方法文章

分析长期光照后黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）感光细胞的突触调节

DOI：

10.3791/55176

⸱

2017年2月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience of Disease, Center for Transdisciplinary Research, Niigata University, 2Brain Research Institute, Niigata University, 3Image and Data Analysis Facility, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 4Graduate School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology (Titech), 5Dendrite Differentiation, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在此，我们展示了如何定量分析突触活性区的数量及其空间分布 果蝇 黑腹果蝇 光感受器，使用基因编码的分子标记进行标记，以及其在长时间光照暴露后的调节变化。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经系统具有显著的适应能力，可对各种刺激作出响应。这种神经调节主要通过突触水平的可塑性实现。活性区（Active Zone, AZ）是位于突触前膜、介导神经递质释放的区域，由大量支架蛋白密集组成。Drosophila melanogaster （黑腹果蝇，Drosophila）光感受器的活性区在长时间暴露于自然环境光后会发生分子水平的重塑。因此，神经元活动水平可改变活性区的分子组成，进而调控其功能输出。

从光照实验装置的准备到免疫组织化学分析，本实验方案详细介绍了如何定量分析黑腹果蝇（Drosophila）感光细胞中活性区（AZs）突触分子的数量、空间分布以及错位程度。利用图像分析软件，识别每个R8感光细胞（R8）轴突末端中与GFP融合的活性区组分Bruchpilot所形成的簇。检测到的Bruchpilot信号点被自动分配至各个R8轴突。为计算信号点沿轴突的频率分布，我们开发了一款定制的软件插件。每根轴突的起始点和终止点由人工定义，每个Bruchpilot信号点的位置被投影到起始点与终止点之间的连线上。除了Bruchpilot簇的数量外，我们还量化了Bruchpilot-GFP在簇内的错位水平。这些测量结果能够详细反映单个神经元在不同环境条件或刺激下突触动态的空间分辨特征。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

突触功能的调节有助于神经系统精确响应或适应不断变化的环境刺激。调节突触前囊泡释放概率是控制突触强度的一种方式1突触小泡释放发生在活性区（AZ），即突触前膜的一个特化区域2AZ 由一组特定蛋白质构成的复合体所表征3,4. 参与活性区组装的大多数蛋白质在线虫、昆虫和哺乳动物中高度保守5最近的研究表明，神经元活动水平可调控活性区（AZ）的分子组成，进而影响其功能输出的调控 体外 和 体内6,7,8我们先前发现，光感受器活性区在分子水平上会发生重塑 果蝇 长时间暴露于自然环境光后9在此条件下，我们观察到光感受器轴突中Bruchpilot（Brp）阳性活性区的数量减少。

Brp/CAST/ELKS 家族蛋白是脊椎动物和无脊椎动物突触活性区（AZ）的基本结构单元10。在 Drosophila brp 突变体中，诱发性囊泡释放受到抑制11,12。Drosophila 神经肌肉接头（NMJ）处突触囊泡的聚集依赖于 Brp 的 C 末端 17 个氨基酸残基13,14。这些研究证明了该分子在活性区组织与功能中的核心作用。借助最近开发的一种遗传工具——重组介导的突触标记（Synaptic Tagging with Recombination, STaR），可以在特定细胞类型中、在内源性表达水平下，并以单个突触的分辨率对 Brp 进行 体内 观察15。该工具使得在复杂的中枢神经系统中对突触的内源性动态进行定量评估成为可能。

已有若干研究基于共聚焦显微镜获得的数据对突触进行定量分析。通过使用复杂的软件应用程序，研究人员已对突触的长度、面积、体积、密度进行测量，并对其数量进行计数以评估突触的改变。例如，免费软件ImageJ提供了一种用于果蝇（Drosophila）NMJ突触总面积和突触密度测量的定量方法16。利用ImageJ软件平台上的插件"Puncta Analyzer"，可对突触前和突触后标记物的共定位位点数量进行定量分析17。此外，基于多范式数值计算环境开发的程序Synapse Detector（SynD）能够自动追踪用荧光标记物标记的神经元树突，并定量分析突触蛋白水平随胞体距离的变化情况18。Synaptic Puncta Analysis（SynPAnal）软件专为快速分析通过共聚焦或荧光显微镜获取的神经元二维图像而设计，其主要功能是对蛋白斑点的密度和强度进行自动且快速的定量19。最近，已开发出一种基于自动学习的突触检测算法，可用于三维空间中突触数量的定量分析20，该方法充分利用了三维可视化辅助分析软件（Vaa3D）的功能21。

