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活体显微成像及无毛小鼠耳lobe血栓诱导 活体显微成像，血栓形成，无毛小鼠，耳lobe，血管生物学，血小板聚集，微循环

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DOI：

10.3791/55174

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2017年4月2日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery "Otto Koerner", Rostock University Medical Center, 2Department of General, Thoracic, Vascular and Transplantation Surgery, Rostock University Medical Center, 3Institute for Experimental Surgery, Rostock University Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

无毛SKH1-Hrhr小鼠的耳部模型可在无需预先手术准备受检微血管床的情况下，实现微循环的活体荧光显微观察以及光毒性血栓的诱导。因此，无毛小鼠耳部是研究微血管血栓形成过程中复杂相互作用、血栓演变及溶栓过程的理想体内模型。

摘要

血管疾病导致的血栓并发症是工业国家中发病率和死亡率的主要原因之一。由于血栓形成过程中血细胞与非细胞血液成分之间存在复杂的相互作用，对血栓生理学与病理生理学的可靠研究仅能通过体内实验进行。 体内因此，本文介绍了一种在无毛小鼠中的耳部模型，并重点研究了 体内 微循环、血栓形成及血栓演变的分析。通过使用活体荧光显微技术以及静脉注射（iv）相应的荧光染料，可对耳廓微循环进行重复性分析，且无需手术准备。此外，该模型还可用于 体内 研究不同问题，包括伤口愈合、再灌注损伤或血管生成。总之，无毛小鼠的耳朵是理想的模型 体内 在生理或病理生理条件下对皮肤微循环的研究，以及对其对不同全身性或局部治疗反应的评估。

引言

本文旨在介绍将活体显微技术应用于无毛小鼠耳廓，以直接观察和分析微循环、血栓形成及血栓演变的方法。静脉血栓的发生率为每1,000人中1例，仍是导致发病的重要原因。尽管近年来在诊断、预防策略和治疗方面已取得进展，但约三分之一的静脉血栓以肺栓塞的形式表现1。动脉血栓在心血管疾病中起着关键作用，而心血管疾病是工业国家最常见的死亡原因。由动脉粥样硬化斑块破裂引发的动脉血栓参与了心肌梗死、肠系膜梗死和脑卒中的发生。任何外科手术都会使内皮下结构暴露于血液成分，改变血流动力学，并导致患者活动受限。在下肢关节置换术、器官移植和皮瓣手术中，血栓形成是导致并发症的常见原因。尤其是微血管血栓，由于缺乏临床症状，常导致不可逆的组织损伤。同样，微血管血栓在多种疾病中发挥着关键作用，包括血栓性血小板减少性紫癜、脓毒症、弥散性血管内凝血、抗磷脂抗体综合征和慢性静脉功能不全等。

近年来开发了多种用于血栓形成治疗和预防的新药，但抗血小板药物和抗凝剂仍存在副作用、缺乏特异性拮抗剂以及作用持续时间较长等问题。这些缺陷给急诊医疗带来了困难。因此，需要进一步研究以揭示血栓形成过程中复杂的生物学机制，而这些过程极难被模拟 体外.

无毛SKH1-Hrhr小鼠于1926年在伦敦的一家动物园中被发现。由于14号染色体上的基因缺陷，该动物在出生后第10天开始脱毛。这使得血供丰富的耳廓便于进行血管的活体显微观察。耳朵的平均厚度为300 µm，由两层真皮构成，中间由软骨分隔。在软骨凸起的背侧，有3个血管束进入耳垂。顶端的血管弓和基底部的分流管将这三个血管束连接起来。小静脉的直径介于200 µm（基底部）和10 µm（顶端）之间。致密的毛细血管网环绕着空的毛囊2。无毛SKH1-Hrhr小鼠的解剖结构使耳廓成为血栓研究中一种高效且经济的模型。

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方案

所有 in vivo 实验（7221.3-1-006/15）均依照德国动物保护法规以及《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》（国家研究委员会实验动物资源研究所）进行。

