使用仔猪模型研究麻醉诱导的发育性神经毒性（AIDN）：一种转化神经科学方法

摘要

麻醉诱导的发育性神经毒性（AIDN）研究主要集中于啮齿类动物，而这类动物对人类的广泛适用性有限。非人灵长类动物模型的相关性更高，但成本过高且实验操作困难。相比之下，仔猪是一种具有临床相关性和实用性的动物模型，非常适合用于麻醉神经毒性研究。

摘要

在需要手术的情况下，许多患者无法避免使用麻醉，尤其是在儿童中。近年来在动物中进行的研究引发了人们的担忧：麻醉暴露可能导致神经元凋亡，即所谓的麻醉诱导的发育性神经毒性（AIDN）。此外，一些针对儿童的临床研究也提示，麻醉暴露可能与日后出现神经发育缺陷相关。然而，目前尚未建立理想的用于临床前研究的动物模型。新生仔猪是一个有价值的临床前研究模型，因为其在发育过程中与人类具有显著的相似性。

仔猪的解剖学和生理学特性使其适用于在存活性和非存活性实验中实施严格的人类围手术期条件。股动脉插管可实现密切监测，从而能够及时纠正仔猪生命体征及生化指标的任何异常。此外，仔猪与人类新生儿在发育方面存在多种相似性。使用仔猪进行实验所需的技术需要经过实践积累才能掌握。儿科麻醉医师是研究团队中的关键成员。本文从一般意义上描述了仔猪模型在神经发育研究中的恰当应用。

引言

每年，美国有数百万儿童接受全身麻醉，其中许多儿童年龄在4岁以下¹。麻醉诱导的发育性神经毒性（AIDN）已成为小儿麻醉研究的重点，因为迫切需要了解麻醉对未成熟大脑的影响。先前的研究表明，常用麻醉药（如异氟烷）可导致幼年动物大脑中神经元凋亡增加。在儿童中进行的研究结果尚不一致²。阐明AIDN的发病机制、确定潜在的治疗靶点以预防或减轻其影响，以及明确目前最安全的麻醉方案，已成为小儿麻醉领域亟需实现的目标。本研究的主要目的是建立一种优化的动物模型和方法，用于量化麻醉药对发育中大脑的影响，并推动针对当前广泛使用麻醉药安全性的精心设计的研究。

在最近一项针对AIDN临床前研究文献的系统综述中，作者指出在超过900项研究中存在显著的方法学异质性³许多人认为，这实际上是在呼吁建立一种具有临床相关性且设计严谨的临床前模型，尽管在这一领域已进行了多年研究，但此类模型至今仍不存在。大多数啮齿类动物模型由于实际限制，采用的方法无法实现严格的生理监测、采血或机械通气。由于大脑对生理紊乱极为敏感，因此很难依赖此类模型所得出的结果。本模型开发的一个主要目标是将其设计为能够对所有生理变量进行精确控制和监测的形式 例如血气参数、体温、呼吸参数 等等。 在必要时进行监测和校正。

此外，由于麻醉的神经毒性可能取决于暴露时大脑的发育进程，因此应选择一种能够最好地模拟新生儿人脑发育和结构的动物模型，以最大限度地提高研究结果的转化相关性⁴。新生仔猪模型可提供此类综述和社论所追求的临床相关性水平，因其旨在满足获取相关临床前数据的需求，从而为未来的临床研究提供依据。

异氟烷是一种γ-氨基丁酸A型（GABA_A）受体激动剂和弱N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂，是全球临床实践中常用的吸入性麻醉药。长期以来，只要麻醉药如异氟烷不引起低血压或低氧血症，就被认为是安全的；然而，可能还存在更细微的影响。当大脑暴露于全身麻醉时，GABA激动与NMDA拮抗之间的平衡被打破，导致细胞结构、连接性和功能发生改变。此外，尽管GABA通常是一种抑制性神经递质，但在未成熟的大脑中已知具有兴奋作用⁵。GABA从兴奋性向抑制性转变的确切时间尚不明确，且可能因物种而异。

当大脑中所谓的兴奋性与抑制性输入之间出现失衡时 "脑生长激增"，关键分子通路的兴奋性毒性失调可能导致异常神经发育，例如凋亡性神经退行性变。除了凋亡增加外，还可能诱发氧化应激和炎症反应，同时神经元细胞增殖、神经元迁移以及轴突分支受到抑制或发生失调⁶最终结果是可能导致神经认知功能障碍，并持续至成年期².

