通过多色荧光跨染色体畸变稳定的检测原位杂交（渔业部）和光谱核型分析（SKY）的照射小鼠

Summary

本方案描述了多重荧光原位杂交 （mFISH） 和光谱核型 （SKY） 在识别小鼠全身照射后骨髓细胞染色体间稳定畸变的有用性。

Abstract

电离辐射 （IR） 会诱导许多稳定和不稳定的染色体畸变。染色体形态严重受损的不稳定畸变可以通过常规染色体染色技术轻松识别。然而，检测稳定的畸变，涉及遗传物质的交换或易位，而染色体形态没有显著的改变，需要复杂的染色体绘画技术，这些技术依赖于荧光标记的 DNA 探针的原位杂交，这种染色体绘画技术通常被称为原位荧光杂交 （FISH）。FISH 探针可以对整个染色体或染色体上的精确子区域具有特异性。该方法不仅可以可视化稳定的畸变，还可以检测与特定畸变形成有关的染色体或特定 DNA 序列。细胞遗传学中有多种染色体绘画技术;这里讨论了两种高灵敏度方法，多重荧光原位杂交 （mFISH） 和光谱核型 （SKY），以识别暴露于全身照射后小鼠骨髓细胞中形成的染色体间稳定畸变。尽管这两种技术都依赖于荧光标记的 DNA 探针，但检测方法和荧光信号的图像采集过程不同。这两种技术已用于各种研究领域，例如放射生物学、癌症细胞遗传学、回顾性放射生物剂量学、临床细胞遗传学、进化细胞遗传学和比较细胞遗传学。

Introduction

识别辐射诱导的染色体间稳定畸变的两种最可靠的方法是多重荧光原位杂交 （mFISH），它允许同时绘制两条或多条染色体，以及光谱核型 （SKY），它为基因组中的每个同源染色体对赋予不同的颜色。与不稳定的像差不同，稳定的像差本质上是持续的，可以在受照射的人群中传播几代¹，并被视为辐射诱导的细胞遗传学病变的关键分子"特征"²。各个团体的研究表明，稳定的畸变与包括癌症在内的许多疾病的发病机制和发展有关³。在染色体绘画（也称为分子细胞遗传学）时代之前，传统的 G 带技术是检测稳定染色体畸变的唯一方法。然而，染色体显带对细胞遗传学家来说是一个挑战，因为分辨率有限，可重复性不确定，这是一个劳动密集型过程，并且需要高技能和经验丰富的细胞遗传学家才能进行可靠的数据解释⁴。此外，经典的条带技术不允许检测复杂的染色体重排，这涉及分布在两个或多个染色体之间的三个或多个断裂的相互作用，这是辐射损伤的常见结果。复杂的畸变可能在辐射暴露后多年在个体中持续存在，这使得它们可用于回顾性生物剂量学⁵。因此，需要一种替代方法来克服传统条带技术的局限性来检测稳定的染色体重排。

在 1960 年代后期，Gall 和 Pardue （1969） 使用放射性物质标记的核酸探针进行分子杂交的开创性工作开启了细胞遗传学领域的新时代，允许检测⁶ 号染色体上的特异性 DNA 序列。然而，使用放射性探针进行分子杂交有几个缺点：放射性探针相对不稳定，探针活性取决于所用同位素的放射性衰变，杂交需要更长的时间，分辨率有限，探针相对昂贵，并且放射性物质对健康有害。因此，有必要开发和设计非放射性探针。1980 年代和 1990 年代荧光标记核酸探针的引入克服了放射性探针的局限性，大大提高了杂交技术的安全性、灵敏度和特异性^7-10。在配备适当激发和发射滤光片的荧光显微镜下观察时，荧光探针会产生极亮的信号。使用这种 FISH 技术可以很容易地识别荧光标记的染色体或染色体的一部分的任何丢失、增加或重排。

多年来，通过 FISH 绘画对染色体畸变的分析导致了细胞遗传学研究的显着进展。为特定应用设计荧光标记探针，从基因座特异性探针到全染色体绘画探针，该领域取得了显著的进步;这也促进了亚微观（"隐蔽"）重排的检测，这是传统染色体带带无法实现的。mFISH 和 SKY 的染色体绘制已被证明是鉴定简单和复杂染色体间重排的宝贵工具。两种技术的基本原理相似，但原位杂交后荧光信号的检测和鉴别方法与图像采集过程不同。在 mFISH 中，通过使用窄带通显微镜滤光片捕获四种荧光染料中每一种的单独图像;然后使用专用软件组合图像。而在 SKY 中，图像采集基于落射荧光显微镜、电荷耦合器件成像和傅里叶光谱的组合，这允许在所有图像点通过单次曝光测量整个发射光谱。在 mFISH 和 SKY 中，单色图像都是独立捕获的，然后合并，最后，根据附着在每个荧光染料探针上的特定染料，在单色图像中为染色体分配独特的伪色。