商用图像分析软件也是突触定量分析的有力工具。例如，在线虫（C. elegans）22 或果蝇（Drosophila）嗅觉系统23,24 中，已实现对荧光标记的神经递质受体或突触前活性区组分的三维、单突触分辨率定量，可在单个样本中快速表征数百个突触。

本文介绍了一种在多范式数值计算环境中实现的定制化图像分析软件插件方法，可对活性区（AZs）的多个方面进行半自动分析，包括其数量、分布以及分子组分在活性区的富集程度。该复杂的分析方法使我们能够在不同环境条件下评估轴突末梢中突触组分的动态变化。我们研究了光暴露对成年果蝇感光细胞输出突触的影响。实验过程分为三个步骤：1）光暴露前准备；2）组织解剖、免疫组织化学染色及共聚焦成像；3）图像分析。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案中描述的实验操作仅涉及黑腹果蝇（Drosophila）的研究，在德国和日本不受动物福利法的约束。

1. 光照条件

  1. 准备携带sensless-flippase（sens-flp）和bruchpilot-FRT-STOP-FRT-gfp（brp-FSF-gfp）15的果蝇，用于在感光神经元R8（R8s）中可视化Brp-GFP。该brp-FSF-gfp构建体是通过对细菌人工染色体（BAC）中编码brp的基因组位点进行修饰而获得的。在携带该修饰BAC的果蝇中，Brp-GFP的表达受内源性调控序列控制，但仅在sensless-flippase介导去除FRT-STOP-FRT盒后局限于R8感光细胞中表达15。需注意的是，sens-flp在R7细胞中极少表达flippase。
  2. 从幼虫阶段起至羽化期间，将果蝇置于25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环（LD）条件下饲养（图1A）。
  3. 在羽化后0–6小时内收集果蝇，并将其转移至含有果蝇食物的新试管中。
  4. 将试管放入由丙烯酸树脂制成的三阶梯透明支架中（总高度41 cm，底座21 cm，厚度4 cm，每级台阶高13 cm）（图1B）。
  5. 调节支架与LED面板之间的距离，使用数字照度计确保光照平均强度为1,000 lux（图1C）。
  6. 将果蝇在25 °C的小型培养箱中分别置于以下一种条件下培养1–3天：持续黑暗（DD）、12小时光照/12小时黑暗循环（LD）或持续光照（LL）（图1A和图1C）。