为了直接测量异氟烷对年轻哺乳动物的神经毒性作用，研究人员使用新生仔猪作为模型。与其他哺乳动物相比，仔猪的中枢神经系统与人类更为相似，因此其神经发育和神经解剖学特征使其成为研究麻醉诱导的发育性神经毒性（AIDN）的一种具有临床相关性的理想哺乳动物模型。人类和仔猪均具有沟回状大脑，在脑沟回的形态与分布、灰质和白质结构方面具有相似性。仔猪的海马体、基底神经节和脑干在拓扑结构上也与人类高度相似⁷。在发育方面，仔猪是少数几种在围产期经历大脑生长和髓鞘化过程的非人类哺乳动物之一⁸。在子宫内，人类和仔猪的大脑均在妊娠晚期经历显著的生长过程。相应地，出生时人类和仔猪的大脑分别达到成年大脑体积的27%和25%。磁共振成像研究表明，一周龄仔猪大脑在神经元成熟度和树突分支形态方面大约相当于一个月龄人类婴儿的大脑⁹。此外，仔猪与人类大脑在神经发育模式上也存在多种相似之处。例如，reelin蛋白的表达及其mRNA序列¹⁰、5-HT神经元的拓扑分布¹¹以及神经管闭合过程¹²均与人类相似。此外，仔猪与人类基因组之间也存在广泛的同源性¹³。

动物模型的相关性必须结合人类疾病的病理背景来理解，特别是与人类婴儿大脑成熟度和病理生物学的关系。现有的大多数麻醉药物毒性研究采用啮齿类动物模型，少数使用非人灵长类动物模型。然而，啮齿类动物和灵长类动物可能并非研究麻醉诱导的神经毒性（AIDN）的理想动物。

尽管啮齿类动物被广泛使用，但其大脑在发育全过程中的结构与人类大脑存在显著差异。最显著的一点是，啮齿类动物具有无沟回（即平滑）的大脑，缺乏神经结构更复杂的生物所特有的脑回和脑沟。此外，啮齿类动物大脑在出生后会出现脑生长激增¹⁴，这与人类和仔猪的情况不同。已有研究观察到，不同脑区对吸入性麻醉药的易损性存在差异¹⁵。因此，在研究麻醉诱导的神经毒性（AIDN）时，理想的动物模型应具备在神经发育和神经解剖学上与人类相似的大脑，以便更准确地模拟儿科患者中可能出现的麻醉相关脑部改变。如前所述，仔猪的大脑在这一方面更为合适。此外，常用的啮齿类动物神经认知测试方法，例如通过莫里斯水迷宫评估的空间学习与记忆能力，与幼儿的神经认知评估并不直接相关或可比¹⁶。使用仔猪进行发育神经科学研究的一个优势在于，它们即使在早期年龄阶段也极易接受神经认知测试。许多被认为适用于其他哺乳动物物种的神经认知测试方法已在猪身上成功应用并得到验证。尽管该领域仍在不断发展，目前对仔猪的神经认知评估已包括一些更为复杂的测试，能更好地模拟人类的认知缺陷，例如倾斜梁运动测试^17,18和镜像空间意识测试¹⁹。在仔猪创伤性脑损伤研究中，倾斜梁运动测试作为运动功能评估手段表现出高度的可靠性。镜像测试则可反映动物对周围环境的记忆能力，以及识别并利用镜像寻找食物奖励的能力。

另一方面，非人灵长类动物可能是儿科麻醉研究更合适的模型，但存在诸多限制因素，包括成本高昂和使用难度大。此外，它们对早期饲养条件极为敏感，尤其是应激和母体分离²⁰。在灵长类动物中，与麻醉诱导发育性神经毒性（AIDN）研究相关的重要因素，如变构调节剂、受体-配体亲和力、翻译后修饰、受体亚基组成以及可变剪接异构体等均尚不明确。这是因为与这些概念相关的基因尚未被克隆。相比之下，这些基因已在猪中完成克隆。因此，目前在非人灵长类动物中开展的相关研究极为有限^21,22。

仔猪模型结合了啮齿类和非人灵长类模型的优势：成本较低，相对于非人灵长类研究更易于操作，且在神经解剖学和神经生理学方面与儿童人脑具有高度相似性。近年来，仔猪在神经科学研究中的应用日益增多，包括多项针对儿童神经炎症性疾病的研究所采用的模型。例如，已有研究探讨了呼吸道病毒感染对海马体及空间学习能力的影响²³，减轻中风后脑细胞死亡²⁴，创伤性脑损伤后的神经发生²⁵，以及癫痫发作期间的酶活性变化²⁶，这些研究均使用了新生仔猪模型。这一不断积累且日益丰富的文献资料，有力支持了仔猪模型在研究麻醉诱导神经毒性方面的适用性和可持续性，该模型具有临床相关性且高度可重复。