mFISH 和 SKY 分析在放射生物学领域的贡献是显着的，特别是对于人体暴露于 IR（辐射生物剂量测定学）^11-14、辐射致癌风险评估¹⁵，以及放射治疗相关继发性癌症的检测和风险评估¹⁶.最近对小鼠的一项研究表明，基于 FISH 的染色体绘画技术也是评估辐射对策疗效的重要工具¹⁷。在本研究中，已使用 mFISH 和 SKY 技术证明了全身辐射暴露对小鼠骨髓细胞中稳定染色体畸变诱导的影响。

Protocol

所有的动物研究都严格按照该指南中的建议，美国国立卫生研究院的实验动物的护理和使用进行。动物方案经阿肯色大学医学科学机构的动物护理和使用委员会。新鲜空气和向标准啮齿动物食物和自由饮水15小时周期 - 所有动物在20±2℃，10在标准空调动物设施收纳。抵达后，小鼠隔离举行1周，并提供认证的啮齿动物食物。

1.Radiation曝光并在中期细胞的体内逮捕

1. 揭露联合国麻醉小鼠2戈瑞全身辐射照射室。在辐照过程中，在通风良好的固定室老鼠的地方，以确保他们不会自由移动，并获得一致的剂量。
2. 注入100微升0.05％秋水仙素溶液（c溶解的钙和镁的PBS olchicine粉末）腹膜内使用连接用1mL一次性注射器将25g针。避免直接注射到任何器官。
3. 留在笼子里动物的骨髓细胞收获前2小时。观察疼痛或痛苦的任何迹象的动物。

2.骨髓细胞采收和密度梯度离心骨髓单个核细胞的分离

1. 安乐死的CO ₂窒息鼠标。
2. 喷在背腹侧70％的乙醇。
3. 就用锋利的剪刀腹部皮肤2厘米的切口。抓住钝镊子切口两侧皮肤，轻轻拉开腹部肌肉。
4. 切下的后腿用剪刀，并立即将它们放置在预冷的PBS，4％FBS。
5. 仔细清理附着于后肢用锋利的剃刀刃和棉花纱布包扎的所有肌肉。
6. 分离从股骨胫骨。修剪用剃刀刃每个骨骼的两个技巧。
7. 冲洗骨髓用3mL的PBS（含4％的FBS）的使用连接到一个3毫升注射器23政针的内容，并收集在15毫升离心管中的内容。通过细胞悬浮液的至少10倍通过针，使单细胞悬浮液。
8. 小心覆盖等体积的淋巴细胞分离介质（3mL）中对细胞悬浮液，而不会干扰细胞悬浮液和淋巴细胞分离介质之间的接口。离心在400 xg离心在室温下30分钟。
9. 小心收集血沉棕黄层，而不会干扰其它层和传输在新的15毫升离心管中。

3.中期细胞价差的制备

1. 加入10 mL的PBS含有血沉棕黄层的管。
2. 离心在400 xg离心在室温下5分钟。
3. 小心取出上清液。然后分手Ť他细胞沉淀，轻轻敲击，并添加10毫升的PBS。
4. 离心在400 xg离心在室温下5分钟。
5. 而不干扰细胞团块除去上清，打散沉淀，并添加4mL的预热低渗0.075 1M氢氯化物溶液。通过添加温和持续振荡下跌低渗溶液滴。
6. 孵育细胞20分钟，在37℃的水浴中。
7. 低渗处理后，添加固定剂的等体积（4mL）中（甲醇:冰醋酸，3:1体积/体积）中的15毫升管中并通过反相管轻轻混匀。
8. 离心在400 xg离心在室温下5分钟并弃上清。
9. 分手的细胞沉淀用攻丝接着温和涡流几秒钟，并通过与恒定振荡滴加入3毫升固定剂溶液滴。
10. 孵育在室温下30分钟，然后在400 xg离心离心5分钟。
11. 除去上清液，分手绅士细胞沉淀乐攻，加3毫升新鲜固定液。
12. 离心在400 xg离心在室温下5分钟，并除去上清液。分手轻轻敲击细胞沉淀，并加入新鲜的3毫升固定液。
13. 重复步骤3.12两倍多。
14. 离心在400 xg离心在室温下5分钟，并除去上清液而不扰乱细胞沉淀。然后加入400〜600μL固定液和吹打调匀。
15. 滴30微升固定的细胞上以45°角倾斜的预清洗和湿载玻片并允许滑动到空气完全干燥过夜。

