从人多能干细胞定向分化原始和确定型造血祖细胞

摘要

本文介绍了人类多能干细胞（hPSC）的培养方案，用于将hPSC分化为CD34⁺造血祖细胞。该方法通过阶段特异性调控经典WNT信号通路，使细胞特异性地定向分化为确定型或原始型造血程序。

摘要

再生医学的主要目标之一是生成并维持由人多能干细胞（hPSCs）衍生的造血干细胞（HSCs）。直到最近，将hPSCs分化为HSCs的努力主要产生的是缺乏HSC潜能的造血祖细胞，其特征更类似于卵黄囊造血。 这些获得的造血祖细胞可能具有有限的应用价值 体外 用于建模多种成人造血系统疾病，特别是淋巴系疾病。然而，我们近期已描述了一种基于阶段特异性定向分化方案，从人多能干细胞（hPSCs）生成红-髓-淋巴多系确定性造血祖细胞的方法，本文将概述该方法。通过将hPSCs在包被有基底膜基质的塑料器皿上进行酶解离，形成拟胚体（embryoid bodies, EBs）。EBs在重组BMP4作用下分化为中胚层，随后由GSK3β抑制剂CHIR99021诱导进入确定性造血程序。 alternatively，原始造血可通过PORCN抑制剂IWP2诱导。通过添加重组VEGF及支持性造血细胞因子进一步促进造血过程。利用该方法获得的造血祖细胞具有用于疾病建模和发育研究的潜力， 体外.

引言

人类多能干细胞（hPSCs）包括人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导多能干细胞（hiPSCs），在适当的生长条件下不仅具有自我更新的能力，还能够分化为起源于三个胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的所有细胞类型¹由于这些独特的能力，人多能干细胞在再生医学、疾病建模和细胞治疗方面具有广阔的应用前景²尽管已成功从人多能干细胞（hPSCs）分化出多种细胞类型，但一个重大挑战是 体外 特异性生成具有成体特征的人多能干细胞来源的造血干细胞（HSCs）及定型造血祖细胞。

从人多能干细胞（hPSCs）发育出人造血干细胞（HSCs）的一个可能障碍，是人类胚胎内存在多种造血程序³。最早出现的程序被称为"原始造血"，起源于胚外卵黄囊组织，其特征主要表现为短暂产生红系爆发形成单位前体细胞（EryP-CFC）、巨噬细胞和巨核细胞。值得注意的是，该程序不会产生HSCs，也不会产生T细胞和B细胞淋巴系前体细胞。然而，卵黄囊会短暂地产生一些受限的确定型造血前体细胞，例如红髓系前体细胞（EMP^4,5,6,

方案

1. 试剂

1. 获取细胞系：hESC 或 hiPSC¹、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）²⁹、OP9-DL4 基质细胞^30,31。
2. 试剂准备
   1. 配制 0.1% w/v 的明胶 PBS 溶液。经高压灭菌后分装，4 °C 保存。
      1. 准备明胶包被的塑料器皿。用 1.5 mL 0.1% 明胶溶液包被 6 孔板，室温孵育 15 分钟。使用前立即吸除残留的明胶溶液。
   2. 配制 MEF 培养基：将 IMDM 与 15% v/v FBS 和 1x 抗生素混合。使用前补充 2 mM L-谷氨酰胺和 400 µM 巯基甘油（MTG），4 °C 保存。
   3. 配制 hPSC 培养基：将 DMEM/F12 与 20% v/v 去除血清替代物（KOSR）、1x 非必需氨基酸（NEAA）、1x 抗生素、55 µM β-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺和 10 ng/mL bFGF 混合。用 2 µm 滤器过滤除菌，避光保存于 4 °C。
   4. 配制无血清洗涤培养基（Wash media）：将 DMEM/F12 与 5% v....

结果

图 1 示意性地展示了从人多能干细胞（hPSCs）诱导原始型和确定型造血祖细胞的过程。在分化第2至第3天期间，经典WNT信号通路介导中胚层的模式形成，随后发生造血祖细胞的特化。

代表性的人多能干细胞分化造血细胞培养物的流式细胞术分析及甲基纤维素集落形成实验结果如图所示 图2IWP2处理的分化培养将产生一种独特的CD34⁺CD43⁻ 和 CD34^低/−CD43⁺ 群体，而经CHIR处理的分化培养物将具有 <1% CD43⁺ 分化第8天的细胞（图 2A，B)²⁶在.......

讨论

本方案描述了一种快速、无血清、无基质细胞的分化方法，可用于生成原始型或定型造血祖细胞。利用本方案可稳定实现原始型或定型造血祖细胞的中胚层特化，其独特之处在于使用了经典WNT信号通路的小分子抑制剂。通过GSK3β抑制剂CHIR99021³³进行阶段特异性WNT激活，可诱导生成定型造血中胚层；而使用PORCN抑制剂IWP2³⁴抑制WNT信号，则可指定生成原始造血中胚层²⁶。值得注意的是，该方法尚不能有效产生具有移植能力的类造血干细胞群体（未展示）。然而，采用此方法获得的定型造血祖细胞可通过转基因手段赋予其移植潜能³⁵，显示出其在未来转化应用中的潜力。

