通过多重荧光检测染色体间稳定畸变 原位 辐射小鼠中的多重荧光原位杂交（mFISH）与光谱核型分析（SKY）

摘要

本实验方案描述了多重荧光技术的应用价值 原位 杂交（mFISH）和光谱核型分析（SKY）在识别小鼠全身照射后骨髓细胞中染色体间稳定畸变中的应用

摘要

电离辐射（IR）可诱导产生多种稳定和不稳定的染色体畸变。不稳定的畸变通常表现为染色体形态显著受损，可通过常规染色体染色技术轻松识别。然而，稳定畸变涉及遗传物质的交换或易位，染色体形态变化不大，因此需要依赖复杂的染色体涂染技术进行检测，该技术基于 原位 荧光标记DNA探针的杂交，一种被称为荧光原位杂交的染色体显带技术 原位 杂交（FISH）。FISH探针可针对整条染色体或染色体上的特定亚区域。该方法不仅能够可视化稳定的染色体畸变，还可用于检测参与特定畸变形成的染色体或特定DNA序列。细胞遗传学中存在多种染色体涂染技术；本文介绍两种高灵敏度的方法：多重荧光 原位 杂交（mFISH）和光谱核型分析（SKY）被用于鉴定小鼠全身照射后骨髓细胞中形成的染色体间稳定型畸变。尽管这两种技术均依赖于荧光标记的DNA探针，但其信号检测方法及荧光信号的图像采集过程有所不同。这两种技术已广泛应用于多个研究领域，如辐射生物学、肿瘤细胞遗传学、辐射生物剂量回顾性估算、临床细胞遗传学、进化细胞遗传学以及比较细胞遗传学。

引言

识别辐射诱导的染色体间稳定畸变最可靠的两种方法是多重荧光原位杂交 原位 杂交（mFISH），可同时标记两条或更多条染色体，以及光谱核型分析（SKY），后者为基因组中每一对同源染色体赋予独特的颜色。与不稳定畸变不同，稳定畸变具有持久性，可在受照群体中持续存在并传递至若干代¹，被视为辐射诱导的细胞遗传学损伤的关键分子“标志”²多项研究已表明，稳定的染色体畸变与包括癌症在内的多种疾病的发病机制及发展过程相关。³在染色体涂染（也称为分子细胞遗传学）时代之前，传统的G显带技术是检测稳定染色体畸变的唯一方法。然而，染色体显带对细胞遗传学家而言具有挑战性，因为其分辨率有限、重复性不确定、操作过程耗时耗力，且需要高度熟练和经验丰富的细胞遗传学家才能进行可靠的数据解读。⁴此外，经典的显带技术无法检测复杂的染色体重排，这类重排涉及两个或更多染色体上分布的三个或更多断裂点，是辐射损伤的常见结果。复杂的染色体畸变可在个体中持续多年，因此适用于辐射剂量的回顾性生物估算。⁵因此，需要采用一种替代方法来克服传统显带技术在检测稳定染色体畸变方面的局限性。

20世纪60年代末，Gall和Pardue（1969年）在利用放射性标记核酸探针进行分子杂交方面的开创性工作，开启了细胞遗传学领域的新纪元，使得染色体上特定DNA序列的检测成为可能⁶。然而，使用放射性探针进....

方案

所有动物实验均严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。动物实验方案已获阿肯色大学医学科学分校机构动物护理和使用委员会批准。所有动物均饲养于标准空调动物设施中，温度为 20 ± 2 °C，每小时换气 10 - 15 次，并可自由获取标准啮齿类动物饲料和饮水。动物到达后，小鼠需进行为期 1 周的隔离检疫，并提供经认证的啮齿类动物饲料。

1. 辐射暴露与 体内 中期细胞的阻滞

1. 将未麻醉的小鼠置于照射室中，接受2 Gy全身辐射。照射期间，将小鼠放入通风良好的固定装置中，确保其不能自由移动，以获得均匀的辐射剂量。
2. 使用连接1 mL一次性注射器的25 G针头，向小鼠腹腔注射100 µL 0.05%秋水仙素溶液（将秋水仙素粉末溶于无钙无镁的PBS中）。避免将溶液直接注入任何器官。
3. 注射后将动物在笼中静置2小时，再进行骨髓细胞采集。期间应观察动物是否有疼痛或不适的迹象。

2. 通过密度梯度离心法获取骨髓细胞并分离骨髓单个核细胞

1. 通过 CO₂ 窒息法处死小鼠。
2. 在小鼠背部和腹部喷洒 70% 乙醇。
3. 用锋利的剪刀在腹部皮肤上做一个 2 cm 的切口。用钝头镊子夹住切口两侧的皮肤，轻轻拉开腹肌。
4. 用剪刀剪下两只后肢，并....

