在此，我们展示了如何定量分析突触活性区的数量及其空间分布 果蝇 黑腹果蝇 光感受器，使用基因编码的分子标记进行标记，以及其在长时间光照暴露后的调节变化。
方法文章
* These authors contributed equally
在此，我们展示了如何定量分析突触活性区的数量及其空间分布 果蝇 黑腹果蝇 光感受器，使用基因编码的分子标记进行标记，以及其在长时间光照暴露后的调节变化。
神经系统具有显著的适应能力，可对各种刺激作出响应。这种神经调节主要通过突触水平的可塑性实现。活性区（Active Zone, AZ）是位于突触前膜、介导神经递质释放的区域，由大量支架蛋白密集组成。Drosophila melanogaster （黑腹果蝇，Drosophila）光感受器的活性区在长时间暴露于自然环境光后会发生分子水平的重塑。因此，神经元活动水平可改变活性区的分子组成，进而调控其功能输出。
从光照实验装置的准备到免疫组织化学分析，本实验方案详细介绍了如何定量分析黑腹果蝇（Drosophila）感光细胞中活性区（AZs）突触分子的数量、空间分布以及错位程度。利用图像分析软件，识别每个R8感光细胞（R8）轴突末端中与GFP融合的活性区组分Bruchpilot所形成的簇。检测到的Bruchpilot信号点被自动分配至各个R8轴突。为计算信号点沿轴突的频率分布，我们开发了一款定制的软件插件。每根轴突的起始点和终止点由人工定义，每个Bruchpilot信号点的位置被投影到起始点与终止点之间的连线上。除了Bruchpilot簇的数量外，我们还量化了Bruchpilot-GFP在簇内的错位水平。这些测量结果能够详细反映单个神经元在不同环境条件或刺激下突触动态的空间分辨特征。
突触功能的调节有助于神经系统精确响应或适应不断变化的环境刺激。调节突触前囊泡释放概率是控制突触强度的一种方式1突触小泡释放发生在活性区（AZ），即突触前膜的一个特化区域2AZ 由一组特定蛋白质构成的复合体所表征3,4. 参与活性区组装的大多数蛋白质在线虫、昆虫和哺乳动物中高度保守5最近的研究表明，神经元活动水平可调控活性区（AZ）的分子组成，进而影响其功能输出的调控 体外 和 体内6,7,8我们先前发现，光感受器活性区在分子水平上会发生重塑 果蝇 长时间暴露于自然环境光后9在此条件下，我们观察到光感受器轴突中Bruchpilot（Brp）阳性活性区的数量减少。
Brp/CAST/ELKS 家族蛋白是脊椎动物和无脊椎动物突触活性区（AZ）的基本结构单元10。在 Drosophila....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本方案中描述的实验操作仅涉及黑腹果蝇（Drosophila）的研究，在德国和日本不受动物福利法的约束。
1. 光照条件
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
复眼 果蝇 包含约780个小眼，每个小眼含有八种光感受器（R1-8）。R7和R8将其轴突投射至第二视叶——髓状体，在其中分别于M6层和M3层形成突触26为了研究长时间光照暴露对光感受器R8活性区分子组成的影响，我们采用了STaR方法。15. 通过翻转终止密码子对 Brp 的内源性表达水平进行荧光标记 brp-FSF-gfp 由R8感光细胞中表达的翻转酶 sens-flp果蝇在羽化后于LL、LD或DD条件下饲养1 - 3天，持续相同时间 25 °C (图1A）。为了使果蝇暴露于1,000勒克斯的光照下，将果蝇放入丙烯酸树脂支架中（图1B）并置于小型培养箱中，与LED光源保持相同距离图1C).
免疫.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
在本研究中，我们展示了如何设置光照条件，使果蝇暴露于相等的光强度下。我们不仅量化了突触标志物斑点的数量，还能在空间上解析沿轴突的突触密度，并测量标志蛋白在细胞质区域的去定位水平。这三项评估使我们能够在不同环境条件下，在单个神经元水平上评价突触动态的细节。我们的方案可适用于不同的突触蛋白，也可推广至任何包含斑点信号的数据。
该实验方案中的一个关键步骤是脑组织的制片。黑腹果蝇（Drosophila）的感光细胞将其轴突投射至第二视叶——髓状体。如果制片时脑组织在显微镜载玻片上的位置正确，则可直接对每根感光细胞轴突进行扫描。正确的制片方式也有助于更便捷地利用图像分析软件功能选择目标感光细胞。每个感光细胞区域必须手动选取，以统计其中斑点（puncta）的数量及其去定位程度。起始点和终止点也需手动选定。完成这些准备工作需要相对较长的时间，之后才能进入定量分析阶段。R8轴突的优势在于其无分支结构，且每根R8轴突相互独立。对于此类应用，推荐使用这种结构简单的孤立神经元，因为需要精确定义神经元的准确区域。此外，这种方法有助于排除来自其他神经元的非特异性斑点和表面信号。然而，该方法的.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者无任何利益冲突需要披露。
我们感谢 T. Stürner 对手稿提出的有益修改、讨论和意见；感谢 S.L. Zipursky 提供果蝇品系；感谢 M Schölling 进行图像处理。部分图像分析工作在 A. Kakita 实验室完成。本研究得到了亚历山大·冯·洪堡基金会和日本学术振兴会海外研究奖学金（A.S.）、日本学术振兴会研究员奖学金（S.H.-S.）、启动项目资助（24800024）、创新领域项目资助（25110713）、Mochida 基金会、武田基金会、稻盛基金会、第一三共基金会、东丽科学基金会（T.S.）、德国神经退行性疾病中心核心资金（G.T.）以及德国神经退行性疾病中心光学显微镜平台（C.M.）的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小瓶 | 日本高科 | MKC-20 | |
| 插头 | Thermo Fisher Scientific，美国 | AS-275 | |
| 由丙烯酸树脂制成的定制透明支架 | 日本新新公司 | 高度41 cm，底边21 cm，厚度4 cm，每级台阶高度13 cm | |
| 冷却培养箱 | MITSUBISHI ELECTRIC，日本 | CN-40A | |
| LED 面板 | 日本三佳 | LEDXC170-W | |
| 数字光照计 | CEM | DT-1301 | |
| 果蝇培养垫 | 日本Tokken | TK-HA03-S | |
| 培养皿（35 × 10 mm） | 德国 Greiner Bio-One International | 627102 | |
| PBS片剂 | 日本宝生物工程公司 | T900 | |
| Triton X-100 | 日本和光市 | 160-24751 | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 mL 离心管 | 德国萨尔斯特 | A. 152X | |
| 甲醛 16% | 日本 NEM | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| 抗chaoptin抗体 | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568标记的抗小鼠抗体 | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD 封片剂 | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| 显微镜载玻片（76 × 26 mm） | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG，德国 | ||
| 盖玻片（18 × 18 mm，0.17 mm） | 德国蔡司 | 474030-9000-000 | |
| 工业显微镜 | 日本奥林巴斯公司 | SZ61-C-SET | |
| 体视显微镜照明 | 日本 Olympus | KL 1600 LED | |
| 共聚焦显微镜 | 德国蔡司 | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane，瑞士 | 7.6.4 或更高版本 | |
| Matlab | 美国 MathWorks, Inc. | ||
| 适用于 Mac 的 Excel | 微软 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表
申请许可