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方法文章

从人多能干细胞定向分化原始和确定型造血祖细胞

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DOI：

10.3791/55196

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2017年11月1日

 , 
1Department of Internal Medicine, Hematology Division, Washington University in St. Louis

本文内容

摘要

本文介绍了人类多能干细胞（hPSC）的培养方案，用于将hPSC分化为CD34+造血祖细胞。该方法通过阶段特异性调控经典WNT信号通路，使细胞特异性地定向分化为确定型或原始型造血程序。

摘要

再生医学的主要目标之一是生成并维持由人多能干细胞（hPSCs）衍生的造血干细胞（HSCs）。直到最近，将hPSCs分化为HSCs的努力主要产生的是缺乏HSC潜能的造血祖细胞，其特征更类似于卵黄囊造血。 这些获得的造血祖细胞可能具有有限的应用价值 体外 用于建模多种成人造血系统疾病，特别是淋巴系疾病。然而，我们近期已描述了一种基于阶段特异性定向分化方案，从人多能干细胞（hPSCs）生成红-髓-淋巴多系确定性造血祖细胞的方法，本文将概述该方法。通过将hPSCs在包被有基底膜基质的塑料器皿上进行酶解离，形成拟胚体（embryoid bodies, EBs）。EBs在重组BMP4作用下分化为中胚层，随后由GSK3β抑制剂CHIR99021诱导进入确定性造血程序。 alternatively，原始造血可通过PORCN抑制剂IWP2诱导。通过添加重组VEGF及支持性造血细胞因子进一步促进造血过程。利用该方法获得的造血祖细胞具有用于疾病建模和发育研究的潜力， 体外.

引言

人类多能干细胞（hPSCs）包括人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导多能干细胞（hiPSCs），在适当的生长条件下不仅具有自我更新的能力，还能够分化为起源于三个胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的所有细胞类型1由于这些独特的能力，人多能干细胞在再生医学、疾病建模和细胞治疗方面具有广阔的应用前景2尽管已成功从人多能干细胞（hPSCs）分化出多种细胞类型，但一个重大挑战是 体外 特异性生成具有成体特征的人多能干细胞来源的造血干细胞（HSCs）及定型造血祖细胞。

从人多能干细胞（hPSCs）发育出人造血干细胞（HSCs）的一个可能障碍，是人类胚胎内存在多种造血程序3。最早出现的程序被称为"原始造血"，起源于胚外卵黄囊组织，其特征主要表现为短暂产生红系爆发形成单位前体细胞（EryP-CFC）、巨噬细胞和巨核细胞。值得注意的是，该程序不会产生HSCs，也不会产生T细胞和B细胞淋巴系前体细胞。然而，卵黄囊会短暂地产生一些受限的确定型造血前体细胞，例如红髓系前体细胞（EMP4,5,6,7,8）以及红系缺陷型淋巴系倾向多能前体细胞（LMPP9）。然而，无论是EMP还是LMPP都不具备完全的多向分化潜能，也无法在成年受体中实现类似HSC的植入能力。相比之下，在发育后期，经典的"确定型"造血程序在胚胎本体的主动脉-性腺-中肾区被特化，产生包括HSC在内的所有成体造血谱系。这些胚内确定型造血细胞的特化过程以Notch信号依赖的方式进行，通过生血内皮（HE）经历内皮-造血转化而实现3,10,11,12,13,14。除了重建能力外，这些细胞的多谱系潜能及其对Notch信号的依赖性也可用于将其与EMP和LMPP区分开来（详见参考文献3,13）。

阐明人多能干细胞（hPSCs）向原始型和定型造血细胞分化的调控机制，对于在不同hPSC细胞系中可重复地生成定型造血祖细胞可能至关重要。直到最近，尚无能够分离出多能性原始型与定型造血祖细胞的hPSC分化方案15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25。许多采用胎牛血清（FBS）和/或基质细胞共培养的方法首次揭示了hPSC分化具有造血潜能，但其产生的细胞混合物同时包含原始型和定型造血潜能15,16,17,19,22,23,25。此外，许多无血清的造血分化方案已描述了从hPSCs诱导生成具有造血潜能的中胚层所需的信号通路要求18,20,21,24。然而，由于这些方法仍会产生两种程序的异质性混合物，其在临床应用及发育机制研究中的用途可能受限。

