从新生小鼠胰腺中有效分离功能性胰岛

摘要

本文介绍了一种从新生小鼠中分离完整胰岛的实验方案。胰腺经胶原酶部分消化后，进行洗涤和手工挑选。每只新生小鼠胰腺可获得20 - 80个胰岛簇，适用于多种胰岛相关研究。

摘要

基于灌注的大型哺乳动物胰岛分离方案已较为成熟。由于大型哺乳动物胰管尺寸较大，易于注入胶原酶并实现后续组织灌注，因此这类方案可在许多实验室中顺利开展。相比之下，从小型胰腺（如新生小鼠的胰腺）中分离胰岛则具有挑战性，因为在小型胰腺中难以实现有效的灌注。本文介绍一种在视觉辅助下从新生小鼠中高效获取胰岛的简便详细操作流程。新鲜分离的完整胰腺组织被置于含0.5 mg/mL IV型胶原酶的Hanks平衡盐溶液（HBSS）中，在37 °C条件下于微量离心管内进行消化。期间定期轻弹管壁以促进组织分散。当大部分组织分散为约1 mm大小的细胞团块时，使用含10%胎牛血清（FBS）的培养基对裂解物进行3至4次洗涤。随后可在解剖显微镜下挑选出无明显腺泡组织的胰岛样细胞团。该方法可从每只新生小鼠胰腺中获得20至80个大小不等的胰岛。所获得的胰岛适用于几乎所有可能的下游检测，包括胰岛素分泌、基因表达分析和体外培养。文中提供了一个胰岛素分泌检测实例，以验证分离过程的有效性。遗传背景和消化程度是影响胰岛产量的最主要因素。建议使用新鲜配制且活性较高的胶原酶溶液，因其有助于内分泌与外分泌组织的有效分离。所有溶液中均需含有阳离子[钙离子（Ca²⁺）和镁离子（Mg²⁺）]，并在洗涤及挑选胰岛的培养基中添加胎牛血清，以确保获得数量充足且结构完整的胰岛。此外，具备良好对比度和放大倍数的解剖显微镜也将有助于操作。

引言

分离纯化的胰岛对于检测β细胞的葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）以及来自尸体供体的胰岛移植至关重要^1-3。此外，该过程也是建立胰岛细胞内分泌基因表达所必需的^{4, 5}。为此，已有详细的操作方案可用于从较大的胰腺中分离胰岛（⁶及其中引用的参考文献）。这些方法基于酶灌注以解离腺泡组织与胰岛组织，再结合梯度分离和手工挑选。因此，大多数实验室均可顺利开展从大胰腺中分离胰岛的操作。然而，目前尚无详细的分步操作方案可用于从小到无法进行灌注的胰腺中分离胰岛。

研究新生胰岛的基因表达与功能具有重要意义。新生胰岛在胰岛素分泌和增殖能力方面与成年胰岛具有不同的特性^{7, 8}。然而，由于新生动物（尤其是小鼠）胰腺体积较小，从其体内分离胰岛具有较大挑战性。胰腺体积过小导致无法采用常规的灌注方法，即无法通过胰管注射胶原酶进行消化。事实上，已有若干研究报道了采用酶法或非酶法辅助的胰岛分离流程^{7, 9, 10}。然而，目前尚缺乏对胰岛分离过程的详细描述及可视化指导^{7, 9}，这使得大多数研究人员难以开展类似研究。

我们探索了多种可从新生小鼠获得高质量胰岛的条件。本文介绍了一种有助于研究人员掌握胰岛分离过程中关键细节的实验方案。该方案适用于出生两周以内的小鼠胰腺；超过此年龄的小鼠可采用灌注法进行常规胰岛分离。所获得的胰岛可直接用于胰....

方案

动物使用遵循范德堡大学机构动物护理和使用委员会为Gu批准的协议M/11/181中规定的方法。CD1或CBA/Bl6小鼠购自商业供应商，并在范德堡大学动物设施中进行杂交以获得新生小鼠。

1. 小鼠、储备溶液和仪器设备的准备

1. 小鼠杂交实验：设置小鼠杂交并记录栓塞日期，以辅助实验规划。CD1小鼠通常在交配后约第19天分娩。使用CD1或CBA/Bl6杂交组合可分别获得CD1或CBA/Bl6新生小鼠。两种品系之间的杂交使用CD1雌鼠与CBA/Bl6雄鼠进行交配。
2. 胶原酶储备液配制：使用高精度天平称取200 mg IV型胶原酶，转移至50 mL离心管中，加入40 mL含Ca²⁺/Mg²⁺的HBSS（浓度分别为1.26 mM和0.5 mM），溶解后配制成5 mg/mL的储备液。
   1. 轻轻振荡约30分钟使胶原酶充分溶解，分装后于-20 °C保存作为储备液，活性可维持至少一年。
3. 将多对镊子、剪刀及P20吸头进行高压灭菌，用于解剖和胰岛挑选。
4. 1 M葡萄糖储备液配制：在50 mL离心管中称取9 g葡萄糖，加入50 mL RPMI 1640培养基溶解。4 °C保存备用，保存时间不超过6个月。