1. 动物的一般饲养

  1. 使用4至6周龄的雄性SKH1-Hrhr小鼠进行实验，选择体重在20至25 g之间的动物。
  2. 将动物饲养于无病原体的设施中，在24至26 °C、相对湿度约60%的标准条件下饲养，并可自由持续获取水和食物（ad libitum）。
  3. 每笼最多饲养五只雄性动物。在饲养期间提供垫料和环境丰富化材料，以保障动物福利。

2. 动物的预先准备

  1. 称重小鼠并给予相应药物（例如， 将大麻素（5 mg/kg 体重（bw））注入胰岛素注射器中。在血栓诱导前 30 分钟给予药物。
  2. 用拇指和食指夹住小鼠颈部，小指捏住小鼠尾巴，将小鼠拉直，将药物注射至腹部左下象限的腹腔内（ip）。将小鼠放回笼中静置15分钟。
  3. 使用氯胺酮（90 mg/kg 体重）和赛拉嗪（25 mg/kg 体重）配制麻醉剂。在诱导血栓形成前 15 分钟对小鼠进行麻醉。将小鼠放入笼中，轻轻拉出尾巴，用胰岛素注射器经腹腔注射麻醉剂。
  4. 将小鼠放回笼中，直至麻醉开始。为确认麻醉充分，用镊子夹住小鼠尾巴进行检验。
  5. 将0.05 mL解冻的异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（FITC-dextran；5%，150 kDa）吸入胰岛素注射器中。填充注射器时，确保无气泡残留，因为即使少量经静脉（iv）注入的气泡也可能对动物造成致命影响。
  6. 将麻醉后的小鼠俯卧位放置于加热板上，调节加热板温度至37 °C。
  7. 将眼膏涂抹于小鼠角膜上。对皮肤进行消毒，并使用无菌器械。
  8. 在右耳的头侧和尾侧边缘各缝合一针7/0聚丙烯缝线。缝合位置应尽可能靠近边缘，并尽量靠近耳基部。图1B).
  9. 将小鼠移至背侧位。使用粘性胶带将四肢固定在丙烯酸玻璃平台上。将缝合线钩住门齿，并通过将缝合线用粘性胶带固定在丙烯酸玻璃上，使头部处于背伸位。
  10. 将动物转移至手术体视显微镜下的平台上，使用16倍放大倍率。

3. 左颈静脉的准备及FITC-葡聚糖注射

注意：若对右耳进行显微成像，需准备左侧颈静脉。

  1. 使用手术刀在颈部左侧皮肤上沿头尾方向做一个5 mm的切口。用显微镊子和显微剪刀分离皮下组织。对横跨的血管可采用聚酯8/0缝线结扎或电凝止血。
  2. 使用显微镊子和显微剪刀剥离静脉周围的外膜组织，注意不要触碰血管本身。
  3. 使用已准备好的胰岛素注射器注入荧光染料。用显微镊子小心夹住血管壁，避免刺穿静脉。将注射器刺入扩张的血管壁内，静脉注射FITC-葡聚糖（FITC-dextran iv）。
  4. 拔出注射器后，用棉签止血。避免血液和染料污染耳部。

4. 右耳活体荧光显微成像的定位

  1. 将动物转移至加热板上，并置于一个带有加热板插槽和一个高0.5 cm用于固定耳朵的平面的丙烯酸玻璃装置中。
  2. 使用粘性胶带将动物腹侧朝下固定在加热板上。将耳根部较坚硬且凸起的软骨置于耳朵固定平面（高0.5 cm）旁（图1B），使耳尖部分能够平整地放置在平面上。
  3. 在丙烯酸玻璃平面上滴加一滴室温的0.9% NaCl溶液，用于固定耳朵位置。将右耳置于NaCl液滴上，确保其预先缝合的凹面（腹侧）朝下。使用棉签吸去多余的NaCl溶液，利用毛细作用力使耳片紧贴丙烯酸玻璃平面。
  4. 用胶带将缝线固定在丙烯酸玻璃上，以稳定耳朵的位置。
  5. 在耳朵凸起的背侧滴加一滴室温0.9% NaCl溶液。小心地将一片盖玻片（直径0.5 cm）放置在耳朵上，避免压迫进入耳朵的基部血管。使用棉签尽可能吸除盖玻片下方的NaCl溶液，以最大限度减少盖玻片与目标血管之间的距离。