2. 解剖、免疫组织化学与成像

  1. 用镊子解剖果蝇大脑，用4%甲醛固定，并根据先前的实验步骤使用抗Chaoptin的一抗（1:50）和用于标记感光细胞的二抗进行免疫染色25。简要步骤如下：
    1. 在PBS中配制含0.1% Triton X-100的溶液（0.1% PBT）。该溶液用于提高抗体在组织中的渗透性。
    2. 将果蝇置于CO2麻醉垫上麻醉，挑选出正确基因型的果蝇，并转移至盛有0.1% PBT的培养皿中。
    3. 将镊子插入喙下方，用另一把镊子分别拉下左右眼。
    4. 去除附着在大脑上的喙和气管。
    5. 用镊子将大脑转移至含有150 µL 0.1% PBT的1.5 mL离心管中，室温放置。
    6. 在10分钟内重复步骤2.1.3至2.1.5，以尽可能多地收集大脑。
    7. 向管中加入50 µL 16%甲醛，并用移液器混匀。
    8. 将大脑在室温下用固定液孵育50分钟。
    9. 用移液器以200 µL 0.1% PBT洗涤三次，注意将大脑保留在管内。
    10. 最后一次洗涤后，吸除0.1% PBT，加入预先配制的一抗溶液：在196 µL 0.3% PBT（含0.3% Triton X-100的PBS）中加入4 µL抗Chaoptin抗体（终稀释比例为1:50），用于标记感光细胞。
    11. 将大脑在4 °C下与一抗溶液孵育过夜（O/N）。
    12. 用移液器以200 µL 0.1% PBT洗涤三次。
    13. 最后一次洗涤后，吸除0.1% PBT，加入200 µL含二抗的0.3% PBT溶液。
    14. 避光，在4 °C下孵育过夜（O/N）。
    15. 用移液器以200 µL 0.1% PBT洗涤三次。
  2. 封片时，用移液器在载玻片中央滴加两小滴封片剂（每滴2 µL），两滴之间相距约2 cm。
  3. 将两张盖玻片分别覆盖在两滴封片剂上，两张盖玻片之间留出约0.2 mm的狭窄间隙。
  4. 在盖玻片上方加入15 µL封片剂，并用移液器将大脑加入封片剂中。
  5. 在解剖显微镜下，将大脑腹面朝上置于两张盖玻片之间的狭窄间隙中（图2）。
  6. 在上方加盖一张盖玻片，并用透明指甲油密封盖玻片边缘以固定样品（图2）。
  7. 使用共聚焦显微镜拍摄大脑图像。采用63X油镜（1.4 N. A.）和2.6X数字放大倍数，对第二视叶髓质区域进行成像，以0.5 µm的步长采集20层以上的光学切片。

3. 斑点的生成， 表面物体、起始点和 终点

  1. 为了定量分析Brp-GFP斑点的数量、分布及去定位化程度，将共聚焦显微镜获得的图像序列在图像分析软件中打开，并重建三维图像（图3A）。请注意，本研究中的此步骤使用 Imaris 完成。
  2. 使用点检测模块识别每个R8轴突末端的Brp-GFP puncta。
    1. 选择 "添加新斑点".
    2. 选择 "仅分割感兴趣区域" 在算法设置中，手动选择髓质中的 R8 轴突末梢。
    3. 选择 Brp-GFP 信号的源通道。
      注意：R7 和 R8 光感受器轴突使用抗 Chaoptin 抗体进行免疫标记（图3A）。然而，只有R8含有Brp-GFP puncta，因此可以轻松区分（图3A此外，R8的终点可通过抗Chaoptin阳性轴突在进入M3髓质层时的变细来确定。
    4. 将估计的XY直径设置为0.35 µm并勾选 "背景扣除" 在斑点检测中。
    5. 选择 "质量" 根据滤镜类型和滤镜自动设置，然后单击完成。
    6. 重复步骤 3.2.1 至 3.2.5，针对其他 R 轴突（图3B).
  3. 为了测量R8轴突中Brp-GFP的离域化水平，使用表面对象生成 "表面" 每条轴突的功能图3C).
    1. 选择 "添加新表面".
    2. 选择 "仅分割感兴趣区域" 在算法设置中，然后手动选择髓质中的 R8 轴突末梢。
    3. 选择光感受器的信号源通道。
    4. 检查并确认 "平滑".
    5. 选择 "绝对强度" 在阈值中。
    6. 检查 "启用". "种子点直径" 是 0.5 µm。
    7. 选择滤光片类型 "质量" 和 "体素数量"，然后自动过滤。
    8. 前往 "编辑" 并删除在其他无关轴突上生成的表面碎片。
    9. 重复 3.3.1 - 3.3.8 步骤，用于其他 R 轴突（图3C）。注意，由于M2层光感受器信号较弱且层较薄，部分表面物体出现中断，但仍将其视为从起点到终点的单一物体。
  4. 为了确定Brp-GFP斑点在髓质神经 Neuropil 中每个神经元上的分布，使用测量点功能定义起点和终点图3D).
    1. 选择 "添加新的测量点"然后选择 "编辑" 并选择 "物体表面" 与表面物体的顶部相交。
    2. 按顺序将测量点置于M1层R轴突的表面物体上方。这些点现被定义为起始点（图3D).
    3. 选择 "添加新的测量点"然后选择 "编辑" 并选择 "物体表面" 与表面物体的底边相交。
    4. 按顺序在M3层R轴突表面结构的底部放置测量点，这些点现被定义为终点图3D).
  5. 为了从GFP通道中减去背景信号，在M6层中为两条R轴突生成表面对象、斑点、起始点和终止点（图3E).
    1. 选择 "添加新表面".
    2. 选择 "仅分割感兴趣区域" 在算法设置中，然后手动选择 M5 和 M6 层之间的 R7 轴突终末。
    3. 选择光感受器的源通道。
    4. 检查并确认 "平滑".
    5. 选择 "绝对强度" 在阈值中。
    6. 选择滤光片类型 "质量" 和 "体素数量"，然后自动过滤。
    7. 选择 "添加新斑点".
    8. 选择 "跳过自动创建，手动编辑".
    9. 选择 "物体中心" 并在由 3.5.1 - 3.5.6 生成的表面对象的内区添加一个点。
    10. 重复步骤 3.5.1 3.5.9 用于另一个 R7 轴突终末。
    11. 选择 "添加新的测量点"然后选择 "编辑" 在M6层R7轴突末端的两个表面结构上放置测量点，这些点现被定义为起始点。
    12. 选择 "添加新的测量点"然后选择 "编辑" 并在M6层R7轴突末端的两个表面结构底部设置测量点。这些点现被定义为终点（图3E).

