无毛SKH1-Hrhr小鼠的耳部模型可在无需预先手术准备受检微血管床的情况下，实现微循环的活体荧光显微观察以及光毒性血栓的诱导。因此，无毛小鼠耳部是研究微血管血栓形成过程中复杂相互作用、血栓演变及溶栓过程的理想体内模型。
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方法文章
活体显微成像及无毛小鼠耳lobe血栓诱导 活体显微成像，血栓形成，无毛小鼠，耳lobe，血管生物学，血小板聚集，微循环
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
血管疾病导致的血栓并发症是工业国家中发病率和死亡率的主要原因之一。由于血栓形成过程中血细胞与非细胞血液成分之间存在复杂的相互作用，对血栓生理学与病理生理学的可靠研究仅能通过体内实验进行。 体内因此，本文介绍了一种在无毛小鼠中的耳部模型，并重点研究了 体内 微循环、血栓形成及血栓演变的分析。通过使用活体荧光显微技术以及静脉注射（iv）相应的荧光染料，可对耳廓微循环进行重复性分析，且无需手术准备。此外，该模型还可用于 体内 研究不同问题，包括伤口愈合、再灌注损伤或血管生成。总之，无毛小鼠的耳朵是理想的模型 体内 在生理或病理生理条件下对皮肤微循环的研究，以及对其对不同全身性或局部治疗反应的评估。
引言
本文旨在介绍将活体显微技术应用于无毛小鼠耳廓，以直接观察和分析微循环、血栓形成及血栓演变的方法。静脉血栓的发生率为每1,000人中1例，仍是导致发病的重要原因。尽管近年来在诊断、预防策略和治疗方面已取得进展，但约三分之一的静脉血栓以肺栓塞的形式表现1。动脉血栓在心血管疾病中起着关键作用，而心血管疾病是工业国家最常见的死亡原因。由动脉粥样硬化斑块破裂引发的动脉血栓参与了心肌梗死、肠系膜梗死和脑卒中的发生。任何外科手术都会使内皮下结构暴露于血液成分，改变血流动力学，并导致患者活动受限。在下肢关节置换术、器官移植和皮瓣手术中，血栓形成是导致并发症的常见原因。尤其是微血管血栓，由于缺乏临床症状，常导致不可逆的组织损伤。同样，微血管血栓在多种疾病中发挥着关键作用，包括血栓性血小板减少性紫癜、脓毒症、弥散性血管内凝血、抗磷脂抗体综合征和慢性静脉功能不全等。
近年来开发了多种用于血栓形成治疗和预防的新药，但抗血小板药物和抗凝剂仍存在副作用、缺乏特异性拮抗剂以及作用持续时间较长等问题。这些缺陷给急诊医疗带来了困难。因此，需要进一步研究以揭示血栓形成过程中复杂的生物学机制，而这些过程极难被模拟 体外.
无毛SKH1-Hrhr小鼠于1926年在伦敦的一家动物园中被发现。由于14号染色体上的基因缺陷，该动物在出生后第10天开始脱毛。这使得血供丰富的耳廓便于....
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方案
所有 in vivo 实验（7221.3-1-006/15）均依照德国动物保护法规以及《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》（国家研究委员会实验动物资源研究所）进行。
1. 动物的一般饲养
- 使用4至6周龄的雄性SKH1-Hrhr小鼠进行实验，选择体重在20至25 g之间的动物。
- 将动物饲养于无病原体的设施中，在24至26 °C、相对湿度约60%的标准条件下饲养，并可自由持续获取水和食物（ad libitum）。
- 每笼最多饲养五只雄性动物。在饲养期间提供垫料和环境丰富化材料，以保障动物福利。
2. 动物的预先准备
- 称重小鼠并给予相应药物（例如， 将大麻素（5 mg/kg 体重（bw））注入胰岛素注射器中。在血栓诱导前 30 分钟给予药物。
- 用拇指和食指夹住小鼠颈部，小指捏住小鼠尾巴，将小鼠拉直，将药物注射至腹部左下象限的腹腔内（ip）。将小鼠放回笼中静置15分钟。
- 使用氯胺酮（90 mg/kg 体重）和赛拉嗪（25 mg/kg 体重）配制麻醉剂。在诱导血栓形成前 15 分钟对小鼠进行麻醉。将小鼠放入笼中，轻轻拉出尾巴，用胰岛素注射器经腹腔注射麻醉剂。
- 将小鼠放回笼中，直至麻醉开始。为....