结果

全身照射可诱导受照小鼠骨髓细胞产生大量染色体畸变。本方案已针对 体内 辐射暴露后骨髓细胞的有丝分裂阻滞，从受照小鼠后肢采集骨髓细胞，通过密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，制备中期细胞涂片，随后利用mFISH和SKY技术检测辐射诱导的稳定型染色体畸变。采用这些技术进行染色体显带可用于检测并评估多种病理生理状况的风险。

图1展示了具有代表性的小鼠第1、2和3号染色体正常与异常的中期细胞铺片。图2展示了正常与异常小鼠中期染色体的光谱核型分析。这些结果表明，电离辐射可在增殖的小鼠骨髓细胞中诱导染色体间的稳定型畸变，而骨髓细胞主要由负责自我更新并分化为多种细胞类型的干细胞和前体细胞组成。研究表明，干细胞和前体细胞中的细胞遗传学改变与多种临床疾病（包括癌症）相关，并被认为是疾病严重程度和总体生存率的最强预测指标。因此，可以合理推断，电离辐射诱导的染色体间稳定型畸变可能导致癌症发生.......

讨论

决定mFISH和SKY成功的关键步骤有多个。第一步也是最关键的一步是优化秋水仙素处理，以 体内 骨髓单个核细胞的有丝分裂阻滞。秋水仙素的浓度和处理时间各自或共同作用，决定了有丝分裂指数以及染色体的凝缩程度——这是实现有效染色体涂染的两个重要前提。过高的秋水仙素浓度或过长的处理时间会导致染色体高度凝缩，不利于后续的变性与杂交。此外，在染色体高度凝缩的中期细胞铺片中准确识别复杂的染色体重排并非易事。对体重在22至26 g的小鼠腹腔注射100 µL 0.05%秋水仙素，处理2 h，可获得数量充足且染色体凝缩程度适中的中期细胞铺片。第二个关键步骤是低渗处理。低渗溶液的体积、处理时间及温度均会影响染色体形态及其在载玻片上的铺展效果。若低渗处理时间过短或温度未达最佳条件，则可能导致染色体铺展不充分，形成染色体重叠的中期细胞铺片。染色体重叠会干扰后续分析 原位 杂交过程、荧光信号的特异性以及重排的正确识别。

第三，低渗后的固定是避免细胞结块形成的重要步骤。应沿离心管壁缓慢加入固定液，并持续轻轻振荡，以获得单细胞悬液。否则，中期细胞 spreads 会困在细胞团.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
甲酰胺	Sigma-Aldrich	221198-100ML
SSC缓冲液 20× 浓缩液	Sigma-Aldrich	S6639-1L
小鼠SKY实验试剂	Applied Spectral Imaging	FPRPR0030/M40
CAD—浓缩抗体检测试剂盒	Applied Spectral Imaging	FPRPR0033
定制单色探针—3种颜色；小鼠1号染色体：红色，小鼠2号染色体：绿色，小鼠3号染色体：青色	Applied Spectral Imaging	FPRPR0182/10
玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-545B
吐温20	Fisher Scientific	BP337-100
盐酸，37%，Acros Organics	Fisher Scientific	AC45055-0025
Fisherbrand带螺旋盖的玻璃染色缸	Fisher Scientific	08-816
KaryoMAX氯化钾溶液	Life Technologies	10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
秋水仙胺粉末	Fisher Scientific	50-464-757
Histopaque-1083	Sigma-Aldrich	10831
Shepherd Mark I，型号25137Cs 照射仪	J. L. Shepherd & Associates	Model 484B
1 mL注射器	BD Biosciences	647911
乙醇，200度	Fisher Scientific	MEX02761
PBS（1× PBS 液体），不含钙和镁	Fisher Scientific	ICN1860454
胎牛血清	Fisher Scientific	10-437-010
甲醇	Fisher Scientific	A454SK-4
冰醋酸	Fisher Scientific	AC295320010
蔡司显微镜	Zeiss	AXIO Imager.Z2