通过渔业部4小鼠染色体绘画

1. 染色体变性
   1. 将包含中期细胞利差2X SSC在室温下2分钟的幻灯片。
   2. 脱水串行乙醇洗涤滑板为70％每2分钟，80％，和100％。在65℃下孵育60分钟。
   3. 预热40毫升变性溶液（70％甲酰胺/ 2×SSC; pH值7.0）至70℃（±2℃）下在玻璃科普林缸30分钟。 1.5分钟 - 通过温育在预热的变性溶液滑动1变性染色体。
   4. 骤立即滑到在冰冷的70％乙醇2分钟，停止变性过程以及防止变性染色体从重新退火。然后，通过用80％乙醇洗涤2分钟脱水。重复用100％乙醇的乙醇洗涤2分钟。完全干燥后在室温下的幻灯片。
2. 变性和探针混合物杂交
   1. 短暂离心由制造商提供的探针混合物，在80℃（±2℃）的水浴中传送探测混合液10μL到500μL的卡扣帽离心管中，和变性温育7分钟。
   2. 将带有探针混合物的离心管在水浴中于37℃10分钟。
   3. 变性探针混合物应用到与变性chromoso幻灯片MES。
   4. 仔细覆盖18毫米×18毫米的玻璃盖玻片的区域以及非常轻轻按压盖玻片滑动消除任何可见的气泡。密封用橡胶水泥盖玻片的所有四个侧面和在用于杂交的潮湿室中在37℃孵育12小时，在黑暗中16小时。
3. 杂交后清洗和检测
   1. 小心取出橡胶水泥和盖玻片。
   2. 在74℃（±2℃）下5分钟在预温0.4X SSC地方滑动。
   3. 在2分钟的洗涤溶液II（4×SSC / 0.1％吐温-20）洗涤滑动。
   4. 放置用DAPI复染（1.5微克/毫升）的抗褪色封固剂的20微升，用玻璃盖玻片覆盖。轻轻按下与实验室组织盖玻片，以去除气泡和多余的安装解决方案。用指甲油密封盖玻片的边缘。
   5. 使用配备有适当的过滤器的荧光显微镜视图幻灯片。

5.光谱核型分析小鼠染色体的（SKY）

1. 染色体和探针变性
   1. 平衡滑动在2×SSC在室温下进行2分钟，不摇动。
   2. 脱水在乙醇系列（100％乙醇70％，80％，和），在室温下每2分钟幻灯片。空气干燥幻灯片完全去除乙醇。
   3. 在玻璃科普林缸30分钟暖40毫升变性溶液（pH 7.0 70％甲酰胺/ 2×SSC）。
   4. 孵育在1至1.5分钟预热的变性溶液滑动。
   5. 立即浸入滑动入冰冷的70％乙醇2分钟，停止变性过程以及防止变性染色体从重新退火。
   6. 通过在室温下将其放入80％乙醇中2分钟，然后为100％乙醇2分钟，脱水的幻灯片。
   7. 在设定为80℃（±2℃）水浴变性SKY探头（瓶＃1由制造商提供）7分钟，然后立即放入设定为37℃，10分钟的不同水浴中。
2. 探针杂交
   1. 添加变性SKY探针的10微升到变性染色体。
   2. 小心地将18毫米×18毫米的玻璃盖玻片冲上天空探头，以便没有气泡盖玻片被困。
   3. 密封用橡胶水泥盖玻片的边缘。
   4. 放置幻灯片在加湿遮光室并在37℃下在黑暗中孵育24小时至36小时。
3. 杂交后的洗涤和荧光检测
   1. 不干扰盖玻片非常小心取出橡皮泥。
   2. 放置滑入预热快速洗涤液（0.4倍SSC）在72℃（±2℃）下5分钟，以恒定振荡。沉浸滑入洗涤溶液III（4×SSC / 0.1％吐温20）和孵育1分钟，同时振摇。
   3. 可选:加入80微升阻断剂的（小瓶＃2由制造商提供的）上的杂交的区域中，放置一个24毫米×60毫米的塑料盖玻片，并在37℃下在黑暗中温育30分钟，在湿润的腔室中。
   4. 轻轻取出塑料盖玻片和洗涤用预热（45℃）洗涤溶液III滑动5分钟。
   5. 应用80 Cy5信号μL染色试剂（瓶＃3制造商提供），放置24毫米×60毫米的塑料盖玻片，在黑暗中，在加湿室内37℃下孵育40分钟。
   6. 浸滑入含有玻璃科普林缸预热（45℃）洗涤溶液III（4×SSC / 0.1％吐温20），并在水浴中于45℃孵育2分钟，振摇。重复此洗涤步骤3次。
   7. 应用80经Cy5.5的μL染色试剂（瓶＃4由制造商提供），放置24毫米×60毫米的塑料盖玻片，在黑暗中，在加湿室内37℃下孵育40分钟。
   8. 与预热洗幻灯片3次（45℃）洗涤液III。
   9. 持反对纸巾倾斜位置排出多余液体的幻灯片。添加20μL的抗褪色DAPI试剂（小瓶＃5由制造商提供），并小心地将24毫米×60毫米的玻璃盖玻片而不引入任何气泡。密封盖玻片的边缘与指甲油和与配备用于捕获SKY图像的落射荧光显微镜观察。