成功进行hPSC分化的关键因素之一是hPSC形成的拟胚体（EB）的初始大小。理想情况下，EB应由约6至10个细胞组成。如果EB过大，分化培养物可能会异常地同时启动多种分化程序，这可能是由于EB内部信号激活不恰当所致。应在分化开始后的前24小时内对分化.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
伊氏改良杜尔贝科培养基（IMD）	Corning	10-016
胎牛血清（FBS），胚胎干细胞级别	Gemini Bioproducts	100-500
胎牛血清（FBS）	Hyclone	SH30396.03
L-谷氨酰胺，200 mM 溶液	Life Technologies	25030-081
青霉素-链霉素	Life Technologies	15070-063
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	25200056
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	25300054
明胶，猪皮来源，A型	Sigma-Aldrich	G1890
α-最低必需培养基（Alpha-MEM）	Life Technologies	12000-022
DMEM-F12 培养基	Corning	10-092-CV
无血清替代物（Knock-out serum replacement）	Life Technologies	10828028	"KOSR"
非必需氨基酸（NEAA）	Life Technologies	11140050
β-巯基乙醇，55 mM 溶液	Life Technologies	21985023
盐酸	Sigma-Aldrich	H1758
牛血清白蛋白，V组分	Fisher Scientific	BP1605
Ham's F12 培养基	Corning	10-080
N2 添加剂	Life Technologies	17502048
B27 添加剂，不含维生素A	Life Technologies	12587010
Stempro-34（SP34）	Life Technologies	10639011	"SP34"
生长因子减量基底膜基质（Matrigel）	Corning	354230	"MAT"
L-抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A4403
人血清转铁蛋白	Sigma-Aldrich	10652202001
单硫代甘油（MTG）	Sigma-Aldrich	M6145
胶原酶B	Roche	11088831001
胶原酶II	Life Technologies	17101015
DNaseI	Calbiochem	260913
磷酸盐缓冲液（PBS）	Life Technologies	14190144
bFGF	R&D Systems	233-FB
BMP4	R&D Systems	314-BP
激活素A（Activin A）	R&D Systems	338-AC
VEGF	R&D Systems	293-VE
SCF	R&D Systems	255-SC
IGF-1	R&D Systems	291-G1
IL-3	R&D Systems	203-IL
IL-6	R&D Systems	206-IL
IL-7	R&D Systems	207-IL
IL-11	R&D Systems	218-1L
TPO	R&D Systems	288-TP
EPO	Peprotech	100-64
Flt-3 配体（FLT3-L）	R&D Systems	308-FK
CHIR99021	Tocris	4423
IWP2	Tocris	3533
血管紧张素II	Sigma-Aldrich	A9525
氯沙坦钾	Tocris	3798
CD4 PerCP Cy5.5 单克隆抗体 RPA-T4	BD Biosciences	560650	稀释比例 1:100；T细胞检测
CD8 PE 单克隆抗体 RPA-T8	BD Biosciences	561950	稀释比例 1:10；T细胞检测
CD34 APC 单克隆抗体 8G12	BD Biosciences	340441	稀释比例 1:100；EHT检测
CD34 PE-Cy7 单克隆抗体 8G12	BD Biosciences	348801	稀释比例 1:100；造血内皮细胞检测
CD43 FITC 单克隆抗体 1G10	BD Biosciences	555475	稀释比例 1:10；造血内皮细胞检测
CD45 APC-Cy7 单克隆抗体 2D1	BD Biosciences	557833	稀释比例 1:50；T细胞检测
CD45 eFluor450 单克隆抗体 2D1	BD Biosciences	642284	稀释比例 1:50；EHT检测
CD56 APC 单克隆抗体 B159	BD Biosciences	555518	稀释比例 1:20；T细胞检测
CD73 PE 单克隆抗体 AD2	BD Biosciences	550257	稀释比例 1:50；造血内皮细胞检测
CD184 APC 单克隆抗体 12G5	BD Biosciences	555976	稀释比例 1:50；造血内皮细胞检测
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	BD Biosciences	564907	稀释比例 1:10,000；T细胞检测
OP9 DL4 细胞			Holmes, R. 和 J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034	Stemcell Technologies	4034	"MeC"
Milli-Q 水纯化系统	EMD Millipore
5% CO2 培养箱			设定温度为 37 °C
多气体培养箱			设定温度为 37 °C，5% CO2，5% O2
6 孔组织培养板	Corning	353046
24 孔组织培养板	Corning	353226
6 孔低黏附组织培养板	Corning	3471
24 孔低黏附组织培养板	Corning	3473
35 mm 组织培养皿	Corning	353001
钝头针，16 号	Corning	305198
3 cc 注射器	Corning	309657
5 mL 聚丙烯试管	Corning	352063
5 mL 聚苯乙烯试管	Corning	352058
15 mL 聚丙烯锥形离心管	Corning	430791
50 mL 聚丙烯锥形离心管	Corning	430921
2 mL 血清移液管	Corning	357507
5 mL 血清移液管	Corning	4487
10 mL 血清移液管	Corning	4488
25 mL 血清移液管	Corning	4489
细胞刮刀	Corning	353085
2.0 mL 冻存管	Corning	430488
5 mL 试管配 40 µm 细胞筛	Corning	352235
40 µm 细胞筛	Corning	352340
细胞培养离心机
生物安全柜
FACS AriaII 或同等设备
LSRii 或同等设备
FlowJo 软件	TreeStar
水浴锅			设定温度为 37 °C
0.22 µm 过滤系统	Corning
高压灭菌器
4 °C 冰箱
-20 °C 冰柜
-80 °C 冰柜