我们近期在这些研究基础上进一步阐明了从人多能干细胞（hPSC）来源的中胚层向原始和定型造血细胞分化过程中，ACTIVIN/NODAL 和 WNT 信号通路在不同阶段的特异性信号需求18,26。其中尤为独特的是，通过在特定阶段调控 WNT 信号通路，可以选择性地诱导生成仅具有原始造血潜能或仅具有定型造血潜能的造血前体细胞26。在中胚层特化阶段，使用 PORCN 抑制剂 IWP2 抑制经典 WNT 信号通路，可诱导生成 CD43+ 红系集落形成细胞（EryP-CFC）和髓系前体细胞，但未检测到淋巴系潜能。与此形成鲜明对比的是，在相同分化阶段使用 GSK3β 抑制剂 CHIR99021 激活经典 WNT 信号通路，则完全未检测到 CD43+ EryP-CFC 的生成，同时诱导出 CD34+CD43− 血管内皮（HE）细胞群。该细胞群具有髓系、表达 HBG 的红系以及 T 淋巴系分化潜能。后续分析发现，此类 HE 细胞不表达 CD7327,28 和 CD18428，且其造血潜能依赖于 NOTCH 信号28。此外，单细胞克隆分析表明，这些定型造血谱系可源自具有多向分化潜能的单个细胞28。综上所述，这些研究结果表明，通过在特定阶段调控 WNT 信号通路，可选择性地获得纯化的原始造血前体细胞，或获得依赖 NOTCH 信号的多能性定型造血前体细胞。

本文概述了我们的分化策略，该策略通过在中胚层模式形成过程中调控经典WNT信号通路，从而特异性地生成原始型或确定型造血祖细胞，并介绍了其下游的造血谱系检测方法。本方案对于致力于通过人多能干细胞（hPSCs）产生原始型或确定型造血祖细胞并将其应用于再生医学研究的研究人员具有重要价值。