方案

健康的家猪仔猪（Sus scrofa）来自经俄亥俄州立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的农场。所有动物实验均在获得方案批准后，依照俄亥俄州立大学IACUC政策进行。

1. 动物与动物操作

1. 本实验使用雄性仔猪，以消除性别可能带来的混杂效应。注意：若实验目的包括评估实验对处于大脑快速生长期动物的影响，则不应使用超过14日龄的仔猪。
2. 实验前至少24小时将仔猪运送至动物饲养室，以适应环境。
   注意：由持证兽医监督的经过培训的兽医技术人员提供常规动物护理。
   1. 将仔猪饲养在独立的温控笼具中，并提供营养全面的商用仔猪代乳粉 随意摄取 为动物提供毯子和玩具。持续监测动物饲养环境的温度。
3. 本初步可行性研究中，异氟烷组使用18只仔猪，对照组使用22只仔猪。在可能的情况下，应根据研究设计进行样本量计算。将可获得的仔猪随机分配至对照组或暴露组，确保达到相应的暴露时长。根据经验，即使有多个研究人员参与，每天最多可完成2项实验（共计2只动物）。

2. 对照动物

1. 不要对对照组动物进行实验性干预。
2. 通过面罩吸入诱导深度全身麻醉，以进行灌注和组织采集操作。具体而言，在24小时适应期后，使用5%异氟烷或8%七氟烷与100%氧气混合对仔猪进行麻醉。 通过 面罩通气。禁用七氟醚进行诱导。
   注意：从麻醉诱导到开始冷PBS灌注的时间应尽可能短。有经验的技术人员可在5分钟内完成此过程。
   1. 通过使用手术钳夹捏 dewclaw（悬蹄）部位，确认无疼痛反射以确保麻醉深度足够。
   2. 为避免脑部缺氧/缺血性损伤，使用脉搏血氧仪监测仔猪，确保在开始灌注冷磷酸盐缓冲液（PBS）之前，维持足够的氧合、通气和心输出量。
      注意：为额外防止组织损伤，在麻醉诱导后将动物（包括头部）用冰包裹。
3. 进行心脏灌注。
   注意：由于使用了多聚甲醛，灌注操作应在通风橱或下吸式工作台中进行。
   1. 使用手术刀沿胸骨全长做头尾方向的切口，切口深度应足以暴露胸骨。
   2. 小心地使用一对锋利的粗剪刀行正中胸骨切开术，避免损伤心脏、肺或膈肌。必要时，将手指置于胸骨后方与胸腔内脏器之间，以防止损伤。通过在膈肌上做一个小的（手指大小）切口，将手指伸入纵隔。
   3. 进入胸腔后，使用自持式牵开器保持肋骨张开。
   4. 用镊子和剪刀切开心包膜，暴露跳动的心脏。注意避免损伤心脏。
   5. 识别左心室，小心地将一根导管（如14 G血管套管针）经心室心尖插入。拔出针芯，保留导管在原位。
      注意：操作时需小心避免刺破心室后壁。若导管中出现搏动性回血，则表明导管位置正确。此时可方便地从此动物采集血液样本。
   6. 确定右心房后，用剪刀在心房上做一个较大的切口以进行心房切开术，以便放血和灌注液流出。
      注意：应通过吸入异氟烷持续麻醉，直至确认心脏死亡。心脏死亡的确认依据是直接观察到心脏无搏动输出。
4. 使用由冷（4℃）灌注液组成的灌注液对仔猪进行灌注 含肝素（终浓度为每毫升5单位）的冰冷磷酸盐缓冲液（PBS），以每分钟300毫升的速度灌注5分钟，或直至流出液澄清为止。
   1. 灌注过程中需小心，防止灌注导管脱落。本步骤及所有其他灌注操作均应使用市售的蠕动泵。
5. 进行半颅切除术以移除大脑半球，用于新鲜组织分析。
   注意：本方案可用于获取一份新鲜的脑组织半球，另一份半球将进行固定。若无需新鲜组织，可跳过至步骤 2.6。
   1. 在此过程中，以每小时50 mL的速度持续灌注冰冷的PBS，以确保脑组织保持低温。
   2. 使用手术刀沿矢状缝全长从颅顶至枕骨大孔处做一纵行切口。操作过程中，施加稳固压力以在颅骨上划出刻痕。将头皮向两侧翻开，充分暴露整个颅骨。
   3. 使用咬骨钳，从枕骨大孔开始，将咬骨钳插入颅骨与硬脑膜之间，小心去除一侧颅骨，注意避免损伤下方的脑组织。分块去除骨片，用咬骨钳将其从脑实质上剥离。
   4. 颅骨去除后，用镊子和剪刀切开并移除硬脑膜，操作时需小心谨慎，避免损伤下方的脑组织。
   5. 将手术刀片置于两个半球之间，小心切断胼胝体。
   6. 使用镊子的宽柄等扁平工具，轻轻将额叶向后推，在从前向后的方向上逐步切断颅神经。在大脑半球最尾侧部位，用手术刀切断脊髓。取下该大脑半球 整块地
      注意：未固定的脑组织较为脆弱。在移除半脑时需小心操作，以防止破坏剩余半脑的血液供应。
   7. 切取移除的半脑组织。如有需要，立即在液氮冷却至-160 °C的2-甲基丁烷中速冻，以防止组织降解，并立即于-80 °C保存，用于后续分析。
      注意：我们建议使用切片矩阵以2 mm的间隔对脑组织进行冠状面切片，但具体的切片方案需根据特定的实验目标而定。
6. 更换灌注液为4%多聚甲醛（PFA），以每分钟300 mL的速度持续灌注PFA至少5分钟。
   警告！PFA 具有毒性，避免接触皮肤、眼睛或黏膜。切勿吸入 PFA 气体。
7. 由于肌肉中形成醛交联，幼猪尸体将出现僵硬。灌注多聚甲醛（PFA）完成后，以与步骤2.5.5所述相同的方式去除剩余的半脑。
   注意：灌注良好的脑组织应呈苍白色且完全去血。
   1. 将剩余的半脑放入含有新鲜4% PFA的小容器中，置于4 °C保存。在PFA中固定24-48小时以完成固定过程。
   2. 24–48 小时后，将固定的脑组织转移至含 0.1% 叠氮化钠的 PBS 溶液中，以防止过度固定。过度固定可能导致表位遮蔽或强烈的非特异性背景染色。添加叠氮化钠可抑制细菌生长。
      注意：组织可在 4 °C 下保存长达一个月。

