本文介绍了一种从新生小鼠中分离完整胰岛的实验方案。胰腺经胶原酶部分消化后，进行洗涤和手工挑选。每只新生小鼠胰腺可获得20 - 80个胰岛簇，适用于多种胰岛相关研究。
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摘要
摘要
基于灌注的大型哺乳动物胰岛分离方案已较为成熟。由于大型哺乳动物胰管尺寸较大，易于注入胶原酶并实现后续组织灌注，因此这类方案可在许多实验室中顺利开展。相比之下，从小型胰腺（如新生小鼠的胰腺）中分离胰岛则具有挑战性，因为在小型胰腺中难以实现有效的灌注。本文介绍一种在视觉辅助下从新生小鼠中高效获取胰岛的简便详细操作流程。新鲜分离的完整胰腺组织被置于含0.5 mg/mL IV型胶原酶的Hanks平衡盐溶液（HBSS）中，在37 °C条件下于微量离心管内进行消化。期间定期轻弹管壁以促进组织分散。当大部分组织分散为约1 mm大小的细胞团块时，使用含10%胎牛血清（FBS）的培养基对裂解物进行3至4次洗涤。随后可在解剖显微镜下挑选出无明显腺泡组织的胰岛样细胞团。该方法可从每只新生小鼠胰腺中获得20至80个大小不等的胰岛。所获得的胰岛适用于几乎所有可能的下游检测，包括胰岛素分泌、基因表达分析和体外培养。文中提供了一个胰岛素分泌检测实例，以验证分离过程的有效性。遗传背景和消化程度是影响胰岛产量的最主要因素。建议使用新鲜配制且活性较高的胶原酶溶液，因其有助于内分泌与外分泌组织的有效分离。所有溶液中均需含有阳离子[钙离子（Ca2+）和镁离子（Mg2+）]，并在洗涤及挑选胰岛的培养基中添加胎牛血清，以确保获得数量充足且结构完整的胰岛。此外，具备良好对比度和放大倍数的解剖显微镜也将有助于操作。
引言
分离纯化的胰岛对于检测β细胞的葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）以及来自尸体供体的胰岛移植至关重要1-3。此外，该过程也是建立胰岛细胞内分泌基因表达所必需的4, 5。为此，已有详细的操作方案可用于从较大的胰腺中分离胰岛（6及其中引用的参考文献）。这些方法基于酶灌注以解离腺泡组织与胰岛组织，再结合梯度分离和手工挑选。因此，大多数实验室均可顺利开展从大胰腺中分离胰岛的操作。然而，目前尚无详细的分步操作方案可用于从小到无法进行灌注的胰腺中分离胰岛。
研究新生胰岛的基因表达与功能具有重要意义。新生胰岛在胰岛素分泌和增殖能力方面与成年胰岛具有不同的特性7, 8。然而，由于新生动物（尤其是小鼠）胰腺体积较小，从其体内分离胰岛具有较大挑战性。胰腺体积过小导致无法采用常规的灌注方法，即无法通过胰管注射胶原酶进行消化。事实上，已有若干研究报道了采用酶法或非酶法辅助的胰岛分离流程7, 9, 10。然而，目前尚缺乏对胰岛分离过程的详细描述及可视化指导7, 9，这使得大多数研究人员难以开展类似研究。
我们探索了多种可从新生小鼠获得高质量胰岛的条件。本文介绍了一种有助于研究人员掌握胰岛分离过程中关键细节的实验方案。该方案适用于出生两周以内的小鼠胰腺；超过此年龄的小鼠可采用灌注法进行常规胰岛分离。所获得的胰岛可直接用于胰岛素分泌和基因表达检测。
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方案
动物使用遵循范德堡大学机构动物护理和使用委员会为Gu批准的协议M/11/181中规定的方法。CD1或CBA/Bl6小鼠购自商业供应商，并在范德堡大学动物设施中进行杂交以获得新生小鼠。
1. 小鼠、储备溶液和仪器设备的准备
- 小鼠杂交实验：设置小鼠杂交并记录栓塞日期，以辅助实验规划。CD1小鼠通常在交配后约第19天分娩。使用CD1或CBA/Bl6杂交组合可分别获得CD1或CBA/Bl6新生小鼠。两种品系之间的杂交使用CD1雌鼠与CBA/Bl6雄鼠进行交配。