Results

全身照射诱导照射小鼠的骨髓细胞大量染色体畸变。当前协议是用于治疗辐射暴露后在体内的骨髓细胞的有丝分裂停滞优化，从照射小鼠，骨髓单核细胞的分离的后腿骨髓细胞的收获通过密度梯度离心，制备中期细胞价差，以及随后的检测由渔业部和SKY技术辐射诱导稳定染色体畸变。染色体画使用这些技术可用于检测和评估各种病理生理条件的危险。

图1示出了代表中期细胞与正常和异常小鼠染色体对-1，-2和-3传播。 图2显示正常和异常小鼠中期染色体的光谱核型分析。这些结果表明，电离辐射的增殖鼠骨髓细胞，其主要是由该负责自我更新和分化成不同细胞类型的干细胞和祖细胞的诱导染色体间稳定像差。在干细胞和祖细胞的细胞遗传学改变已显示与各种临床疾病，包括癌症相关联，并且被认为是疾病的严重程度和总生存期的最强预测。因此，它是符合逻辑的推断电离辐射诱导的稳定间染色体畸变可能导致癌症的发展的风险增加。

Discussion

几个关键步骤，确定渔业部和天空的成功。第一个也是最关键的一步是优化体内骨髓单个核细胞有丝分裂逮捕秋水仙碱治疗。秋水仙素浓度和处理时间是单独或共同确定有效的染色体绘画有丝分裂指数以及染色体浓缩，两个重要的先决条件。高浓度的秋水仙素或更长的治疗时间导致高度浓缩的染色体，不兼容的适当变性和杂交。此外，与冷凝染色体流传中期细胞复合重排的准确识别并不是一件容易的任务来实现。在22和26 g的体重的小鼠100微升0.05％秋水仙碱2小时的腹膜内施用产生中期细胞的足够数量的具有适度冷凝染色体传播。第二个关键步骤是低渗处理。量，处理时间，和低渗溶液影响染色体形态的温度并到达载玻片染色体蔓延。对于更短的时间或在一个亚最佳温度低渗治疗可以防止相应的染色体扩展，导致与重叠染色体传播中期细胞。染色体重叠原位杂交过程中，荧光信号的特异性，和重排的正确标识下游干扰。

第三，后低渗固定是避免细胞团的形成的重要一步。固定剂应该缓慢加入向下以恒定轻轻摇动，以获得单细胞悬浮液的离心管的一侧。否则，中期细胞的利差将成为被困在团块和染色体蔓延将受到损害。然而，染色体也扩展依赖于细胞类型...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
甲酰胺	Sigma-Aldrich	221198-100ML
SSC 缓冲液 20 次;浓缩	物 Sigma-Aldrich	S6639-1L
SKY 小鼠实验室试剂	应用光谱成像	FPRPR0030/M40
CAD - 浓缩抗体检测试剂盒	应用光谱成像	FPRPR0033
单一涂料 定制 - 3 种颜色;小鼠 1 号染色体：红色，小鼠 2 号染色体：绿色，小鼠 3 号染色体：Aqua	应用光谱成像	FPRPR0182/10
玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-545B
吐温	20 Fisher Scientific	BP337-100
盐酸，37%，Acros Organics	Fisher Scientific	AC45055-0025
费舍尔品牌玻璃染色皿  带螺旋盖	费舍尔科学	08-816
KaryoMAX氯化钾溶液	Life Technologies	10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
Colcemid粉末	Fisher Scientific	50-464-757
组织型-1083	Sigma-Aldrich	10831
Shepherd Mark I，型号 25 137Cs 辐照器	JL Shepherd &Associates	484B
注射器 1 mL	BD Biosciences	647911
乙醇，200 证明	Fisher Scientific	MEX02761
PBS，（1x PBS 液），不含钙和镁	Fisher Scientific	ICN1860454
胎牛血清	Fisher Scientific	10-437-010
甲醇	Fisher Scientific	A454SK-4
冰醋酸	Fisher Scientific	AC295320010
蔡司显微镜	蔡司	AXIO Imager.Z2