3. 异氟烷（实验组）动物

注意：可使用任何麻醉剂或干预措施，但不建议使用地氟烷进行吸入诱导。

1. 麻醉的诱导与维持：
   1. 使用配备有儿科呼吸机和监测设备的临床麻醉工作站进行麻醉。
   2. 在24小时适应期后，通过面罩给予仔猪8%七氟烷（含100% O₂）以诱导麻醉。
   3. 在诱导期间及整个实验过程中，持续监测脉搏血氧饱和度、无创血压、心电图和体温。
   4. 麻醉诱导后，滴定七氟烷或异氟烷至适当浓度，以维持足够的麻醉深度，同时确保自主呼吸持续存在（通常浓度为3-4%）。
   5. 在耳缘静脉置入24 G外周静脉导管（图1）。
   6. 将仔猪置于仰卧位以进行气管插管（图2，面板A）。使用Miller #1或#1.5喉镜片以利于进入下咽部并完成气管插管。注意：喉镜检查过程中需有经验丰富的操作者和助手配合。
      1. 由助手使用干燥纱布牵拉动物舌头，以利于暴露喉部并清晰观察声门（图2B）。
         注意：仔猪会厌在形态上与人类相似（图2C）。由于仔猪声门位于喉口内数毫米深处，因此较难观察（图2D）。
      2. 抬起会厌：将喉镜片尖端置于会厌下方，并向上抬起镜片以暴露喉部。
      3. 在将导管插入气管前，喷洒0.5 mL的2%利多卡因于声门处，以防止气管插管过程中发生喉痉挛，因仔猪特别容易出现喉痉挛。
   7. 置入并固定带套囊的3.0 mm气管导管。
      1. 通过听诊器进行胸部听诊并结合呼气末二氧化碳（EtCO₂）监测，确认双侧呼吸音及稳定的呼气末二氧化碳波形。
      2. 将仔猪肺部充气至持续气道正压20 cm H₂O。随后向气管导管套囊充气，至刚好在20 cm H₂O压力下防止漏气所需的最小压力，同时在气管区域听诊以判断是否存在漏气。
         注意：此步骤至关重要，可预防间歇性正压通气期间黏膜缺血。
      3. 麻醉期间维持正常氧合与正常二氧化碳水平。
   8. 开始通过50%氧气/50%空气混合气体输送2%异氟烷。调节氧气浓度以维持PaO₂在90–100 mmHg之间。持续3小时（或根据实验设计所需时长）。
   9. 在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
2. 在开始使用2%异氟烷后，启动股动脉插管操作。
   1. 切皮前通过外周静脉通路给予广谱抗生素（头孢唑林，25 mg/kg）以预防手术部位感染。
   2. 使用有色氯己定对双侧腹股沟区域进行消毒，确保无菌操作区域，并覆盖适当的无菌巾（图3B）。 参与存活手术的人员至少应佩戴手术帽、口罩、无菌手套和眼部防护装置。
   3. 用食指和中指在腹股沟皱褶处触诊股动脉搏动。
   4. 使用手术刀做一长度约1.5 cm、头尾方向的浅表切口（图3C）。
   5. 使用钝性器械（如止血钳或钝头剪刀）在缝匠肌两头之间进行钝性分离（图3D）。
      注意：股血管神经束通常位于这两块肌肉之间并稍深于其下方（图4A）。
   6. 使用血管环或丝线结扎，在近端和远端分离并固定动脉。利用血管环将远端动脉牵拉至皮肤水平（图4B）。
   7. 在近端结扎线施加足够牵引力以阻断血流后，使用肌腱剪做一小切口进入动脉。
      1. 注意避免完全切断动脉，小切口即可满足要求。也可采用穿刺针-导丝法进入动脉（图4C）。