- 胶原酶储备液配制：使用高精度天平称取200 mg IV型胶原酶，转移至50 mL离心管中，加入40 mL含Ca2+/Mg2+的HBSS（浓度分别为1.26 mM和0.5 mM），溶解后配制成5 mg/mL的储备液。
- 轻轻振荡约30分钟使胶原酶充分溶解，分装后于-20 °C保存作为储备液，活性可维持至少一年。
- 将多对镊子、剪刀及P20吸头进行高压灭菌，用于解剖和胰岛挑选。
- 1 M葡萄糖储备液配制：在50 mL离心管中称取9 g葡萄糖，加入50 mL RPMI 1640培养基溶解。4 °C保存备用，保存时间不超过6个月。
2. 工作溶液
注意：在胰岛分离当天，准备以下试剂。
- 配制 IV 型胶原酶工作液：将胶原酶储备液在冰上解冻并稀释。将 0.15 mL 储备液分装至每支 1.7 mL 微量离心管中，加入 1.35 mL 含 Ca2+/Mg2+ 的 HBSS。轻轻颠倒混匀 5 次，置于冰上孵育 15 分钟。
- 在微量离心机中高速离心 3 分钟。将上清液转移至新管中，置于冰上备用。弃去含有不溶性残渣的离心管。
- 配制完全 RPMI 1640 培养基：向 500 mL RPMI 1640 培养基中加入 2.5 mL 1 M 葡萄糖、50 mL 热灭活的胎牛血清（FBS）以及 5 mL 100× 青霉素-链霉素储备液。配制完成后置于冰上备用。
3. 胰腺的分离与消化
- 根据批准的方案，使用异氟烷处死新生小鼠，随后进行断头。
- 将小鼠腹部朝上放置，用70%乙醇喷洒以消毒。
- 用镊子提起腹部皮肤，沿中线用剪刀纵向剪开皮肤和肌肉层，从生殖区域至肋骨区域，打开腹腔以暴露所有内脏器官。
- 用镊子将所有内脏器官转移至100 cm培养皿中。找到胰腺，胰腺为分散状器官，其背侧部分附着于胃和脾脏，腹侧部分附着于十二指肠11。
- 向培养皿中加入HBSS，使器官完全浸没。在溶液中，胰腺组织不再附着于十二指肠、胃或脾脏。在解剖显微镜下，因其典型的白色外观而易于识别。用镊子将胰腺组织从周围组织中剥离，并转移至含HBSS的新60 mm培养皿中。
- 用剪刀将每个胰腺切成任意方向小于5 mm的组织块。转移至1.5 mL微量离心管中。最多可将五个（P7以前）胰腺置于同一管中进行消化。对于P8-P16小鼠，每个胰腺使用单独的离心管。
- 向每管中加入0.5–1 mL胶原酶工作液（每个P1-P7胰腺加0.2 mL，每个P8-P16胰腺加0.5 mL）。将离心管置于37 °C培养箱中孵育最多15分钟，每分钟轻轻倒置两次。
- 约5分钟后，轻弹离心管以监测胰腺组织的消化程度。继续消化过程，直至大部分胰腺组织呈现为直径< 2 mm的细胞团碎片。裂解液将呈现浑浊状态，这是由于腺泡细胞正常的自溶所致。
4. 裂解液洗涤
- 将裂解液在微量离心机中以 500 × g 离心 10 秒。使用 P1,000 移液器移除上清液。上清液应呈浑浊状，但无细胞团块。请勿使用抽吸法，因为残留的黏性 DNA 可能导致底部的组织碎片被迅速吸走。
- 加入 1 mL RPMI 1640 完全培养基。轻轻敲击离心管以重悬破碎的裂解物。上下颠倒混匀 10 次。重复步骤 4.1。
- 再重复步骤 4.2 两次，或直至上清液变得澄清。将洗涤后的胰腺碎片重悬于 1 mL 完全 RPMI 1640 培养基中。
5. 胰岛分离
注意：对于少量胰腺，可采用以下直接手工挑选的方法（5.1）进行胰岛分离。对于大量胰腺（> 6个），建议采用5.2中所述方法。
- 直接手工挑选：
- 将步骤 4.3 中的裂解液转移至 60 mm 培养皿中，加入 5 mL 完全 RPMI 1640 培养基，置于解剖显微镜下观察。
- 设置显微镜的明场照明，调节光强至最大功率的约 50%。在此条件下，胰岛呈现为略带粉红色的团块，而腺泡细胞则为深色、形状不规则的团块（图 1A）。建议使用约 50 倍的放大倍数（物镜与目镜倍数之和），以便同时清晰观察胰岛和移液枪头开口，便于挑选操作。