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方案

1. 试剂

  1. 获取细胞系：hESC 或 hiPSC1、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）29、OP9-DL4 基质细胞30,31。
  2. 试剂准备
    1. 配制 0.1% w/v 的明胶 PBS 溶液。经高压灭菌后分装，4 °C 保存。
      1. 准备明胶包被的塑料器皿。用 1.5 mL 0.1% 明胶溶液包被 6 孔板，室温孵育 15 分钟。使用前立即吸除残留的明胶溶液。
    2. 配制 MEF 培养基：将 IMDM 与 15% v/v FBS 和 1x 抗生素混合。使用前补充 2 mM L-谷氨酰胺和 400 µM 巯基甘油（MTG），4 °C 保存。
    3. 配制 hPSC 培养基：将 DMEM/F12 与 20% v/v 去除血清替代物（KOSR）、1x 非必需氨基酸（NEAA）、1x 抗生素、55 µM β-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺和 10 ng/mL bFGF 混合。用 2 µm 滤器过滤除菌，避光保存于 4 °C。
    4. 配制无血清洗涤培养基（Wash media）：将 DMEM/F12 与 5% v/v KOSR 和 4 mM HCl 混合。用 2 µm 滤器过滤除菌，分装后避光保存于 4 °C。
    5. 将 DNase I 在冰上用预冷的无菌去离子水中溶解 3–4 小时，配制成 1 mg/mL 的 DNase I 溶液。用 2 µm 滤器过滤除菌，分装后保存于 -20 °C。
    6. 配制终止液（STOP 溶液）：在洗涤培养基中加入 10% FBS 和 10 µg/mL DNase I。终止液需在使用前立即配制。
    7. 配制基底膜基质（例如，Matrigel，以下简称 MAT）混合液。
      注：所有 MAT 混合液的配制和使用步骤均需在冰上或 4 °C 下进行。将冷冻的 MAT 在 4 °C 冰上过夜融化。加入 10 mL 预冷的 IMDM 将 MAT 按 1:1 稀释，并在 4 °C 冰上过夜冷藏。再加入额外的 20 mL 预冷 IMDM 进一步稀释，并在 4 °C 冰上过夜冷藏。分装至预冷的离心管中，-20 °C 保存备用。使用前需在 4 °C 过夜融化。
      1. 包被 MAT 细胞培养板。
        注：所有 MAT 板的包被步骤均需在冰上进行。将 6 孔板和 24 孔板预冷至 -20 °C 至少 1 小时。准备包被时，将板置于冰上。每孔加入 4 倍稀释的 MAT，吸除多余液体并可重复使用。冰上孵育 30–60 分钟后，吸除多余 MAT。将包被好的板在 37 °C、5% CO2 培养箱中干燥至少 3 小时。包被后 72 小时内使用。
    8. 将 10% w/v 的牛血清白蛋白（BSA）溶于预冷的蒸馏去离子水中，4 °C 下搅拌 3–4 小时。用 2 µm 滤器过滤除菌，装入避光瓶中，4 °C 保存。
    9. 配制抗坏血酸溶液：将 L-抗坏血酸缓慢溶于预冷的蒸馏去离子水中，终浓度为 5 mg/mL，冰上搅拌 3–4 小时，间歇轻摇至完全溶解。用 2 µm 滤器过滤除菌，分装后保存于 -20 °C。
    10. 配制无血清分化培养基（SFD）：将 IMDM 与 Ham's F-12 按 75:25 混合，加入 0.5% BSA、1x B27 和 0.5x N2 补充剂，4 °C 保存。使用前立即加入 1x L-谷氨酰胺、50 µg/mL 抗坏血酸、400 µM MTG 和 150 µg/mL 全转铁蛋白。
    11. 根据制造商说明配制无血清干细胞培养基（例如，StemPro，以下简称 SP34），4 °C 保存。使用前立即加入 1x L-谷氨酰胺、50 µg/mL 抗坏血酸、400 µM MTG 和 150 µg/mL 全转铁蛋白。
    12. 将胶原酶 II 溶于 1:4 FBS:PBS 溶液中，配制成终浓度为 0.2% w/v 的胶原酶 II 溶液。在 37 °C 水浴中溶解至少 15 分钟。用 2 µm 滤器过滤除菌，分装后保存于 -20 °C。
    13. 使用前立即配制流式细胞分选（FACS）缓冲液：将 5% FBS 溶于 IMDM 中。
    14. 配制 OP9 培养基：将 α-MEM 与 20% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和 1x 抗生素混合。用 2 µm 滤器过滤除菌，4 °C 保存。
    15. 获取基于甲基纤维素的培养基（例如，MethoCult，以下简称 MeC），可为预分装的 3 mL 规格或 100 mL 瓶装。若使用 100 mL MeC，到货后立即分装为每管 2.5 mL 至 14 mL 圆底离心管中。
      注：所有分装样品均应保存于 -20 °C。MeC 培养基需在使用前立即解冻。