4. 使用定制化图像数据分析软件计算Brp-GFP的斑点数量、斑点频率分布及富集水平

  1. 复制文件 "XtquantifySynapseSNR.m" 以及 "功能" 将文件夹放入 Imaris XT Matlab 文件夹中。请注意，本研究中的计算是通过在 Matlab 中实现的自定义插件完成的。从网站下载该插件（https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo).
  2. 打开一个包含 n 个点、n 个表面以及 2 个测量点对象的数据集，每个测量点对象包含 n 个测量点（由 3.1 - 3.4 步骤制备）。第一个测量点对象定义所有轴突的起始位置，第二个测量点对象定义所有轴突的终止位置。两个测量点对象必须具有相同数量的测量点（即轴突的数量）。
  3. 执行图像处理>>自定义>atsushis 突触检测 Vs 6.
  4. 检查元数据，如果图像分析软件中的像素尺寸不正确，则进行修改。
  5. 选择用于斑点区域和胞质区域强度分析的通道（Brp-GFP 通道）。
  6. 定义用于导出结果的文件名。
  7. 定义分箱数量和轴突长度的百分比。将分箱数量输入为 "10" 以及分组区间范围 "100%" (图4A 和 4B).
  8. 为Brp-GFP去定位分析定义斑点区域及其他胞质区域。输入斑点半径作为 "0.35 µm" 周围区域的长度和宽度 "50 µm"斑点半径定义了 puncta GFP 信号的区域（直径 0.35 µm，以一个 punctum 为中心）。周围区域的宽度定义了胞质区域中 GFP 信号的范围（直径 50 µm，以 punctum 为中心，但仅包含 R8 区域，并排除胞质中所有斑点区域）图4A 和 4C).
  9. 等待所有神经元掩膜处理完毕并导出为 PDF 文件（图4B 和 4C）以及用于电子表格进一步分析的 csv 表格。该 csv 表格包含点的数量、点阵信号强度的平均值 "细胞质区域" 以及信号强度的最大值在 "斑点" 所有R8轴突每个区间的数量。
  10. 打开在3.5中准备的数据集，以减去背景信号。
  11. 按照4.3至4.9节所述进行图像处理。
  12. 在电子表格中计算 Brp-GFP 簇的总数及其分布的平均值（图4D 和 4E).
  13. 通过 Brp-GFP 信号在指定区域的平均强度比值，在电子表格中计算其离域化的平均值 "细胞质区域" 除以最大强度值 "斑点" 减去背景信号的平均强度（图4F).