      2. 在近端结扎线施加轻柔牵引，可防止此阶段过程中大量失血。若采用穿刺针-导丝法，则将导丝（随套件提供或单独获取）经针芯送入动脉，深度达5 cm。
      3. 注意切勿过度推进导丝，以免引发心室异位搏动。若发生此情况，应立即将导丝回撤1–2 cm。
   8. 从血管中撤出穿刺针，注意保留导丝在血管内。沿导丝轻柔推送导管进入血管（图4D）。
      1. 股动脉插管使用3-French、8厘米长的导管。当导管尖端首次进入血管浅壁时，可感受到轻微阻力。
   9. 若采用切开动脉法，则直接将导管或聚乙烯导管推进入血管。应立即观察到回血。
   10. 立即连接导管至压力传感器，并用生理盐水冲洗导管以保持通畅。
       1. 缝合固定导管位置。用无菌纱布覆盖切口以防污染。可采用经皮途径进行股动脉插管。
          注意：确保超声操作由经验丰富的技术人员执行。
3. 术中条件与监测：
   1. 使用强制气流加温装置主动为仔猪保温，并持续监测直肠温度（图3A）。
   2. 输注含葡萄糖的等渗液体（5%葡萄糖林格乳酸盐溶液或生理盐水），输注速率为维持量（4 × 仔猪体重kg，mL/hr）。
   3. 监测生命体征是否出现异常（低血压、心律失常、低/高体温、缺氧）
      注意：正常生命体征范围及异常情况下的建议处理措施总结于表1中。
   4. 使用商用血气分析系统，在实验期间至少每小时测量一次动脉血气（动脉pH、pCO₂、pO₂）、电解质（碳酸氢根、碱剩余/缺失、钠、钾、离子钙）、血红蛋白和血糖。动脉血样本从股动脉导管中采集。
      注意：正常酸碱平衡和电解质数值以及异常时的纠正建议总结于表1中。
4. 在暴露于异氟烷3小时后，移除股动脉导管。
   1. 小心结扎近端血管丝线，永久闭塞股动脉以防止出血。也可使用血管夹替代。
   2. 在关闭切口前确认完全止血。用10–20 mL无菌生理盐水冲洗切口，以降低感染风险。
5. 实验结束后，使用3-0不可吸收缝线行间断单纯缝合关闭皮肤切口。
   1. 使用0.25%布比卡因加肾上腺素（1:200,000）按0.5–1 mL/kg剂量浸润伤口，以控制术后疼痛。切口表面涂抹无菌外科皮肤粘合剂。
      注意：无需包扎。
6. 停止麻醉，允许仔猪苏醒。
7. 当仔猪出现苏醒迹象（睁眼、试图站立、踢腿、张闭口动作），且血流动力学稳定、氧合充分、通气良好时，拔除气管导管。
8. 拔管后通过面罩提供辅助氧气，直至确认氧合和通气功能充分。
9. 皮下注射布托啡诺0.05 mg/kg以进一步控制疼痛。也可选用透皮芬太尼。
10. 适当时将仔猪送回其饲养笼。在仔猪恢复足够意识以维持胸卧位前不得无人看护。在仔猪完全从麻醉中恢复前，不得将其放回与其他动物共处的笼中。
    1. 使用加热灯主动为单独的饲养笼加温。
    2. 由经过培训的兽医或科研人员密切监测麻醉后的动物状态。提供仔猪代乳粉。
11. 根据实验目的，让仔猪恢复48–72小时。
    1. 根据有经验的动物护理人员判断，为控制术后不适，可按需每3小时皮下注射一次适当剂量的布比卡因，确保有效镇痛。
    2. 术后前6小时内每小时监测一次仔猪状态，之后每4小时监测一次。对实验组动物实施安乐死及组织取材的方式应与对照组动物完全一致，如上所述。