2. 人多能干细胞的中胚层分化

  1. 将hPSC细胞系在MEFs上培养至70 - 80%汇合度，置于37 °C、含5% CO₂的培养箱中2.
    注意：人多能干细胞（hPSCs）应具有清晰、未分化的边缘。
  2. 在传代人多能干细胞（hPSCs）前24小时，准备经MAT包被的塑料器皿。
    注意：不同hPSC细胞系所需的MAT包被6孔板总数有所差异。通常情况下，每6孔板在MEFs上汇合的hPSCs需要三个MAT包被的6孔板。
    1. 以不同比例的融合hPSC：MAT孔进行试用饲养层耗竭实验（1:4，1:3，1:2） 等等。在首次诱导分化前进行计数，以确定后续分化所需的MAT包被6孔板数量。
      注意：接种至 MAT 后 24 小时，hPSCs 应达到 80 - 90% 汇合度，细胞集落大小约为 10 - 20 个细胞。
  3. 吸弃hPSC培养基，每孔加入1 mL 37 °C的0.25%胰蛋白酶-EDTA，作用1分钟。吸弃胰蛋白酶-EDTA，每孔加入1 mL STOP培养基。使用细胞刮，将细胞从培养板上刮下。每孔加入1 mL洗涤缓冲液。
    1. 使用 2 mL 血清学移液管吹打 3 - 5 次，以分散细胞团块，并将细胞转移至 50 mL 锥形管中。在 330 x g 条件下离心 hPSCs 5 分钟。
  4. 将细胞重悬于与待使用的 MAT 包被器皿每孔相当的 hPSC 培养基中，总体积为每孔 2 mL。向器皿每孔加入 2 mL hPSC 细胞悬液，并在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中过夜培养。2.
  5. 24 小时后，吸去培养基，加入 37 °C 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，孵育 1 分钟。吸去胰蛋白酶-EDTA 溶液，每孔加入 1 mL STOP 培养基。用细胞刮充分刮取细胞。每孔加入 1 mL WASH 培养基。用 2 mL 血清移液管将细胞吹打 1–2 次，转移至 50 mL 锥形离心管中。在 220 × g 条件下离心 5 分钟。
    注意：胰蛋白酶-EDTA处理时间的长短应由研究者针对每种hPSC细胞系自行确定。胰蛋白酶处理应持续尽可能长的时间，但不得引起单细胞解离。此步骤应使所有hPSC从MAT包被的培养板上脱落，但不产生单细胞解离。所形成的EBs平均应为6–10个细胞。
  6. 吸弃培养基。用5 mL血清移液管在20 mL洗涤培养基中轻柔重悬细胞。以220 × g离心5分钟。
  7. 轻轻将EBs重悬于第0天培养基中（表1）。使用10 mL血清移液管，将含有拟胚体的2 mL分化培养基加入6孔低黏附细胞培养板的每个孔中。置于37 °C、5% CO₂培养箱中培养2 5% O₂2 （多气体）培养箱
    注意：第0天培养基：SFD培养基添加10 ng/mL BMP4（表1每两板hPSCs使用一个6孔低黏附细胞培养皿。
  8. 24小时后，加入2 mL第1天培养基（表1)。将细胞在多气体培养箱中孵育过夜。
    注意：第1天培养基：每孔加入含10 ng/mL BMP4和10 ng/mL bFGF的SFD培养基表1).
  9. 18小时后，用5 mL血清移液管轻轻收集拟胚体，100 × g离心5分钟。用10 mL IMDM培养基洗涤并合并整个培养物，100 × g离心5分钟，吸除上清液。
    注意：培养物中会存在碎片。此低速离心步骤（100 × g）可去除碎片。
  10. 轻轻重悬EBs于添加了第2天培养基（表1）的SFD培养基中，随后每孔加入2 mL，分装至6孔低黏附细胞培养板中。于37 °C多气体培养箱中孵育30 h。
    注意：第2天培养基：10 ng/mL BMP4、5 ng/mL bFGF，以及适当的WNT激动剂或拮抗剂（表1).
    1. 加入3 µM CHIR99021以诱导定型性造血祖细胞。或者，加入3 µM IWP2和1 ng/mL Activin A以诱导原始造血祖细胞。
  11. 继续进行第3节造血祖细胞特化。

3. CD34+ 造血祖细胞的鉴定

  1. 分化第3天，用2 mL移液管在30小时后分离拟胚体（EBs），转移至50 mL锥形管中，在330 × g条件下离心5分钟。用10 mL IMDM培养基轻柔重悬并洗涤，再次在330 × g条件下离心5分钟。
  2. 将拟胚体重悬于第3天培养基（表2）中，并将2 mL分装至低黏附6孔板的每孔中。在37 °C多气体培养箱中培养72小时。
    注意：第3天培养基为SP34培养基，添加15 ng/mL VEGF和5 ng/mL bFGF（表2）。若分化第3天收集的培养基pH发生显著变化（即，培养基变为黄橙色），则每孔添加更多培养基。或者，在第0天减少每孔的拟胚体数量。
  3. 培养72小时后，向每孔加入2 mL第6天培养基（表2）。在37 °C多气体培养箱中继续培养额外48小时。
    注意：第6天培养基为SP34培养基，添加15 ng/mL VEGF、5 ng/mL bFGF、200 ng/mL SCF、4 IU EPO、20 ng/mL IL-6、10 ng/mL IL-11和50 ng/mL IGF-1（表2）。若在步骤3.1中添加了更多培养基，则在步骤3.2中应加入等量的培养基，以保持最终细胞因子浓度不变。
  4. 在分化第8天分离经CHIR99021处理的拟胚体。进入第4节操作。
  5. 在分化第8天收获经IWP2处理的拟胚体至50 mL锥形管中，在330 × g条件下离心5分钟。用第8天培养基（表2）轻柔重悬，于低黏附培养皿中在37 °C、5% CO2培养箱中继续培养24小时。进入第4节操作。
    注意：第8天培养基为SP34培养基，添加100 ng/mL SCF、2 IU EPO、10 ng/mL IL-6、5 ng/mL IL-11、25 ng/mL IGF-1、30 ng/mL TPO、10 ng/mL Flt3-L和30 ng/mL IL-3（表2）。