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结果
大麻素治疗对血栓形成的影响
注射0.05 mL FITC-葡聚糖后，光毒性血栓诱导导致内皮损伤及壁侧血小板栓塞的形成（图2 和 3）。在本研究中，腹腔注射大麻素（5 mg/kg 体重）或溶剂后诱导血栓形成，导致所有小静脉均出现血栓性血管闭塞图4）。在溶剂处理的动物中，血栓形成时间为430秒（25th 百分位数：330 秒；75th 百分位数：637 秒）。给予大麻二酚（CBD）或 WIN55,212-2（WIN）对血管闭塞时间均未显示出显著影响。然而，内源性大麻素类花生四烯酸乙醇胺（anandamide）显著缩短了血栓形成及血栓性血管闭塞所需时间，降至 270 秒（25th 百分位数：240 秒；75th 百分位数：360 秒，P < 0.05 对照组）。
.......访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在SKH1-Hrhr小鼠耳lobule中成功诱导血栓形成有几个关键步骤。如需故障排查，相关步骤已在括号中注明。
在4至6周龄且表皮角化程度较低的幼龄动物中，检查条件最为理想。在较年长的动物中，由于皮肤表面与目标血管之间的距离较大，血管的可视化质量较差且可比性较低（步骤1.1）。
为防止FITC-葡聚糖在观察区域发生外渗，固定缝线应尽可能靠近边缘放置。在缝线附近，荧光染料可能发生外渗，从而降低血管外空间与血管之间的对比度。这种染料的外渗过程较为缓慢。若按照上述方法在注射FITC-葡聚糖前15分钟完成缝合，则可确保活体显微观察的良好条件（步骤2.8）。
异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖通过肾脏缓慢清除。将荧光染料与高分子量葡聚糖（150 kDa）结合可延缓其血管外渗出和排泄。在本研究中，显微观察和血栓诱导的时间被限制在1小时内，以避免排泄过程及血浆中荧光染料浓度降低对血栓形成时间的影响。
在填充注射器时，.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SKH-1/hr 小鼠 | Charles River | 477 | 可从其他供应商处购买 |
| 标准实验室饲料 | ssniff Spezialdiaeten | V1594-0 | 可从其他供应商处购买 |
| 手术体视显微镜 | Leica | M651/M655 | 可从其他供应商处购买 |
| 活体显微镜 | Zeiss | Axiotech Vario 100 | 可从其他供应商处购买 |
| 物镜（20X/0.95） | Zeiss | 20x/0,50 W；Plan-NEOFLUAR | 可从其他供应商处购买 |
| 物镜（63X/0.95） | Zeiss | 63x/0,95 W；ACHROPLAN | 可从其他供应商处购买 |
| 黑白CCD相机 | Pieper | FK 6990 IQ-S | 可从其他供应商处购买 |
| DVD录像机 | Panasonic | DMR-EX99V | 可从其他供应商处购买 |
| 氯化钠 | Braun | 5/12612055/1011 | 可从其他供应商处购买 |
| 10% 氯胺酮 | Bela pharm | F3901-6 | 可从其他供应商处购买 |
| 2% 赛拉嗪 | Bayer | 6293841.00.00 | 可从其他供应商处购买 |
| 5% FITC-葡聚糖 | Sigma | 46945-100MG-F | 可从其他供应商处购买 |
| 5% 泛醇眼膏 | Bayer | 6029009.00.00 | 可从其他供应商处购买 |
| 4% 甲醛 | Sigma | HT501128-4L | 可从其他供应商处购买 |
| DMSO | Sigma | 472301 | 可从其他供应商处购买 |
| 盖玻片 5 × 5 × 1 mm | Menzel | L4339 | 可从其他供应商处购买 |
| 粘性胶带 | Leukosilk | 4683400 | 可从其他供应商处购买 |
| 离心机 | Beckman Coulter | CLGS 15 | 可从其他供应商处购买 |
| 血液学分析仪 | Sysmex | KX-21 A6980 | 可从其他供应商处购买 |
| EDTA采血管 | Sarstedt | 201,341 | 可从其他供应商处购买 |
| 棉签 | Sanyo | 604-A-1 | 可从其他供应商处购买 |
| 红外灯 | Beurer | 5/13855 | 可从其他供应商处购买 |
| 一次性注射器 | Braun | 2020-08 | 可从其他供应商处购买 |
| 胰岛素注射器 | Braun | 9161502 | 可从其他供应商处购买 |
| 一次性皮下注射针头 | Braun | 465 7640 | 可从其他供应商处购买 |
| 端对端毛细管 | Sarstedt | 19,447 | 可从其他供应商处购买 |
| 加热板 | Klaus Effenberg | OP-T 185/03 | 可从其他供应商处购买 |
| 14.5 cm 手术剪 | Aesculap | BC259R | 可从其他供应商处购买 |
| 持针器 | Aesculap | BM081R | 可从其他供应商处购买 |
| 显微镊 | Aesculap | BD331R | 可从其他供应商处购买 |
| 显微剪 | Aesculap | OC496R | 可从其他供应商处购买 |
| 21号手术刀 | Dahlhausen | 11.000.00.511 | 可从其他供应商处购买 |
| Prolene 7-0 | Ethicon | XNEH7470 | 可从其他供应商处购买 |
| Prolene 6-0 | Ethicon | XN8706.P33 | 可从其他供应商处购买 |
| 电凝器 | Servoprax | H40140 | 可从其他供应商处购买 |
| 丙烯酸玻璃垫板 | 集成加热功能，0.5 cm 高的平面 |
参考文献
- White, R. H. The epidemiology of venous thromboembolism. Circulation. 107 (23), I4-I18 (2003).
- Benavides, F., Oberyszyn, T. M., VanBuskirk, A. M., Reeve, V. E., Kusewitt, D. F. The hairless mouse in skin research. J Dermatol Sci. 53 (1), 10-18 (2009).
- Grambow, E., Strüder, D., Klar, E., Hinz, B., Vollmar, B.
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重印与许可
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