- 使用 P20 移液枪头挑取胰岛，避免接触腺泡细胞团块。将富含胰岛的组分转移至另一含有完全 RPMI 培养基的 60 mm 培养皿中（图 1B）。
- 重复手工挑选过程两次。将纯化的胰岛留置于新的 60 mm 培养皿中，加入 4 mL 完全 RPMI 培养基（图 1C）。
- 密度梯度离心：
- 准备一支 15 mL 离心管，预先加入 2 mL 密度为 1.077 g/mL 的聚蔗糖与泛影酸钠溶液，将离心管置于冰上备用。
- 用巴氏德吸管将步骤 4.3 中的悬液缓慢加至聚蔗糖与泛影酸钠溶液的液面上方，避免扰动下层溶液。每支 15 mL 离心管最多可加载 10 只新生小鼠或 2 只 P17 阶段小鼠的胰腺组织。
- 在 4 °C 条件下，使用摆动转子以约 600 × g 离心 15 分钟，离心时关闭刹车。
- 离心后，将上清液及界面层液体（注意：在理想操作条件下，胰岛将位于聚蔗糖溶液与培养基之间的界面处）转移至新的 15 mL 离心管中，加入 10 mL 培养基，轻柔但充分混匀。
- 以 300 × g 离心 5 分钟，沉淀富含胰岛的组分，弃去洗涤液。再用完全 RPMI 培养基重复洗涤一次。将沉淀重悬于 4 mL 培养基中，此悬液主要含有胰岛和导管结构（图 1D）。
- 按照第 5.1 节所述方法进行手工挑选胰岛。
6. 分离胰岛中的葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）检测
- 将步骤 5.1.4 中的胰岛置于完全 RPMI 培养基中，在 37 °C 组织培养孵箱中孵育 2 h。
- 使用移液器在解剖显微镜下吸除RPMI。向培养板中加入3 mL含2.8 mM葡萄糖的KRB溶液。3轻轻混匀10次以洗涤胰岛。移除KRB溶液。
- 重复洗涤一次。将胰岛与3 mL KRB溶液在37 °C孵育箱中孵育1 h。
- 将1 mL KRB分装至12孔板的每孔中。将KRB储备液和12孔板置于37 °C培养箱中预热。
- 用预热的KRB缓冲液按照6.2步骤清洗胰岛两次。将10个胰岛转移至各预热好的培养板孔中。在37 °C培养箱中孵育。
- 孵育45分钟后，吸取50 µL上清液。此上清液含有在基础葡萄糖条件下分泌的胰岛素溶液。
- 加入32 µL 500 mM葡萄糖。轻轻旋转混匀平板20次。置于37 °C培养箱中孵育。每5分钟轻轻旋转混匀平板5次。
- 孵育45分钟后，吸取50 µL上清液。此为高葡萄糖条件下分泌的胰岛素。
- 将所有胰岛转移至1.5 mL离心管中。在-20 °C下冷冻30分钟。室温下解冻5分钟。重复冻融过程。
- 加入0.5 mL含20 mM HCl的70%乙醇，静置过夜。此为胰岛中残留的胰岛素。
- 采用常规ELISA法检测胰岛素水平，方法如前所述3.
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结果
在最佳条件下，本方法可从每只小鼠的小胰腺中分离出 20 - 80 个胰岛。该数量取决于小鼠的遗传背景、年龄以及待回收胰岛的大小。在常用的品系中，CD1 远交系和 C57BL/6J 近交系小鼠所产生的胰岛数量较少且体积较小，低于 CD1 与 C57BL/6 杂交后代或商业化的 B6CBAF1/J 小鼠。直接手工挑选通常获得的胰岛数量较少，这可能是由于在与外分泌组织混合时，较小的胰岛难以识别而被排除（图 1A-C）。梯度离心法则可获得更多的胰岛，包括混合物中的较小胰岛（图 1D）。如预期一致，年老小鼠产生的胰岛数量更多且体积更大，这是由于出生后胰岛持续增殖所致。有趣的是，回收的胰岛数量与胰腺大小并无直接相关性：CD1 小鼠的胰腺通常比 CD1 与 C57BL/6J 小鼠杂交产生的 F1 代后代更大，但 CD1 小鼠通常产生的胰岛数量却少于 F1 代后代。
胶原酶消化不足或过度均会导致胰岛分...