5. 右耳活体荧光显微镜观察与血栓诱导

  1. 调节活体荧光显微镜以观察FITC-葡聚糖（450 - 490 nm；FT: 510；LP: 520），使用可变功率的100 W汞灯作为光源。将高分辨率黑白CCD相机连接至DVD录像机。
  2. 将动物连同固定其外展耳的丙烯酸玻璃板及加热板一起转移至活体荧光显微镜的载物台上。
  3. 使用20倍放大倍数（20X/0.95数值孔径）和20%光照强度，寻找直径为50 - 60 µm、前向血流速度为400 - 600 µm/s的静脉血管。
  4. 在盖玻片上滴加一滴室温水，用于63倍放大物镜（63X/0.95数值孔径）的水浸。使用带有直径1 mm套管的注射器，将水滴置于显微镜物镜上，水量应恰好使水滴同时接触盖玻片与物镜。
  5. 滴加水滴后立即以20%光照强度开始记录血管影像20秒，用于后续离线测量血管直径和血流速度。
  6. 在注射FITC-葡聚糖后5分钟开始血栓诱导。为此，将光照强度调至100%。
  7. 在血栓诱导过程中，每30秒内关闭显微镜光圈2秒以检查血流情况。若血流持续存在，则重新打开光圈；若血流停止，则继续观察血管30秒。
    注意：若血流静止达30秒或更长时间，或出现逆向血流，则判定该血管已闭塞。若前向血流恢复，则完全打开光圈并继续进行血栓诱导，直至血管如上所述发生闭塞。在早期血栓诱导阶段，应尽可能缩短为检查血流而关闭光圈的时间，以维持几乎连续的落射照明。后期随着血栓生长，血管内灌注的荧光染料减少，可进行连续观察。
  8. 每只耳朵选择并使其5条血管发生闭塞。血栓诱导在显微镜下的总时间应限制在注射FITC-葡聚糖后约1小时内完成。

6. 后续活动

  1. 使用经皮聚丙烯6/0缝线进行颈部伤口闭合。
  2. 麻醉恢复期间，将小鼠放回笼中，并使用红外灯为动物保温。
  3. 将DVD录像机中记录的数据转移至可测量血管直径和血流速度的软件中。

7. 左耳检查

  1. 让动物恢复并完全清除所注射的FITC-葡聚糖，耗时48小时。
  2. 重复上述步骤，此次准备右侧颈静脉和左耳。

8. 组织保存

  1. 对左耳进行活体荧光显微镜观察后，使用玻璃毛细管从眼球的眶后静脉丛采集 0.5 mL 血液。以旋转方式小心穿刺内眼角，直至静脉血流入毛细管。将采集的样本收集至含乙二胺四乙酸（EDTA）的采血管中。
  2. 采血后，经尾静脉注射 500 mg/kg 体重的氯胺酮，处死动物。
  3. 使用血液学分析仪计数血细胞，以定量评估白细胞、红细胞、血小板、血红蛋白和红细胞压积。
  4. 将剩余的 EDTA 抗凝血在室温下以 2,500 × g 离心 10 分钟。用移液器吸取血浆并冷冻保存，用于后续检测。
  5. 使用剪刀剪下耳廓，并将其置于 4% 甲醛中固定，用于组织学检查。

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结果

大麻素治疗对血栓形成的影响

注射0.05 mL FITC-葡聚糖后，光毒性血栓诱导导致内皮损伤及壁侧血小板栓塞的形成（图2 和 3）。在本研究中，腹腔注射大麻素（5 mg/kg 体重）或溶剂后诱导血栓形成，导致所有小静脉均出现血栓性血管闭塞图4）。在溶剂处理的动物中，血栓形成时间为430秒（25th 百分位数：330 秒；75th 百分位数：637 秒）。给予大麻二酚（CBD）或 WIN55,212-2（WIN）对血管闭塞时间均未显示出显著影响。然而，内源性大麻素类花生四烯酸乙醇胺（anandamide）显著缩短了血栓形成及血栓性血管闭塞所需时间，降至 270 秒（25th 百分位数：240 秒；75th 百分位数：360 秒，P < 0.05 对照组）。