结果

研究共纳入四十只仔猪（18只异氟烷组，22只对照组）。所有动物均良好耐受研究操作。所有受试仔猪均为雄性。两组在年龄和体重方面均无显著差异（表2， 图5）。异氟烷组在实验期间的平均实验室检测值如下所示 表3这些数值表明，该实验方案具有内部一致性和可重复性，因为在两年期间有多名技术人员完成了手术操作。然而，这些数据未反映出的是，我们在手术过程中为维持生理止血状态所进行的大量调整与修正。CO₂ 保留、低核心体温和低血糖是我们在必要时通过全面监测和调整所避免的众多混杂因素。

图1：外周静脉导管的放置。 将24 G静脉导管插入耳缘静脉。 请点击此处查看此图的放大版本。

图2：仔猪插管操作的事件顺序。 （A）将仔猪置于侧卧位进行插管，并连接标准监护设备。（B）助手将舌头从口腔中移开，同时喉镜操作者进行喉镜检查。（C）仔猪的会厌在形态上与人类相似。在此图示中，喉镜片尖端位于会厌谷。（D）猪的喉部解剖结构与人类明显不同；其声带位于喉口下方数毫米处。在此图示中，喉镜片尖端已将会厌推开，暴露出喉部。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：股动脉入路。（A）使用强制空气加温装置维持动物体温。整个手术过程中进行监测。用有色氯己定制备广泛的无菌术野，并用带窗无菌洞巾覆盖动物。（B）在腹股沟皱襞处触诊可触及股动脉搏动。（C）在股动脉搏动部位上方，做一长约1.5 cm、大致垂直于腹股沟皱襞的头尾方向皮肤切口。（D）钝性分离以暴露股神经血管束。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：股动脉插管。（A）从外侧到内侧，血管神经束包含股神经、股动脉和股静脉。（B）使用血管环和/或缝线分离股动脉。在穿刺动脉时，对近端结扎线持续施加张力，以防止大量失血（可见血管变白）。（C）使用针头穿刺股动脉，避免刺破动脉后壁。当回血出现时，将导丝经由针头送入动脉内。（D）撤出针头，沿导丝将导管推进至 股动脉中。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：对照组与异氟烷处理组仔猪平均体重与年龄的比较。 误差线表示 ±1 个标准差，每个误差线上方标注了相应的标准差数值。

表1：仔猪正常生命体征、动脉血气和血清电解质值汇总及建议校正方法。 请点击此处查看该表格的放大版本。

表2：对照组平均体重与年龄汇总 与 异氟烷处理的仔猪 采用非配对双尾T检验进行分析，结果显示两组之间无显著差异。 请点击此处查看此表格的放大版本。

表 3：异氟烷处理动物的平均生命体征和实验室检测值。在手术过程中，一旦生命体征和实验室检测值偏离正常范围，将立即予以纠正。请点击此处查看此表格的放大版本。

讨论

关键实验步骤/故障排除

实验开始时，应在诱导麻醉的同时启动无创生命体征的监测。血压、心率、血氧饱和度和直肠温度均可方便地获取并持续监测。仔猪应置于空气加温装置下，以维持足够的核心体温，因为这些动物在全身麻醉下容易迅速出现低体温。及时放置外周静脉导管，可在诱导过程中发生紧急情况时及时进行治疗。在整个异氟烷操作及安乐死过程中，必须对仔猪进行持续的无创或有创监测。在实验方案的多个步骤中，尤其是气道管理和插管期间，仔猪可能迅速出现动脉血氧去饱和。我们采用8%七氟烷进行麻醉诱导，以模拟人类儿科临床实践并加快诱导速度。然而，5%异氟烷也已被成功使用，同样适用。由于解剖结构的差异以及易发生喉痉挛的倾向，仔猪插管可能较为困难。若仔猪在诱导和/或气道管理期间开始出现去饱和，应立即通过面罩给予100%氧气和七氟烷，以恢复安全的血氧饱和度水平并达到足够的麻醉深度。需注意，麻醉深度必须足以完成插管，但过度麻醉可能导致呼吸暂停。必须持续密切监测动物的通气和氧合状态，并据此调整吸入麻醉药的浓度。待氧合恢复且达到适当麻醉深度后，可再次尝试插管。可通过面罩尝试正压通气，但通常难以成功。若发生喉痉挛，应直接将利多卡因溶液应用于声带，以利于气管插管。

急救药物应始终备好，并在方案的关键阶段根据需要及时使用，以纠正生理紊乱。尽管本文不详细讨论仔猪麻醉和急救药物的使用，Swindle的 "实验室中的猪：手术、麻醉、影像学与实验技术" 是一个极佳的资源。²⁷