2. 工作溶液

结果

在最佳条件下，本方法可从每只小鼠的小胰腺中分离出 20 - 80 个胰岛。该数量取决于小鼠的遗传背景、年龄以及待回收胰岛的大小。在常用的品系中，CD1 远交系和 C57BL/6J 近交系小鼠所产生的胰岛数量较少且体积较小，低于 CD1 与 C57BL/6 杂交后代或商业化的 B6CBAF1/J 小鼠。直接手工挑选通常获得的胰岛数量较少，这可能是由于在与外分泌组织混合时，较小的胰岛难以识别而被排除（图 1A-C）。梯度离心法则可获得更多的胰岛，包括混合物中的较小胰岛（图 1D）。如预期一致，年老小鼠产生的胰岛数量更多且体积更大，这是由于出生后胰岛持续增殖所致。有趣的是，回收的胰岛数量与胰腺大小并无直接相关性：CD1 小鼠的胰腺通常比 CD1 与 C57BL/6J 小鼠杂交产生的 F1 代后代更大，但 CD1 小鼠通常产生的胰岛数量却少于 F1 代后代。

胶原酶消化不足或过度均会导致胰岛分.......

讨论

本文提供了一种针对体积过小而无法进行常规灌注的胰腺进行胰岛分离的分步实验方案。该方法可获得适用于各类胰岛相关研究的胰岛，包括β细胞纯化、基因表达分析、胰岛β细胞成熟与增殖、细胞应激反应、细胞存活、代谢以及功能性的葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）维持等研究。 等等据我们所知，这将是首个详细展示如何从小鼠新生鼠中分离胰岛的可视化实验方案，旨在指导新进研究人员开展相关操作。若缺乏此类可视化辅助，大多数研究人员在从小型胰腺中成功分离胰岛时，预计将经历大量反复尝试与错误。

胰岛分离成功最关键的因素除了遵循步骤 3.6 - 3.8 中所述，还在于胰腺消化程度的准确控制。通常情况下，消化不足或过度均会降低胰岛得率。过度消化还会破坏胰岛结构，使其不适合用于功能学检测。为获得最佳消化效果，必须持续监测反应过程，以直观观察组织解离情况。仅依靠消化时间来判断腺泡与胰岛的分离程度是最不可靠的方法，因为每批胶原酶的活性均不相同，且起始胰腺的年龄和大小对消化过程有显著影响。若出现消化不足，可将较大的内分泌-外分泌细胞团用 HBSS 洗涤后，再次加入胶原酶进行消化，并可在解剖显微镜下直接观察，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IV型胶原酶	Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	C5138
含钙的1×HBSS2+/毫克2+	Mediatech/Cellgro，美国弗吉尼亚州马纳萨斯	MT21020CV	若使用不含 Ca 的 HBSS2+/毫克2+ 获得，CaCl2 和 MgSO₄4 可分别加入至 1.26 和 0.5 mM。
RPMI 1640 无葡萄糖	赛默飞世尔科技/生命技术公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆	11879-020	需要将葡萄糖添加至特定水平，以避免干扰后续胰岛的使用。
葡萄糖	Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	G-7021
聚蔗糖和泛影酸钠溶液	Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	Histopaque-10771
体视显微镜	卡尔·蔡司，奥伯科亨，德国	Stemi2000
体视显微镜	Leica，德国韦茨拉尔	Leica M165
微型离心机	Eppendorf，美国纽约州霍普奇	Centrifuge 5417C
离心	Eppendorf，美国纽约州霍普奇	Centrifuge 5810R
15-mL 离心管	VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州	89039-666
50-mL 离心管	VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州	89039-658
精密天平	VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州	VWR-225AC
微量离心管	VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州	87003-294
Pipetman P1000	Fisher Scientific  马萨诸塞州沃尔瑟姆	F123602
Pipetman P20	Fisher Scientific  马萨诸塞州沃尔瑟姆	F123600
100 x 15 mm 培养皿	VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州	25384-088
60 x 15 mm 培养皿	VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州	25384-168
12孔板	VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州	665-180
剪刀	精细科学工具公司，福斯特城，加利福尼亚州	14080-11
镊子	Fine Scientific Tools，加利福尼亚州福斯特城	5708-5
CD1小鼠	查尔斯河实验室，马萨诸塞州威尔明顿	CD-1
C57BL/6J	杰克逊实验室，法明顿，康涅狄格州	C57BL/6J
B6CBAF1/J	杰克逊实验室，法明顿，康涅狄格州	B6CBAF1/J