通过多色荧光跨染色体畸变稳定的检测原位杂交（渔业部）和光谱核型分析（SKY）的照射小鼠

Summary

本方案描述了多重荧光原位杂交 （mFISH） 和光谱核型 （SKY） 在识别小鼠全身照射后骨髓细胞染色体间稳定畸变的有用性。

Abstract

电离辐射 （IR） 会诱导许多稳定和不稳定的染色体畸变。染色体形态严重受损的不稳定畸变可以通过常规染色体染色技术轻松识别。然而，检测稳定的畸变，涉及遗传物质的交换或易位，而染色体形态没有显著的改变，需要复杂的染色体绘画技术，这些技术依赖于荧光标记的 DNA 探针的原位杂交，这种染色体绘画技术通常被称为原位荧光杂交 （FISH）。FISH 探针可以对整个染色体或染色体上的精确子区域具有特异性。该方法不仅可以可视化稳定的畸变，还可以检测与特定畸变形成有关的染色体或特定 DNA 序列。细胞遗传学中有多种染色体绘画技术;这里讨论了两种高灵敏度方法，多重荧光原位杂交 （mFISH） 和光谱核型 （SKY），以识别暴露于全身照射后小鼠骨髓细胞中形成的染色体间稳定畸变。尽管这两种技术都依赖于荧光标记的 DNA 探针，但检测方法和荧光信号的图像采集过程不同。这两种技术已用于各种研究领域，例如放射生物学、癌症细胞遗传学、回顾性放射生物剂量学、临床细胞遗传学、进化细胞遗传学和比较细胞遗传学。

Introduction

识别辐射诱导的染色体间稳定畸变的两种最可靠的方法是多重荧光原位杂交 （mFISH），它允许同时绘制两条或多条染色体，以及光谱核型 （SKY），它为基因组中的每个同源染色体对赋予不同的颜色。与不稳定的像差不同，稳定的像差本质上是持续的，可以在受照射的人群中传播几代¹，并被视为辐射诱导的细胞遗传学病变的关键分子"特征"²。各个团体的研究表明，稳定的畸变与包括癌症在内的许多疾病的发病机制和发展有关³。在染色体绘画（也称为分子细胞遗传学）时代之前，传统的 G 带技术是检测稳定染色体畸变的唯一方法。然而，染色体显带对细胞遗传学家来说是一个挑战，因为分辨率有限，可重复性不确定，这是一个劳动密集型过程，并且需要高技能和经验丰富的细胞遗传学家才能进行可靠的数据解释⁴。此外，经典的条带技术不允许检测复杂的染色体重排，这涉及分布在两个或多个染色体之间的三个或多个断裂的相互作用，这是辐射损伤的常见结果。复杂的畸变可能在辐射暴露后多年在个体中持续存在，这使得它们可用于回顾性生物剂量学⁵。因此，需要一种替代方法来克服传统条带技术的局限性来检测稳定的染色体重排。

在 1960 年代后期，Gall 和 Pardue （1969） 使用放射性物质标记的核酸探针进行分子杂交的开创性工作开启了细胞遗传学领域的新时代，允许检测⁶ 号染色体上的特异性 DNA 序列。然....

Protocol

所有的动物研究都严格按照该指南中的建议，美国国立卫生研究院的实验动物的护理和使用进行。动物方案经阿肯色大学医学科学机构的动物护理和使用委员会。新鲜空气和向标准啮齿动物食物和自由饮水15小时周期 - 所有动物在20±2℃，10在标准空调动物设施收纳。抵达后，小鼠隔离举行1周，并提供认证的啮齿动物食物。

1.Radiation曝光并在中期细胞的体内逮捕

1. 揭露联合国麻醉小鼠2戈瑞全身辐射照射室。在辐照过程中，在通风良好的固定室老鼠的地方，以确保他们不会自由移动，并获得一致的剂量。
2. 注入100微升0.05％秋水仙素溶液（c溶解的钙和镁的PBS olchicine粉末）腹膜内使用连接用1mL一次性注射器将25g针。避免直接注射到任何器官。
3. 留在笼子里动物的骨髓细胞收获前2小时。观察疼痛或痛苦的任何迹象的动物。

2.骨髓细胞采收和密度梯度离心骨髓单个核细胞的分离

1. 安乐死的CO ₂窒息鼠标。
2. 喷在背腹侧70％的乙醇。
3. 就用锋利的剪刀腹部皮肤2厘米的切口。抓住钝镊子切口两侧皮肤，轻轻拉开腹部肌肉。
4. 切下的后腿用剪刀，并立即将它们放置在预冷的PBS，4％FBS。
5. 仔细清理附着于后肢用锋利的剃刀刃和棉花纱布包扎的所有肌肉。 <....

