H筛选方法，可实现对大量诱饵蛋白与数百万猎物蛋白的自动化、高通量分析58。未来该技术的发展方向很可能是走向自动化和高通量，以促进不同研究领域中复杂信号通路和相互作用组的解析。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢Laimburg研究中心的Christine Kerschbamer、Thomas Letschka、Sabine Oettl、Margot Raffeiner和Florian Senoner，以及Dualsystems Biotech AG的Mirelle Borges Dias Schnetzer提供的技术支持，感谢Julia Strobl对稿件的校对。本工作作为APPL2.0项目的一部分完成，并得到了意大利博尔扎诺自治省和南蒂罗尔苹果协会的部分资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）ApplichemA6284用于 DNA 制备
三羟甲基氨基甲烷（Tris）ApplichemA2264用于培养基和缓冲液
氯化钠（NaCl）ApplichemA2942用于培养基和缓冲液
乙二胺四乙酸二钠盐（NaEDTA）ApplichemA2937用于培养基和缓冲液
N-月桂酰基肌氨酸钠盐ApplichemA7402用于 DNA 提取
乙酸铵 Sigma-Aldrich（Fluka）9688用于 DNA 提取
2-巯基乙醇ApplichemA1108用于 DNA 提取
异丙醇（2-丙醇）ApplichemA3928用于 DNA 提取
乙醇Sigma-Aldrich（Fluka）51976用于 DNA 提取
RNA酶ApplichemA2760用于DNA制备
氯仿:异戊醇 24:1ApplichemA1935用于 DNA 提取
校读聚合酶（例如 iProof伯乐（Bio-Rad）203433用于 PCR
EcoRIThermo ScientificER0271用于克隆
SalIThermo ScientificER0641用于克隆
基于柱的DNA纯化试剂盒（例如 QIAquickQiagen28104用于克隆
硫酸卡那霉素ApplichemA1493用于微生物学筛选
3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）Sigma-AldrichA8056用于自激活检测
L-精氨酸单盐酸盐 ApplichemA3680用于酵母培养
L-异亮氨酸 ApplichemA3642用于酵母培养
L-赖氨酸一水合物 ApplichemA3448用于酵母培养
L-甲硫氨酸 ApplichemA3897用于酵母培养
L-苯丙氨酸 ApplichemA3464用于酵母培养
L-苏氨酸 ApplichemA3946用于酵母培养
L-酪氨酸 ApplichemA3401用于酵母培养
L-尿嘧啶ApplichemA0667用于酵母培养
L-缬氨酸 ApplichemA3406用于酵母培养
L-腺嘌呤半硫酸盐 ApplichemA1596用于酵母培养
0.22 µm 微孔滤膜赛多利斯16541用于无菌过滤
L-组氨酸单盐酸盐ApplichemA3719用于酵母培养
L-亮氨酸 ApplichemA3496用于酵母培养
L-色氨酸 ApplichemA3410用于酵母培养
酵母氮源基础培养基 Sigma-Aldrich51483用于酵母培养
D-葡萄糖一水合物 ApplichemA1349用于酵母培养
琼脂Fisher ScientificBP2641-1用于酵母和细菌培养
蛋白胨ApplichemA2208用于酵母培养
聚乙二醇 4000（PEG）ApplichemA1249用于酵母转化
乙酸锂二水合物（LiOAc）ApplichemA3478用于酵母转化
鲑鱼精子DNA ApplichemA2159用于酵母转化
Lex-A 标签抗体（例如 抗LexA DNA结合区Millipore06-719用于蛋白质印迹检测
质粒小提试剂盒（例如 GenElute 质粒小提试剂盒Sigma-AldrichPLN350用于从酵母和细菌中进行质粒纯化
酸洗玻璃珠Sigma-AldrichG8772用于从酵母中进行质粒纯化
氨苄青霉素钠盐ApplichemA0839用于微生物学筛选
酵母提取物ApplichemA1552用于酵母培养
真空浓缩离心机例如 浓缩仪 5301EppendorfZ368245 (Sigma)用于 DNA 提取
诱饵载体（例如 pLexA-NDualsystemsP01004用于酵母双杂交实验
猎物载体（例如 pGAD-HADualsystemsP01004用于酵母双杂交实验
对照猎物载体例如 pLexA-p53DualsystemsP01004用于酵母双杂交实验
对照诱饵载体（例如 pACT-largeTDualsystemsP01004用于酵母双杂交实验
电转感受态 E. coli (例如 MegaX DH10B T1R 电转感受态细胞InvitrogenC640003用于克隆
酵母报告菌株（NMY51：MATa his3）Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4 例如 NMY51DualsystemsP01004用于酵母双杂交实验
