方法文章

人多能干细胞对原始和最终造血祖细胞定向分化的研究

DOI：

10.3791/55196

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2017年11月1日

 , 
1Department of Internal Medicine, Hematology Division, Washington University in St. Louis

本文内容

摘要

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在这里, 我们提出了人类多能干细胞 (hPSC) 的文化协议, 用于区分 hPSCs 成 CD34 的+造血祖细胞。此方法使用特定于阶段的规范 WNT 信号的操作来指定单元格完全是最终的或原始的造血程序。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

再生医学的主要目标之一是从人类多能干细胞 (hPSCs) 中产生和维持造血干细胞 (干细胞)。直到最近, 将 hPSCs 分化为干细胞的努力主要产生了缺乏 HSC 潜能的造血祖细胞, 而不是像卵黄囊造血。这些产生的造血祖细胞可能有有限的效用, 为体外疾病模型的各种成人造血疾病, 特别是那些淋巴谱系。然而, 我们最近描述的方法产生赤-骨髓淋巴多向确定造血祖细胞的 hPSCs 使用一个阶段特定的定向分化协议, 我们在这里概述。通过在基底膜 plasticware 上 hPSCs 酶解离, 形成了胚体 (EBs)。EBs 被区分对胚层由重组 BMP4, 随后被指定到明确的造血程序由 GSK3β抑制剂, CHIR99021。另外, 原始的造血是由 PORCN 抑制剂, IWP2 指定的。造血是进一步推动通过增加重组 VEGF 和支持造血细胞因子。使用这种方法产生的造血祖细胞有可能用于疾病和发育模型,体外。

引言

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人类多能干细胞 (hPSCs) 被定义为包括人类胚胎干细胞 (干细胞) 和人类诱导多能干细胞 (hiPSCs), 并具有独特的能力, 不仅在适当的生长条件下进行自我更新,而且, 可以区分为从三种细菌层派生的所有单元类型: 内胚层、胚层和外胚层1。由于这些独特的能力, hPSCs 的再生医学, 疾病建模和细胞疗法的巨大希望2。虽然多个细胞类型已成功地区分了 hPSCs, 一个重要的挑战是体外规范的完全成人样 hPSC 衍生造血干细胞 (干细胞) 和最终造血祖细胞。

一个可能的障碍, 发展的人类干细胞从 hPSCs 是存在的多个造血程序在人类胚胎的3。第一个程序出现, 称为 "原始造血", 起源于外卵黄囊组织内, 最主要的特点是其瞬态生产的 erythroblast 祖 (EryP-氟氯化碳), 巨噬细胞, 和巨。值得注意的是, 这个程序并没有引起干细胞, 也没有引起 T 和 B 淋巴祖细胞。然而, 卵黄囊确实瞬时产生限制性的造血祖细胞, 如赤髓祖 (EMP4,5,6,7

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方案

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1. 试剂

  1. 获取单元格线; 干细胞或 hiPSCs 1 、小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs) 29 、OP9-DL4 基质 30 、 31 .
  2. 试剂准备
    1. 在 PBS 中准备一个0.1% 瓦特/v 的明胶溶液。4、#176 灭菌, aliquoting 后进行消毒;
      1. 准备明胶涂层 plasticware。外套 6-1.5 毫升的0.1% 明胶溶液的菜肴。室温孵育15分钟。使用前应立即抽出残留明胶溶液.
    2. 通过使 IMDM 与15% 伏/v FBS 和1x 和 #160; 抗生素来准备 MEF 介质。补充2毫米 l-谷氨酰胺和400和 #181; M monothioglycerol (MTG) 之前使用和存储在4和 #176; C.
    3. 准备 hPSC 培养基作为 DMEM/F12 20% v/v 淘汰赛血清置换 (KOSR) 的解决方案, 1x、#160; 非必需氨基酸 (NEAA)、1x 和 #160; 抗生素、55、#181; M 和 #946;-基、2毫米-l-谷氨酰胺和 10 ng/毫升 bFGF。过滤器用2....

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结果

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在图 1中说明了从 hPSCs 中归纳出原始和最终造血祖细胞的示意图。胚层模式的规范 WNT 信号发生在 2-3 的差异, 其次是造血祖规范。

有代表性的流动细胞分析和菌落形成纤维素测定 hPSC 衍生的造血分化培养物, 如图 2所示。IWP2-treated 分化文化将产生一个独特的 CD34+CD43−和 CD34低/−CD43+的人口, 而奇尔处理的差异文化将有和 #60; 1% CD43+ 8 天的单元格差异 (图 2A, B)26。在 IWP2 条件下分离.......

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讨论

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本议定书描述一个快速, 无血清, 无基质的方法分化的原始或最终造血祖细胞。胚层规范的原始或最终造血祖可以可靠地实现使用我们的协议, 这唯一的利用小分子抑制剂的规范 WNT 信号。阶段特异的 WNT 激活由 GSK3β抑制剂 CHIR9902133产生最终的造血胚层, 而 WNT 抑制剂 PORCN 抑制的 IWP234指定原始的造血胚层26。值得注意的是, 这种方法并不会产生 engraftable 的 HSC 样的种群 (没有显示)。然而, 用这种方法生成的最终造血祖细胞可被转基因诱导的植入电位35, 突显其在未来的平移应用中的潜能。

成功 hPSC 分化的一个关键决定因素是从 hPSCs 中形成的 EBs 的初始大小。理想情况下, EBs 应该是大约 6-10 细胞大小。差异文化可以 aberrantly 指定两个程序的混合物, 如果 EBs 是太大, 可能由于不适当的信号激活在 EB 之.......