类似地，在正中胸骨切开术打开胸腔后，仔猪在处死过程中可能会迅速出现血氧饱和度下降。操作者应迅速而安全地暴露心脏并插入套管针，以开始冷磷酸盐缓冲液（PBS）灌注。需要进行彻底的冷PBS灌注（如适用，随后快速用PFA固定），以防止脑组织发生缺血性损伤。

仔猪插管后，开始监测呼吸频率和呼气末二氧化碳（表1）。通过调整呼吸机支持参数，在维持充分麻醉的同时，稳定仔猪的呼气末氧合和通气状态。我们采用机械通气，尽可能模拟人类临床所用方式。应避免高氧血症，以尽量减少氧化应激的发生风险。

异氟烷麻醉的仔猪需进行股动脉插管，原因有二：持续监测动脉血压，以及在手术过程中定期采集动脉血样以评估酸碱状态、血气和电解质水平。股动脉插管操作可能具有挑战性，具体细节请参见视频。对于需存活的实验，该操作应在无菌手术环境中以无菌条件进行。完成股动脉插管后，应开始每小时监测一次动脉血气和血清电解质水平，并根据需要进行纠正以维持内环境稳定（表1）。仔猪应持续输注含葡萄糖的等渗液体，以维持足够的血糖水平。在整个实验过程中，应持续监测动物体温是否正常，并根据需要提供暖风保温。必须同时避免低体温和高体温的发生。

虽然该方案仅提供一侧半球 "新鲜" 大脑及一侧固定的神经组织，该方案可轻松调整以适应其他研究设计。此外，也可从仔猪采集其他样本。脑脊液（CSF）可在仔猪麻醉后获取，可选择在或不在荧光透视引导下进行。在实验流程的不同阶段，还可从仔猪采集血液样本，包括通过股动脉导管，或在灌注前经由血管导管直接从左心室取血。恢复期也可根据需要延长或缩短，以分别研究慢性或急性反应。

技术的局限性

该方案和技术具有较高的操作难度，尤其对于需要存活的实验，必须由技术熟练的研究人员在设备齐全的手术室内进行。研究人员（在方案的某些步骤中还需助手）必须熟练掌握本方案中的外科手术和麻醉操作，这可能需要经过专门培训和积累相关经验才能掌握。其他局限性还包括与啮齿类动物模型相比，仔猪模型的成本较高；不过，与非人灵长类动物相比，仔猪模型的成本要低得多。仔猪的价格会因地区和来源养殖场的不同而有所差异，但通常每只动物的成本预计低于500美元，而非人灵长类动物每只则可能高达数千美元。根据我们的经验，每只动物的平均成本通常约为200美元。

最后，由于仔猪模型的目的是模拟发育中的人类大脑，因此应仅使用新生仔猪。中枢神经系统在快速生长期最为脆弱，而在仔猪中，这一时期从出生前六周持续至出生后五周⁸。使用年龄较大、距离分娩日期较远的仔猪，可能会削弱仔猪模型的临床相关性。尽管关于仔猪大脑发育与人类新生儿大脑发育的"等效性"仍存在显著争议，但在比较人类与猪的早期出生后大脑发育时，两者表现出显著的相似性。出生时，人类和猪的大脑重量分别为成年时的27%和25%¹⁴。根据Johnson及其同事的研究，我们可以推断，仔猪的一周大约相当于人类的一个月⁹。这些基于全脑体积数据得出的结果已被Workman及其同事的研究证实²⁸。我们选择7至14日龄的仔猪，以近似于1至2月龄的人类。然而，如果实验目标是模拟仔猪大脑生长突增的高峰期，则使用更年轻的动物（1至5日龄）可能是更合适的选择。这是可行的，因为仔猪可以在出生时即断奶。随着人类与猪出生后大脑发育之间对应关系的新数据不断出现，我们对仔猪模型的使用也将相应调整。

该技术相对于其他/现有方法的重要性

仔猪与人类新生儿具有显著的相似性，包括大脑发育和病理生理反应的关键平行特征。因此，它是一种具有临床相关性的哺乳动物模型，概念验证研究也表明，仔猪是研究麻醉药物神经毒性的一个合适模型^29,30。该模型还可轻松适用于其他类型的发育神经科学研究。该模型的设计具有科学权威性，旨在探究麻醉诱导的神经发育损伤（AIDN）的程度和机制，同时最大限度地减少诸如缺氧或高碳酸血症等混杂因素引起神经系统损伤而被误判为麻醉所致的风险。为实现这一目标，仔猪接受与儿科患者相同的围手术期外科处理、麻醉条件及监测措施。