塑料石蜡膜（例如 Parafilm MSigma-AldrichP7793-1EA用于酵母和细菌培养
透气封膜例如 BREATHseal格赖纳676 051用于酵母培养
PCR 扩增仪例如 T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096用于 PCR
定量PCR仪例如 CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统Bio-Rad1855195用于定量 PCR
微型离心机（例如 Centrifuge 5417 REppendorf5417 R通用实验设备
离心机例如 Centrifuge 5804 REppendorf5804 R通用实验设备
无核酸酶水（DNA酶-free，RNA酶-free，蛋白酶-free）5端2500010用于 PCR 和 DNA 操作
刀片Swann-Morton0301用于 DNA 提取
无菌滤器（0.22 µm；聚醚砜VWR-International514-0073（欧洲目录编号）用于酵母和细菌培养
培养皿 Ø 90 mm Greiner Bio-One633180用于酵母和细菌培养
培养皿 Ø 150 mm Greiner Bio-One639161用于酵母培养
分光光度计（例如 BioPhotometerEppendorf550507804用于酵母培养
分光光度计比色皿JoVE759015用于酵母培养
水浴锅（例如 水浴锅 Memmert WB7MemmertWB7用于酵母转化
Western Blot 仪器设备Bio-Rad多样的用于蛋白质检测
dNTPs5端2201210用于克隆
锥形瓶（100 mL；1,000 mL；2,000 mL）及透气棉塞例如 杜伦氏锥形瓶（Erlenmeyer 窄口烧瓶）Sigma AldrichZ232793, Z232858, Z232866用于酵母和细菌培养
摇床培养箱例如 GFL 3031GFL3031用于酵母和细菌培养
培养箱结合蛋白KB 53（E3.1）用于酵母和细菌培养
制冰机（例如 冰机 IF 825OmniwashIF 825通用实验设备
0.2 mL、1.5 mL 和 2.0 mL 反应管（聚丙烯）Eppendorf0030.124.332（0.2 ml）；0030.123.328（1.5 ml）；0030.123.344（2.0 ml）通用实验设备
移液器和一次性移液器吸头（不同体积：10 - 1,000） µL)Eppendorf多样的通用实验设备
传播者Sigma-AldrichSPR-L-S01用于酵母和细菌培养
涡旋振荡器（例如 MS 3 MinishakerIKA3617000通用实验设备
T4连接酶Thermo FisherEL0011用于克隆
冰箱（4 °C) (例如 Liebherr Medline FKEX 5000Liebherr81.767.580.4通用实验设备
冷冻柜（-20 °C) (例如 Liebherr Comfort Professional G5216LiebherrG5216通用实验设备
量筒（例如 品牌Sigma AldrichZ327352；Z327417；Z327441  通用实验设备
血清移液管例如 FisherbrandThermo FisherS55701用于酵母和细菌培养
移液器（机械式）例如 Pipetboy acu 2Integra-Biosciences155000通用实验设备
电穿孔比色皿（1 mm）分子生物产品5510-11用于细菌转化
电穿孔仪（例如 EporatorEppendorf4309000019用于细菌转化
凝胶与印迹成像系统（例如 ChemiDoc MP 系统Bio-Rad1708280通用实验设备
锥形离心管（聚丙烯）（50 mL）VWR-International 525-0403（欧洲目录编号）通用实验设备
锥形离心管（聚丙烯）（13 mL）BD Falcon352096通用实验设备
二硫苏糖醇（DTT；1 M）Thermo ScientificP2325用于连接
三磷酸腺苷（ATP， 例如 ATP溶液（10 mM）Ambion AM8110G（由 Thermo Scientific 分销）用于连接
不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和腺嘌呤的脱落混合物（DO, 例如 酵母合成缺陷型培养基补充剂Sigma-AldrichY2021 Sigma 用于酵母培养（现成混合液）

参考文献

  1. Fields, S., Song, O. -K. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Dombrosky-Ferlan, P. -M., Corey, S. -J. Yeast two-hybrid in vivo association of the Src kinase Lyn with the proto-oncogene product Cbl but not with the p85 subunit of PI 3-kinase. Oncogene. 14, 2019-2024 (1997).