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讨论

在SKH1-Hrhr小鼠耳lobule中成功诱导血栓形成有几个关键步骤。如需故障排查，相关步骤已在括号中注明。

在4至6周龄且表皮角化程度较低的幼龄动物中，检查条件最为理想。在较年长的动物中，由于皮肤表面与目标血管之间的距离较大，血管的可视化质量较差且可比性较低（步骤1.1）。

为防止FITC-葡聚糖在观察区域发生外渗，固定缝线应尽可能靠近边缘放置。在缝线附近，荧光染料可能发生外渗，从而降低血管外空间与血管之间的对比度。这种染料的外渗过程较为缓慢。若按照上述方法在注射FITC-葡聚糖前15分钟完成缝合，则可确保活体显微观察的良好条件（步骤2.8）。

异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖通过肾脏缓慢清除。将荧光染料与高分子量葡聚糖（150 kDa）结合可延缓其血管外渗出和排泄。在本研究中，显微观察和血栓诱导的时间被限制在1小时内，以避免排泄过程及血浆中荧光染料浓度降低对血栓形成时间的影响。

在填充注射器时，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SKH-1/hr 小鼠Charles River477可从其他供应商处购买 
标准实验室饲料ssniff SpezialdiaetenV1594-0 可从其他供应商处购买 
手术体视显微镜Leica M651/M655 可从其他供应商处购买 
活体显微镜ZeissAxiotech Vario 100 可从其他供应商处购买 
物镜（20X/0.95） Zeiss20x/0,50 W；Plan-NEOFLUAR 可从其他供应商处购买 
物镜（63X/0.95）Zeiss63x/0,95 W；ACHROPLAN 可从其他供应商处购买 
黑白CCD相机 Pieper FK 6990 IQ-S 可从其他供应商处购买 
DVD录像机PanasonicDMR-EX99V 可从其他供应商处购买 
氯化钠Braun5/12612055/1011可从其他供应商处购买 
10% 氯胺酮Bela pharmF3901-6可从其他供应商处购买 
2% 赛拉嗪Bayer6293841.00.00可从其他供应商处购买 
5% FITC-葡聚糖Sigma 46945-100MG-F可从其他供应商处购买 
5% 泛醇眼膏Bayer6029009.00.00可从其他供应商处购买 
4% 甲醛SigmaHT501128-4L可从其他供应商处购买 
DMSOSigma472301可从其他供应商处购买 
盖玻片 5 × 5 × 1 mmMenzelL4339可从其他供应商处购买 
粘性胶带Leukosilk4683400可从其他供应商处购买 
离心机Beckman CoulterCLGS 15可从其他供应商处购买 
血液学分析仪SysmexKX-21 A6980可从其他供应商处购买 
EDTA采血管Sarstedt201,341可从其他供应商处购买 
棉签Sanyo604-A-1可从其他供应商处购买 
红外灯Beurer5/13855可从其他供应商处购买 
一次性注射器Braun 2020-08可从其他供应商处购买 
胰岛素注射器Braun9161502可从其他供应商处购买 
一次性皮下注射针头Braun465 7640可从其他供应商处购买 
端对端毛细管Sarstedt19,447可从其他供应商处购买 
加热板Klaus EffenbergOP-T 185/03可从其他供应商处购买 
14.5 cm 手术剪AesculapBC259R可从其他供应商处购买 
持针器AesculapBM081R可从其他供应商处购买 
显微镊AesculapBD331R可从其他供应商处购买 
显微剪AesculapOC496R可从其他供应商处购买 
21号手术刀Dahlhausen11.000.00.511可从其他供应商处购买 
Prolene 7-0EthiconXNEH7470可从其他供应商处购买 
Prolene 6-0EthiconXN8706.P33可从其他供应商处购买 
电凝器ServopraxH40140可从其他供应商处购买 
丙烯酸玻璃垫板集成加热功能，0.5 cm 高的平面

参考文献

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