Results

全身照射诱导照射小鼠的骨髓细胞大量染色体畸变。当前协议是用于治疗辐射暴露后在体内的骨髓细胞的有丝分裂停滞优化，从照射小鼠，骨髓单核细胞的分离的后腿骨髓细胞的收获通过密度梯度离心，制备中期细胞价差，以及随后的检测由渔业部和SKY技术辐射诱导稳定染色体畸变。染色体画使用这些技术可用于检测和评估各种病理生理条件的危险。

图1示出了代表中期细胞与正常和异常小鼠染色体对-1，-2和-3传播。 图2显示正常和异常小鼠中期染色体的光谱核型分析。这些结果表明，电离辐射的增殖鼠骨髓细胞，其主要是由该负责自我更新和分化成不同细胞类型的干细胞和祖细胞的诱导染色体间稳定像差。在干细胞和祖细胞的细胞遗传学改变已显示与各种临床疾病，包括癌症相关联，并且被认为是疾病的严重程度和总生存期的最强预测。因此，它是符合逻辑的推断电离辐射诱导的稳定间染色体畸变可能导致癌症的发展的风险增加。

Discussion

几个关键步骤，确定渔业部和天空的成功。第一个也是最关键的一步是优化体内骨髓单个核细胞有丝分裂逮捕秋水仙碱治疗。秋水仙素浓度和处理时间是单独或共同确定有效的染色体绘画有丝分裂指数以及染色体浓缩，两个重要的先决条件。高浓度的秋水仙素或更长的治疗时间导致高度浓缩的染色体，不兼容的适当变性和杂交。此外，与冷凝染色体流传中期细胞复合重排的准确识别并不是一件容易的任务来实现。在22和26 g的体重的小鼠100微升0.05％秋水仙碱2小时的腹膜内施用产生中期细胞的足够数量的具有适度冷凝染色体传播。第二个关键步骤是低渗处理。量，处理时间，和低渗溶液影响染色体形态的温度并到达载玻片染色体蔓延。对于更短的时间或在一个亚最佳温度低渗治疗可以防止相应的染色体扩展，导致与重叠染色体传播中期细胞。染色体重叠原位杂交过程中，荧光信号的特异性，和重排的正确标识下游干扰。

第三，后低渗固定是避免细胞团的形成的重要一步。固定剂应该缓慢加入向下以恒定轻轻摇动，以获得单细胞悬浮液的离心管的一侧。否则，中期细胞的利差将成为被困在团块和染色体蔓延将受到损害。然而，染色体也扩展依赖于细胞类型.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
甲酰胺	Sigma-Aldrich	221198-100ML
SSC 缓冲液 20 次;浓缩	物 Sigma-Aldrich	S6639-1L
SKY 小鼠实验室试剂	应用光谱成像	FPRPR0030/M40
CAD - 浓缩抗体检测试剂盒	应用光谱成像	FPRPR0033
单一涂料 定制 - 3 种颜色;小鼠 1 号染色体：红色，小鼠 2 号染色体：绿色，小鼠 3 号染色体：Aqua	应用光谱成像	FPRPR0182/10
玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-545B
吐温	20 Fisher Scientific	BP337-100
盐酸，37%，Acros Organics	Fisher Scientific	AC45055-0025
费舍尔品牌玻璃染色皿  带螺旋盖	费舍尔科学	08-816
KaryoMAX氯化钾溶液	Life Technologies	10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
Colcemid粉末	Fisher Scientific	50-464-757
组织型-1083	Sigma-Aldrich	10831
Shepherd Mark I，型号 25 137Cs 辐照器	JL Shepherd &Associates	484B
注射器 1 mL	BD Biosciences	647911
乙醇，200 证明	Fisher Scientific	MEX02761
PBS，（1x PBS 液），不含钙和镁	Fisher Scientific	ICN1860454
胎牛血清	Fisher Scientific	10-437-010
甲醇	Fisher Scientific	A454SK-4
冰醋酸	Fisher Scientific	AC295320010
蔡司显微镜	蔡司	AXIO Imager.Z2