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披露

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作者声明他们没有竞争的金融利益。

致谢

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这项工作得到了美国华盛顿大学医学院血液科内科医学院的支持。T32HL007088 来自国家心脏、肺脏和血液研究所的支持。CMS 得到了美国血液学学者奖的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Iscove 改良型 Dulbecco 培养基 （IMD）康宁10-016
胎牛血清 （FBS），ES 细胞分级双子座生物制品100-500
胎牛血清 （FBS）HycloneSH30396.03
L-谷氨酰胺，200 mM 溶液Life Technologies25030-081
青霉素-链霉素Life技术15070-063
0.25% 胰蛋白酶-EDTALife Technologies25200056
0.05% 胰蛋白酶-EDTALife Technologies25300054
明胶，猪皮，A 型Sigma-AldrichG1890
Alpha-MEMLife Technologies12000-022
DMEM-F12康宁10-092-CV
基因敲除血清替代物Life Technologies10828028"KOSR"
非必需氨基酸 （NEAA）Life Technologies11140050
β-巯基乙醇，55 mM 溶液Life Technologies21985023
盐酸Sigma-AldrichH1758
馏分 V，牛血清白蛋白Fisher科学BP1605
Ham's F12康宁10-080
N2 补充剂Life Technologies17502048
B27 补充剂，不含维生素A Life Technologies12587010
Stempro-34 （SP34）LifeTechnologies10639011"SP34"
生长因子减少基质胶康宁354230"MAT"
L-吸收酸Sigma-AldrichA4403
人血清转铁蛋白Sigma-Aldrich10652202001
单硫甘油 （MTG）Sigma-AldrichM6145
胶原酶 B 罗氏11088831001
胶原酶 IILife Technologies17101015
DNaseI钙生化学260913
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）Life Technologies14190144
bFGFR&D Systems233-FB
BMP4研发D Systems314-BP
激活素 AR&D Systems338-AC
VEGFR&D Systems293-VE
SCF研发D Systems255-SC
IGF-1研发D Systems291-G1
IL-3研发D Systems203-IL
IL-6R&D Systems206-IL
IL-7R&D Systems207-IL
IL-11R&D Systems218-1L
TPO研发D Systems288-TP
EPOPeprotech100-64
Flt-3 配体 （FLT3-L）R&D Systems308-FK
CHIR99021Tocris4423
IWP2Tocris3533
血管紧张素 IISigma-AldrichA9525
氯沙坦钾Tocris3798
CD4 PerCP Cy5.5 克隆 RPA-T4BD Biosciences560650稀释度 1：100;T 细胞测定
CD8 PE 克隆 RPA-T8BD Biosciences561950稀释度 1：10;T 细胞测定
CD34 APC 克隆 8G12BD Biosciences340441稀释度 1：100;EHT 测定
CD34 PE-Cy7 克隆 8G12BD Biosciences348801稀释度 1：100;造血内皮
CD43 FITC 克隆 1G10BD Biosciences555475稀释度 1：10;造血内皮
CD45 APC-Cy7 克隆 2D1BD Biosciences557833稀释度 1：50;T 细胞测定
CD45 eFluor450 克隆 2D1BD Biosciences642284稀释度 1：50;EHT 测定
CD56 APC 克隆 B159BD Biosciences555518稀释度 1：20;T 细胞测定
CD73 PE 克隆 AD2BD Biosciences550257稀释度 1：50;造血内皮
CD184 APC 克隆 12G5BD Biosciences555976稀释度 1：50;造血内皮
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI）BD Biosciences564907稀释度 1：10,000;T 细胞测定
OP9 DL4 细胞Holmes， R. 和 JC Zuniga-Pflucker。冷泉港协议，2009 年。2009（2）： p. pdb prot5156
MethoCult H4034Stemcell Technologies4034"MeC"
Milli-Q 水净化系统EMD Millipore
5% CO2 培养箱设置在 37°C
多气体培养箱设置在 37°C，5% CO2,5% O2
6 孔组织培养板康宁353046
24 孔组织培养板康宁353226
6 孔低粘附组织培养板康宁3471
24 孔低粘附组织培养板康宁3473
35 mm 组织培养皿康宁353001
平头针头，16 号康宁305198
3 cc 注射器康宁309657
5 mL 聚丙烯试管康宁352063
5 mL 聚苯乙烯试管康宁352058
15 mL 聚丙烯锥形康宁430791
50 mL 聚丙烯锥形管康宁430921
2 mL 血清移液管康宁357507
5 mL 血清移液Corning4487
10 mL 血清移液Corning4488
25 mL 血清移液Corning4489
细胞刮刀Corning353085
2.0 mL 冻存管Corning430488
5 mL 试管，含 40 &微量;M 细胞过滤器Corning352235
40 µM 细胞过滤器康宁352340
细胞培养离心机
生物安全通风橱
FACS AriaII 或同等产品
LSRii 或同等产品
FlowJo 软件TreeStar
水浴37°C 设置
0.22 和微量;M 过滤系统康宁
高压灭菌
4 C 冰箱
-20 C 冷冻机
-80 C 冷冻机
管 管 管 管 器

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic developme....

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GSK3 PORCN VEGF FACS

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