4. 胚状体的酶解离与造血祖细胞的分离

  1. 用移液管将拟胚体（EBs）转移至50 mL锥形管中。以330 × g离心5分钟，吸除上清液。
  2. 向拟胚体（EBs）中加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，涡旋振荡5秒。置于37 °C水浴中孵育8分钟。加入5 mL终止液（STOP solution），以330 × g离心5分钟，吸除上清液。
  3. 用5 mL胶原酶II（Collagenase II）重悬拟胚体（EBs），涡旋振荡5秒后置于37 °C水浴中孵育。60分钟后再次涡旋振荡5秒，并加入5 mL终止液（STOP solution）。以330 × g离心5分钟，吸除上清液。
  4. 用1 mL FACS缓冲液重悬细胞，通过40 µm细胞滤网过滤，以去除未完全解离的细胞团块。
  5. 计数细胞。取1 × 106个细胞分装至14 mL锥形管中，以330 × g离心5分钟。用FACS缓冲液重悬细胞至终浓度为5 × 106个细胞/mL。将每种实验条件下10%的细胞分装并混合，用于流式细胞术的荧光补偿对照。将细胞与抗体在冰上避光孵育30分钟。
    注：建议的荧光染料组合见材料表。
    1. 对于IWP2处理的细胞，使用抗CD34和抗CD43抗体。
    2. 对于CHIR99021处理的细胞，使用抗CD34、抗CD43、抗CD73和抗CD184抗体。
  6. 用FACS缓冲液洗涤细胞两次，每次以330 × g离心5分钟。将细胞重悬至终浓度为5 × 106个细胞/mL。
  7. 通过流式细胞术分析或分选细胞。对于原始造血祖细胞，分析CD34和CD43的表达水平（图2A）；对于定型造血祖细胞，通过流式细胞术（FACS）分选内皮-造血过渡细胞（HE，表型为CD34+CD43−CD73−CD184−）（图2B），并将细胞收集至含有预冷FACS缓冲液的收集管中。
  8. 为评估分选出的HE细胞的定型造血潜能，可继续进行第5节的内皮-造血转化实验，或第7节的T淋巴细胞分化检测。对于原始造血集落形成细胞（CFC）检测，请继续进行第6节。