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讨论
本文提供了一种针对体积过小而无法进行常规灌注的胰腺进行胰岛分离的分步实验方案。该方法可获得适用于各类胰岛相关研究的胰岛，包括β细胞纯化、基因表达分析、胰岛β细胞成熟与增殖、细胞应激反应、细胞存活、代谢以及功能性的葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）维持等研究。 等等据我们所知，这将是首个详细展示如何从小鼠新生鼠中分离胰岛的可视化实验方案，旨在指导新进研究人员开展相关操作。若缺乏此类可视化辅助，大多数研究人员在从小型胰腺中成功分离胰岛时，预计将经历大量反复尝试与错误。
胰岛分离成功最关键的因素除了遵循步骤 3.6 - 3.8 中所述，还在于胰腺消化程度的准确控制。通常情况下，消化不足或过度均会降低胰岛得率。过度消化还会破坏胰岛结构，使其不适合用于功能学检测。为获得最佳消化效果，必须持续监测反应过程，以直观观察组织解离情况。仅依靠消化时间来判断腺泡与胰岛的分离程度是最不可靠的方法，因为每批胶原酶的活性均不相同，且起始胰腺的年龄和大小对消化过程有显著影响。若出现消化不足，可将较大的内分泌-外分泌细胞团用 HBSS 洗涤后，再次加入胶原酶进行消化，并可在解剖显微镜下直接观察，...
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披露
作者声明，本研究所述工作不存在任何竞争性财务利益。
致谢
本工作由美国国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIDDK）资助（GG 的项目编号为 DK065949）。我们感谢 Brenda M. Jarvis 博士和 Jeff Duryea Jr. 对稿件的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| IV型胶原酶 | Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | C5138 | |
| 含钙的1×HBSS2+/毫克2+ | Mediatech/Cellgro，美国弗吉尼亚州马纳萨斯 | MT21020CV | 若使用不含 Ca 的 HBSS2+/毫克2+ 获得，CaCl2 和 MgSO₄4 可分别加入至 1.26 和 0.5 mM。 |
| RPMI 1640 无葡萄糖 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 11879-020 | 需要将葡萄糖添加至特定水平，以避免干扰后续胰岛的使用。 |
| 葡萄糖 | Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | G-7021 | |
| 聚蔗糖和泛影酸钠溶液 | Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | Histopaque-10771 | |
| 体视显微镜 | 卡尔·蔡司，奥伯科亨，德国 | Stemi2000 | |
| 体视显微镜 | Leica，德国韦茨拉尔 | Leica M165 | |
| 微型离心机 | Eppendorf，美国纽约州霍普奇 | Centrifuge 5417C | |
| 离心 | Eppendorf，美国纽约州霍普奇 | Centrifuge 5810R | |
| 15-mL 离心管 | VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州 | 89039-666 | |
| 50-mL 离心管 | VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州 | 89039-658 | |
| 精密天平 | VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州 | VWR-225AC | |
| 微量离心管 | VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州 | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific 马萨诸塞州沃尔瑟姆 | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific 马萨诸塞州沃尔瑟姆 | F123600 | |
| 100 x 15 mm 培养皿 | VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州 | 25384-088 | |
| 60 x 15 mm 培养皿 | VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州 | 25384-168 | |
| 12孔板 | VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州 | 665-180 | |
| 剪刀 | 精细科学工具公司，福斯特城，加利福尼亚州 | 14080-11 | |
| 镊子 | Fine Scientific Tools，加利福尼亚州福斯特城 | 5708-5 | |
| CD1小鼠 | 查尔斯河实验室，马萨诸塞州威尔明顿 | CD-1 | |
| C57BL/6J | 杰克逊实验室，法明顿，康涅狄格州 | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | 杰克逊实验室，法明顿，康涅狄格州 | B6CBAF1/J |
参考文献
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