  3. Singh, R. Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiol. 160, 477-487 (2012).
  4. Lee, H. -J., et al. Interaction of NADPH oxidase 1 with Toll-like receptor 2 induces migration of smooth muscle cells. Cardiovasc. Res. 99, 483-493 (2013).
  5. Del Bene, F., Tessmar-Raible, K., Wittbrodt, J. Direct interaction of geminin and Six3 in eye development. Nature. 427 (6976), 745-749 (2004).
  6. Kumar, A., Godwin, J. -W., Gates, P. -B., Garza-Garcia, A. -A., Brockes, J. -P. Molecular Basis for the Nerve Dependence of Limb Regeneration in an Adult Vertebrate. Science. 318 (5851), 772-777 (2007).
  7. Park, S. -Y., et al. Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
  8. Selyunin, A. S., et al. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469 (7328), 107-111 (2011).
  9. Uetz, P., et al. Herpesviral Protein Networks and Their Interaction with the Human Proteome. Science. 311 (5758), 239-242 (2006).
  10. Ushioda, R., Hoseki, J., Araki, K., Jansen, G., Thomas, D. Y., Nagata, K. ERdj5 Is Required as a Disulfide Reductase for Degradation of Misfolded Proteins in the ER. Science. 321 (5888), 569-572 (2008).
  11. Young, K. -H. Yeast two-hybrid: so many interactions, (in) so little time. Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998).
  12. Krachler, A. M., Woolery, A. R., Orth, K. Manipulation of kinase signaling by bacterial pathogens. J. Cell Biol. 195 (7), 1083-1092 (2011).
  13. Hewezi, T., Baum, T. J. Manipulation of Plant Cells by Cyst and Root-Knot Nematode Effectors. Mol. Plant Microbe Interact. 26 (1), 9-16 (2012).
  14. McGhie, E. J., Brawn, L. C., Hume, P. J., Humphreys, D., Koronakis, V. Salmonella takes control: effector-driven manipulation of the host. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 117-124 (2009).
  15. Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
  16. Navarro-Garcia, F., Serapio-Palacios, A., Ugalde-Silva, P., Tapia-Pastrana, G., Chavez-Dueñas, L. Actin Cytoskeleton Manipulation by Effector Proteins Secreted by Diarrheagenic Escherichia coli Pathotypes. Biomed. Res. Int. 2013, 22(2013).
  17. Bhat, B. S., Shanaz, E. Effectors-Role in Host-Pathogen Interaction. J. Agr. Env. Sci. 3 (2), 265-285 (2014).
  18. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449 (7164), 827-834 (2007).
  19. Natale, P., Brüser, T., Driessen, A. -J. -M. Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane-Distinct translocases and mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1778 (9), 1735-1756 (2008).
  20. Costa, T. R. D., et al. Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nat Rev Micro. 13 (6), 343-359 (2015).
  21. Tseng, T. -T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 1-9 (2009).
  22. MacLean, A. M., et al. Phytoplasma effector SAP54 hijacks plant reproduction by degrading MADS-box proteins and promotes insect colonization in a RAD23-dependent manner. PLoS Biol. 12 (4), e1001835(2014).
  23. Sugio, A., Kingdom, H. N., MacLean, A. M., Grieve, V. M., Hogenhout, S. A. Phytoplasma protein effector SAP11 enhances insect vector reproduction by manipulating plant development and defense hormone biosynthesis. Proc Natl Acad Sci. 108 (48), 1254-1263 (2011).
  24. van Criekinge, W., Beyaert, R. Yeast Two-Hybrid: State of the Art. Biol Proced Online. 2 (1), 1-38 (1999).
  25. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int. J. Mol. Sci. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  26. Serebriiskii, I., Estojak, J., Berman, M., Golemis, E. A. Approaches to Detecting False Positives in Yeast Two-Hybrid Systems. Biotech. 28 (2), 328-336 (2000).