5. 内皮细胞向造血细胞转变

  1. 将分离的 CD34+CD43−CD73−CD184− 细胞以 330 x g 离心 5 分钟。用 HE 培养基重悬细胞至浓度为 200,000 个细胞/mL （表 2）。将细胞以每孔 50 µL 分装至 96 孔低黏附细胞培养板中。于 37 °C、5% CO2、5% O2 多气体培养箱中过夜培养。
    注意：HE 培养基：SP34 培养基添加 5 ng/mL VEGF、5 ng/mL bFGF、100 ng/mL SCF、2 IU EPO、10 ng/mL IL-6、5 ng/mL IL-11、25 ng/mL IGF-1、30 ng/mL TPO、10 ng/mL FLT3-L、30 ng/mL IL-3、10 ng/mL BMP4、20 ng/mL SHH、10 µg/mL 血管紧张素 II 和 100 µM 氯沙坦钾，细胞密度为 2 × 105 个细胞/mL（表 2）。
  2. 根据需要准备 24 孔 MAT 包被板（见步骤 1.2.7.1）。
  3. 细胞将在过夜后聚集成每团 6–10 个细胞的细胞簇。次日早晨，将每份 50 µL 重聚的细胞轻柔转移至 24 孔 MAT 包被板的中央。将培养板轻柔放入 37 °C 多气体培养箱中孵育 4–6 小时，直至细胞贴壁。
  4. 细胞贴壁后，向每孔加入 1 mL 新鲜 HE 培养基。在 37 °C、5% CO2、5% O2 多气体培养箱中继续培养，直至可见造血细胞出现（通常为 5–7 天；图 2D）。使用光学显微镜在 100 倍放大下观察。
  5. 通过轻柔移除细胞上的 HE 培养基来收获确定性造血祖细胞。将该培养基通过 40 µm 细胞滤网过滤并收集。向孔中贴壁的细胞加入 0.5 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 孵育 5 分钟。向每孔加入 0.5 mL 终止液。将细胞悬液通过同一 40 µm 滤网，以合并所有贴壁和非贴壁细胞。以 330 x g 离心 5 分钟。
    1. 为评估该批量培养物的集落形成能力（CFC），进入第 6 节。
  6. 用 FACS 缓冲液洗涤细胞两次。以 330 x g 离心 5 分钟。
  7. 将细胞重悬于 FACS 缓冲液中，浓度为 5 × 106 个细胞/mL。在冰上避光条件下，使用抗 CD45 和抗 CD34 抗体对细胞染色 30 分钟（推荐的荧光染料见 材料表）。
  8. 用 FACS 缓冲液洗涤细胞两次。以 330 x g 离心 5 分钟。
  9. 通过 FACS 分离 CD34+CD45+ 细胞（图 2E）。将细胞分选至预冷的 FACS 缓冲液中。
  10. 根据需要评估确定性 CD34+CD45+ 造血祖细胞（第 6 节进行集落形成单位检测，第 7 节评估淋巴系潜能，或其他研究者自主设计的检测方法）。

6. CFC 实验

  1. 为每个用于CFC实验的样品解冻一份MeC。
  2. 将待检测的细胞（步骤4.5、4.7、5.5或5.9）加入MeC中，充分涡旋混匀，并按照制造商说明，将MeC培养物静置5–10分钟，直至气泡消散。使用装有16½号针头的3 mL注射器，小心吸取2 mL MeC。
    注意：典型的铺板密度范围为1,000–20,000个细胞/mL，具体取决于预期的前体细胞频率。
  3. 小心地将1 mL MeC细胞混合液分别加入两个35 mm组织培养皿中。通过轻轻敲击和旋转培养皿，使MeC在35 mm培养皿中均匀分布。将上述每个培养皿置于盛有水的15 cm组织培养皿中。在37 °C、5% CO2培养箱中孵育。
  4. 使用光学显微镜在40X 放大倍数下观察MeC培养物。对获得的不同类型的CFC进行定量。在铺板后8–10天分析原始型CFC实验（图2C）；在铺板后14天分析确定型CFC实验。代表性CFC实验的克隆形态见图2F。

7. 建立确定性造血潜能的T细胞检测实验

  1. 在100 mm细胞培养皿中将OP9-DL4细胞培养至融合30,31,32.
    1. 在接种T细胞实验前72至96小时解冻OP9-DL4细胞。将OP9-DL4细胞重悬于10 mL OP9培养基中，分装至10 cm培养皿。于37 °C、5% CO₂培养箱中培养。2 孵育至70%–90%汇合度。
    2. 从100 mm培养皿中收获OP9-DL4细胞时，移除培养基，加入5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，作用5分钟。加入5 mL OP9培养基以终止胰蛋白酶活性。在330 × g离心5分钟。用1 mL OP9培养基重悬细胞，并进行细胞计数。
      注意：一个10 cm培养皿的汇合OP9-DL4细胞可获得约10 × 10⁶个细胞。6 OP9-DL4 细胞
    3. T细胞实验前48小时，接种2 × 106 在24孔板中每孔加入0.5 mL OP9培养基，共12 mL，接种细胞。于37 °C、5% CO₂条件下培养2 培养箱
  2. 将步骤 4.5、4.7、5.5 或 5.9 中获得的 2,000 - 10,000 个待检测细胞加入含 OP9 培养基的一孔 OP9-DL4 细胞中，培养基中添加以下成分：30 ng/mL SCF（仅前 6 天使用）、5 ng/mL IL-7 和 5 ng/mL FLT3-L。于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养2 培养箱中孵育。此步骤不更换培养基。
  3. 每4至5天，将T细胞前体传代至6孔板中新鲜的OP9-DL4基质细胞上。用1 mL移液器吹打细胞，并通过40 µm滤膜去除细胞团块。以330 × g离心5分钟。吸除上清液。用2 mL新鲜OP9培养基重悬细胞，该培养基添加有5 ng/mL IL-7和5 ng/mL Flt3-L，然后将细胞接种至新鲜的OP9-DL4细胞上。
    注意：传代前 48 小时，接种 2 × 106 将新鲜的OP9-DL4细胞加入12 mL OP9培养基中，每孔2 mL分装至6孔板。
  4. 共培养至少21天后，剧烈吹打细胞，通过40 µm滤网以去除细胞碎片。在330 x g下离心5分钟，吸除上清液。
  5. 用预冷的FACS缓冲液洗涤细胞两次，330 × g离心5分钟。
  6. 用 FACS 缓冲液重悬细胞，浓度为 5 x 106 细胞/mL。在冰上避光孵育30分钟，用抗-CD45、抗-CD56、抗-CD4和抗-CD8抗体对细胞进行染色（建议的荧光染料组合见于 材料表）。加入活/死细胞染色剂（DAPI， 等等。以去除分析中的碎片。
  7. 用 FACS 缓冲液洗涤细胞两次，330 × g 离心 5 分钟。
  8. 使用流式细胞仪分析细胞，以检测T淋巴细胞前体的存在（图3).