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

复眼 果蝇 包含约780个小眼，每个小眼含有八种光感受器（R1-8）。R7和R8将其轴突投射至第二视叶——髓状体，在其中分别于M6层和M3层形成突触26为了研究长时间光照暴露对光感受器R8活性区分子组成的影响，我们采用了STaR方法。15. 通过翻转终止密码子对 Brp 的内源性表达水平进行荧光标记 brp-FSF-gfp 由R8感光细胞中表达的翻转酶 sens-flp果蝇在羽化后于LL、LD或DD条件下饲养1 - 3天，持续相同时间 25 °C (图1A）。为了使果蝇暴露于1,000勒克斯的光照下，将果蝇放入丙烯酸树脂支架中（图1B）并置于小型培养箱中，与LED光源保持相同距离图1C).

免疫...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本研究中，我们展示了如何设置光照条件，使果蝇暴露于相等的光强度下。我们不仅量化了突触标志物斑点的数量，还能在空间上解析沿轴突的突触密度，并测量标志蛋白在细胞质区域的去定位水平。这三项评估使我们能够在不同环境条件下，在单个神经元水平上评价突触动态的细节。我们的方案可适用于不同的突触蛋白，也可推广至任何包含斑点信号的数据。

该实验方案中的一个关键步骤是脑组织的制片。黑腹果蝇（Drosophila）的感光细胞将其轴突投射至第二视叶——髓状体。如果制片时脑组织在显微镜载玻片上的位置正确，则可直接对每根感光细胞轴突进行扫描。正确的制片方式也有助于更便捷地利用图像分析软件功能选择目标感光细胞。每个感光细胞区域必须手动选取，以统计其中斑点（puncta）的数量及其去定位程度。起始点和终止点也需手动选定。完成这些准备工作需要相对较长的时间，之后才能进入定量分析阶段。R8轴突的优势在于其无分支结构，且每根R8轴突相互独立。对于此类应用，推荐使用这种结构简单的孤立神经元，因为需要精确定义神经元的准确区域。此外，这种方法有助于排除来自其他神经元的非特异性斑点和表面信号。然而，该方法的...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 T. Stürner 对手稿提出的有益修改、讨论和意见；感谢 S.L. Zipursky 提供果蝇品系；感谢 M Schölling 进行图像处理。部分图像分析工作在 A. Kakita 实验室完成。本研究得到了亚历山大·冯·洪堡基金会和日本学术振兴会海外研究奖学金（A.S.）、日本学术振兴会研究员奖学金（S.H.-S.）、启动项目资助（24800024）、创新领域项目资助（25110713）、Mochida 基金会、武田基金会、稻盛基金会、第一三共基金会、东丽科学基金会（T.S.）、德国神经退行性疾病中心核心资金（G.T.）以及德国神经退行性疾病中心光学显微镜平台（C.M.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
小瓶日本高科MKC-20
插头Thermo Fisher Scientific，美国AS-275
由丙烯酸树脂制成的定制透明支架 日本新新公司高度41 cm，底边21 cm，厚度4 cm，每级台阶高度13 cm
冷却培养箱MITSUBISHI ELECTRIC，日本CN-40A
LED 面板日本三佳LEDXC170-W
数字光照计CEMDT-1301
果蝇培养垫日本TokkenTK-HA03-S
培养皿（35 × 10 mm）德国 Greiner Bio-One International627102
PBS片剂日本宝生物工程公司T900
Triton X-100日本和光市160-24751
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11251-20
1.5 mL 离心管德国萨尔斯特A. 152X
甲醛 16%日本 NEM3152
Pipetman P-200GilsonF123601 
Pipetman P-20GilsonF123600
Pipetman P-2GilsonF144801
抗chaoptin抗体DSHB24B10
Alexa568标记的抗小鼠抗体Life TechnologiesA-11031
VECTASHIELD 封片剂Vector Laboratories, Inc.H-1000
显微镜载玻片（76 × 26 mm）Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG，德国
盖玻片（18 × 18 mm，0.17 mm）德国蔡司474030-9000-000
工业显微镜日本奥林巴斯公司SZ61-C-SET
体视显微镜照明日本 OlympusKL 1600 LED
共聚焦显微镜德国蔡司LSM780
ImarisBitplane，瑞士7.6.4 或更高版本
Matlab美国 MathWorks, Inc.
适用于 Mac 的 Excel 微软

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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