  27. Golemis, E. A., Serebriiskii, I., Law, S. F. The yeast two-hybrid system: criteria for detecting physiologically significant protein-protein interactions. Curr. Issues Mol. Biol. 1 (1-2), 31-45 (1999).
  28. Janik, K., Mithöfer, A., Raffeiner, M., Stellmach, H., Hause, B., Schlink, K. An effector of apple proliferation phytoplasma targets TCP transcription factors - a generalized virulence strategy of phytoplasma. Mol. Plant Pathol. , (2016).
  29. Strauss, E. Microbiology. Phytoplasma research begins to bloom. Science. 325 (5939), 388-390 (2009).
  30. Kartte, S., Seemüller, E. Variable response within the genus Malus to the apple proliferation disease. J. Plant Dis. Protect. 95 (1), 25-34 (1988).
  31. Bovey, R. Observations and experiments on apple proliferation disease. Phytopath. Mediterr. 2 (3), 111-114 (1963).
  32. Schlink, K., Reski, R. Preparing High-Quality DNA From Moss (Physcomitrella patens). Plant. Mol. Biol. Rep. 20, 423(2002).
  33. Applichem. N-Lauroylsarcosine sodium salt. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A7402_en_GB.pdf (2015).
  34. Applichem. 2-Mercaptoethanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1108_en_GB.pdf (2015).
  35. Applichem. 2-Propanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
  36. Applichem. Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1). , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
  37. Mehle, N., Nikolić, P., Gruden, K., Ravnikar, M., Dermastia, M. Real-time PCR for specific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. Methods Mol. Biol. 938, 269-281 (2013).
  38. Applichem. Kanamycin sulfate. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1493_en_GB.pdf (2015).
  39. Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
  40. Lentze, N., Auerbach, D. Membrane-Based Yeast Two-Hybrid System to Detect Protein Interactions. Current Protocols in Protein Science. , Wiley Interscience. 1917-1952 (2008).
  41. Dualsystems Biotech AG. DUALhubrid Kit - Manual P01004 B06. www.dualsystems.com. , 1-44 (2012).
  42. Kurien, B. -T., Scofield, R. -H. Protein Blotting and Detection. , Humana Press. (2009).
  43. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  44. Yeast Transformation and Cloning. , JoVE Science Education Database. Cambridge, MA (USA). (2016).
  45. Sigma-Aldrich. 3-Amino-1,2,4-triazole. , http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=IT&language=EN-generic&productNumber=A8056&brand=SIGMA&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Fsigma%2Fa8056%3Flang%3Dit (2016).
  46. Ames, B. -N. The Biosynthesis of Histidine: d-erythro-Imidazole-Glycerol Phosphate Dehydrase. J. Biol. Chem. 228, 131-143 (1957).
  47. Joung, J. -K., Ramm, E. -I., Pabo, C. -O. A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions. Prot Natl Acad Sci. 97, 7382-7387 (2000).
  48. Brennan, M. -B., Struhl, K. Mechanisms of Increasing Expression of a Yeast Gene in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 136, 333-338 (1980).
  49. Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
  50. Hengen, P. -H. Methods and reagents: False positives from the yeast two-hybrid system. Trends Biochem Sci. 22 (1), 33-34 (1997).
  51. Vidalain, P. -O., Boxem, M., Ge, H., Li, S., Vidal, M. Increasing specificity in high-throughput yeast two-hybrid experiments. Methods. 32 (4), 363-370 (2004).
  52. Pattanaik, S., Werkman, J. -R., Yuan, L. Bimolecular Fluorescence Complementation as a Tool to Study Interactions of Regulatory Proteins in Plant Protoplasts. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. Yuan, L., Perry, E. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 185-193 (2011).
  53. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of Intact Yeast Cells Treated with Alkali Cations. J. Bacteriol. 153 (1), (1983).
  54. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  55. Bernstein, D. -S., Buetr, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
  56. Stumpf, C. -R., Opperman, L., Wickens, M. Analysis of RNA-Protein Interactions Using a Yeast Three-Hybrid System. Methods Enzymol. 449, 295-315 (2008).
  57. Cottier, S., et al. The yeast three-hybrid system as an experimental platform to identify proteins interacting with small signaling molecules in plant cells: potential and limitations. Front. Plant Sci. 2, 1-12 (2011).
  58. Häuser, R., Stellberger, T., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).

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