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结果

图 1 示意性地展示了从人多能干细胞（hPSCs）诱导原始型和确定型造血祖细胞的过程。在分化第2至第3天期间，经典WNT信号通路介导中胚层的模式形成，随后发生造血祖细胞的特化。

代表性的人多能干细胞分化造血细胞培养物的流式细胞术分析及甲基纤维素集落形成实验结果如图所示 图2IWP2处理的分化培养将产生一种独特的CD34+CD43− 和 CD34低/−CD43+ 群体，而经CHIR处理的分化培养物将具有 <1% CD43+ 分化第8天的细胞（图 2A，B)26在...

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讨论

本方案描述了一种快速、无血清、无基质细胞的分化方法，可用于生成原始型或定型造血祖细胞。利用本方案可稳定实现原始型或定型造血祖细胞的中胚层特化，其独特之处在于使用了经典WNT信号通路的小分子抑制剂。通过GSK3β抑制剂CHIR9902133进行阶段特异性WNT激活，可诱导生成定型造血中胚层；而使用PORCN抑制剂IWP234抑制WNT信号，则可指定生成原始造血中胚层26。值得注意的是，该方法尚不能有效产生具有移植能力的类造血干细胞群体（未展示）。然而，采用此方法获得的定型造血祖细胞可通过转基因手段赋予其移植潜能35，显示出其在未来转化应用中的潜力。