掌握该技术后的未来方向与应用

接下来，仔猪也非常适合进行神经认知测试¹⁷这一特性将有助于在未来实验中对麻醉暴露后的神经认知结局进行复杂而全面的评估。还应强调的是，在临床环境中，儿童通常因生理压力较大的手术操作而接受麻醉。麻醉与术后炎症之间的相互作用，以及由此导致的神经元损伤和/或毒性（在啮齿类和灵长类动物中已观察到）值得进一步探索和高度重视。新生仔猪为研究麻醉药物对发育中大脑的影响提供了一个独特且具有临床相关性的基础模型，该模型避免了手术带来的混杂影响（模拟儿童常见的临床情况）。不同类型手术或其他混杂因素（如缺血、脑损伤、遗传易感性）的影响， 等等。现在可以使用该模型可靠地检测）。

在实验室中，我们计划采用多种电生理和电化学方法，进一步研究完整神经回路中麻醉和麻醉诱导神经毒性（AIDN）的作用机制。这些技术包括神经递质活性的体内检测、全细胞膜片钳记录、神经成像以及脑片中的神经生理学研究。在未成熟大脑的神经科学研究方面，与小鼠模型相比，仔猪与人类的相似度更高，且相较于非人灵长类动物，其应用缺陷极少。随着进一步发展，仔猪可能成为人类发育神经科学研究的理想模型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
液相断奶饲料（Liqui-Wean）	牛奶特制品公司（Milk Specialities）	454836
仔猪麻醉面罩锥形接口	VetEquip 公司	921428
Masterflex L/S 蠕动泵	Cole-Parmer 公司	EW-77916-20	可使用其他型号的蠕动泵，只要能够实现稳定且充足的灌注速率即可
Masterflex L/S 泵用管路，25 英尺	Cole-Parmer 公司	EW-96410-24
14 G 血管导管	贝克顿-迪金森公司（Becton-Dickson）	381164
10x PBS	赛默飞世尔科技公司（Thermo-Fisher Scientific）
多聚甲醛粉末	Sigma-Aldrich 公司	P6148-5KG	本实验室从粉末自行配制该试剂，因其成本效益更高。也可直接购买已配制好的多聚甲醛溶液。
2-甲基丁烷	Sigma-Aldrich 公司	M32631-4L
持针器	泰利福公司（Teleflex）	152720
直角钳	泰利福公司（Teleflex）	496217
咬骨钳	泰利福公司（Teleflex）	028120
肌腱剪	泰利福公司（Teleflex）	423480
缝线剪	泰利福公司（Teleflex）	423440
麦克弗森打结钳	泰利福公司（Teleflex）	425200
艾德森组织镊	泰利福公司（Teleflex）	181223
3-0 尼龙缝线	Medline 公司	ETH627H
Integra SL 麻醉工作站	DRE Veterinary 公司	2350	选择该麻醉工作站是为了尽可能模拟儿科患者在手术室中所接受的临床监护。任何麻醉机均可使用，只要其具备足够的生理监测与干预能力。
喉镜手柄	泰利福公司（Teleflex）	8710000
Miller 1 型喉镜片	泰利福公司（Teleflex）	2216100
Bair Hugger 加温系统	3M 公司	750
Bair Hugger 躯干保温毯	3M 公司	540
iStat 便携式分析仪	雅培即时检测公司（Abbott Point of Care）	300	可使用其他型号的即时动脉血气分析设备
iStat 检测卡	雅培即时检测公司（Abbott Point of Care）	CG8+
Dermabond Advanced 外用皮肤粘合剂	爱惜康公司（Ethicon）	DNX6
LMA 喉气管喷雾装置	泰利福公司（Teleflex）	MAD720	也可使用浸有局部麻醉药的棉签
Sheridan CF 3.0 带气囊气管插管	泰利福公司（Teleflex）	5-10106	选择该型号气管插管是因为其带有墨菲孔，这对于防止实验过程中气管插管堵塞至关重要
儿科插管导丝	史密斯医疗公司（Smiths Medical）	100/120/100
24 G 血管导管	贝克顿-迪金森公司（Becton-Dickson）	381112
#10 一次性手术刀	Ted Pella, Inc 公司	549-9-10
动脉压监测套件 （3 法规，8 cm 导管）	库克医疗公司（Cook Medical）	C-PMSY-300-FA	也可使用带鲁尔锁接头的普通聚乙烯管路
Intramedic PE90 聚乙烯管	费希尔科技公司（Fisher Scientific）	14-170-12D
Monoject 钝头套管针	VWR 国际公司（VWR International）	15141-144