成功进行hPSC分化的关键因素之一是hPSC形成的拟胚体（EB）的初始大小。理想情况下，EB应由约6至10个细胞组成。如果EB过大，分化培养物可能会异常地同时启动多种分化程序，这可能是由于EB内部信号激活不恰当所致。应在分化开始后的前24小时内对分化...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作得到了华盛顿大学医学院内科系血液学部的支持。CD 获得美国国家心肺血液研究所 T32HL007088 项目的支持。CMS 获得美国血液学会学者奖的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
伊氏改良杜尔贝科培养基（IMD）Corning10-016
胎牛血清（FBS），胚胎干细胞级别Gemini Bioproducts100-500
胎牛血清（FBS）HycloneSH30396.03
L-谷氨酰胺，200 mM 溶液Life Technologies25030-081
青霉素-链霉素Life Technologies15070-063
0.25% 胰蛋白酶-EDTALife Technologies25200056
0.05% 胰蛋白酶-EDTALife Technologies25300054
明胶，猪皮来源，A型Sigma-AldrichG1890
α-最低必需培养基（Alpha-MEM）Life Technologies12000-022
DMEM-F12 培养基Corning10-092-CV
无血清替代物（Knock-out serum replacement）Life Technologies10828028"KOSR"
非必需氨基酸（NEAA）Life Technologies11140050
β-巯基乙醇，55 mM 溶液Life Technologies21985023
盐酸Sigma-AldrichH1758
牛血清白蛋白，V组分Fisher ScientificBP1605
Ham's F12 培养基Corning10-080
N2 添加剂Life Technologies17502048
B27 添加剂，不含维生素ALife Technologies12587010
Stempro-34（SP34）Life Technologies10639011"SP34"
生长因子减量基底膜基质（Matrigel）Corning354230"MAT"
L-抗坏血酸Sigma-AldrichA4403
人血清转铁蛋白Sigma-Aldrich10652202001
单硫代甘油（MTG）Sigma-AldrichM6145
胶原酶BRoche11088831001
胶原酶IILife Technologies17101015
DNaseICalbiochem260913
磷酸盐缓冲液（PBS）Life Technologies14190144
bFGFR&D Systems233-FB
BMP4R&D Systems314-BP
激活素A（Activin A）R&D Systems338-AC
VEGFR&D Systems293-VE
SCFR&D Systems255-SC
IGF-1R&D Systems291-G1
IL-3R&D Systems203-IL
IL-6R&D Systems206-IL
IL-7R&D Systems207-IL
IL-11R&D Systems218-1L
TPOR&D Systems288-TP
EPOPeprotech100-64
Flt-3 配体（FLT3-L）R&D Systems308-FK
CHIR99021Tocris4423
IWP2Tocris3533
血管紧张素IISigma-AldrichA9525
氯沙坦钾Tocris3798
CD4 PerCP Cy5.5 单克隆抗体 RPA-T4BD Biosciences560650稀释比例 1:100；T细胞检测
CD8 PE 单克隆抗体 RPA-T8BD Biosciences561950稀释比例 1:10；T细胞检测
CD34 APC 单克隆抗体 8G12BD Biosciences340441稀释比例 1:100；EHT检测
CD34 PE-Cy7 单克隆抗体 8G12BD Biosciences348801稀释比例 1:100；造血内皮细胞检测
CD43 FITC 单克隆抗体 1G10BD Biosciences555475稀释比例 1:10；造血内皮细胞检测
CD45 APC-Cy7 单克隆抗体 2D1BD Biosciences557833稀释比例 1:50；T细胞检测
CD45 eFluor450 单克隆抗体 2D1BD Biosciences642284稀释比例 1:50；EHT检测
CD56 APC 单克隆抗体 B159BD Biosciences555518稀释比例 1:20；T细胞检测
CD73 PE 单克隆抗体 AD2BD Biosciences550257稀释比例 1:50；造血内皮细胞检测
CD184 APC 单克隆抗体 12G5BD Biosciences555976稀释比例 1:50；造血内皮细胞检测
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）BD Biosciences564907稀释比例 1:10,000；T细胞检测
OP9 DL4 细胞Holmes, R. 和 J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034Stemcell Technologies4034"MeC"
Milli-Q 水纯化系统EMD Millipore
5% CO2 培养箱设定温度为 37 °C
多气体培养箱设定温度为 37 °C，5% CO2，5% O2
6 孔组织培养板Corning353046
24 孔组织培养板Corning353226
6 孔低黏附组织培养板Corning3471
24 孔低黏附组织培养板Corning3473
35 mm 组织培养皿Corning353001
钝头针，16 号Corning305198
3 cc 注射器Corning309657
5 mL 聚丙烯试管Corning352063
5 mL 聚苯乙烯试管Corning352058
15 mL 聚丙烯锥形离心管Corning430791
50 mL 聚丙烯锥形离心管Corning430921
2 mL 血清移液管Corning357507
5 mL 血清移液管Corning4487
10 mL 血清移液管Corning4488
25 mL 血清移液管Corning4489
细胞刮刀Corning353085
2.0 mL 冻存管Corning430488
5 mL 试管配 40 µm 细胞筛Corning352235
40 µm 细胞筛Corning352340
细胞培养离心机
生物安全柜
FACS AriaII 或同等设备
LSRii 或同等设备
FlowJo 软件TreeStar
水浴锅设定温度为 37 °C
0.22 µm 过滤系统Corning
高压灭菌器
4 °C 冰箱
-20 °C 冰柜
-80 °C 冰柜

参考文献

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拟胚体形成中胚层特化GSK3抑制剂PORCN抑制剂VEGF处理FACS分离流式细胞术
从人多能干细胞定向分化原始和确定型造血祖细胞
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