基于荧光的淋巴细胞检测适用于小分子的高通量筛选

摘要

我们提出在目前的研究使用从转基因小鼠衍生的淋巴细胞的新颖的基于荧光的测定法。该测定是适于赋予的任抑制或促进淋巴细胞的活化的能力的小分子的高通量筛选（HTS）。

摘要

高通量筛选（HTS）是目前能够调节的生化反应，或细胞过程的化学实体的标识支柱。随着生物技术的进步和小分子的高潜力转化，一批新药研发创新方法的演变，这也解释了在使用HTS的复苏兴趣。肿瘤学领域是目前药物筛选中最活跃的研究领域，与靶向移植相关并发症或自身免疫性疾病的新免疫调节化合物的鉴定没有取得重大突破。在这里，我们提出体外鼠基于荧光检测淋巴细胞一种新型容易地适应新的免疫调节化合物的鉴定。这种测定法使用从转基因小鼠，其中该Nur77启动子后的T细胞或B细胞受体刺激驱动GFP的表达衍生的T或B细胞。由于GFP强度反映了靶细胞的活化/转录活性，我们的测定法定义了一种新的工具来研究对细胞/生物反应给出化合物（S）的作用。例如，使用在不存在"目标假说"，它导致了160显示免疫调节活性的潜在的命中鉴定4398化合物进行初筛。因此，使用该测定的是适合用于药物开发的程序探索进一步在体外 /体内验证研究之前大化学文库。

引言

高通量筛选（HTS）是一个久经考验的战略新的治疗分子的鉴定或为新的医学指征FDA批准的药物重新定位广泛采用。 ¹到目前为止，取得HTS成功可以通过的先前发现的药物过多测定。例如，用于乳腺癌，西他列汀的治疗酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼;一个二肽基肽-4（DPP-4）抑制剂用作抗高血糖药物，以及用于治疗慢性髓细胞性白血病的治疗口服的Bcr-Abl的酪氨酸激酶抑制剂达沙替代表批准的药物最初由发现的一长列的几个例子HTS。 ²虽然制药业的生产力近来从缺乏的新化学实体的发现遭受的，成功的药物发现的可能性可以通过增加在临床前念珠菌的数量提高TES显示调节生物学/生物化学特性。因此，适于表型筛选新HTS测定法的发展可以提供为新药命中的发现提供了重要的药理学工具的潜力。 ^{3，4，5，6}此外，高温超导现在可以以更快的速度，由于近年来显著技术改造包括定制设计的灵活的机器人装置，新颖读出的技术和大量的小型化进行。 ^2,7在有助于在使用表型筛选（又名向前药理学）的日益增长的兴趣的因素是人们认为着眼于功能效应，而不是关于分子靶（基于目标的筛选/生化反应）过于简化的还原假设是更有可能以翔瓦特临床疗效。因此，表型筛选持有的承诺，发现新的潜在的治疗化合物和目前无法治疗的疾病的分子途径。 ²

适当地识别一个给定的分子靶标或细胞功能抑制剂或活化剂，高度敏感的，可靠的检测是必需的，以便真正命中和误报之间进行区分。那么，是什么使一个良好的试验？一个给定的测定法的质量必须由信噪比（通过为Z因子反射的）首先判断。 ⁸其次，有针对性的效果或屏幕的目标应明确规定。例如，功能性的基于细胞的方法可以用于受体的筛选提供显著优点，而不是专门设计来评估配体 - 受体结合的测定法。这样做的原因是，在后一种方法不能激动剂和拮抗剂配体之间区分。SS ="外部参照"> 9相反，基于细胞的方法很可能是作为受体功能可以在一个生物的表型被直接评估更为有效（增殖，细胞周期停滞，细胞凋亡，和/或分化）。然而，必须指出的是，生物化学测定可在表型测定中提供显著优点，因为它们违反在一个特定的细胞内靶标。一个精心优化的生化检测通常会有比表型筛选数据散射少，同时简化后的相关行动的药物分子机制的研究。然而，目标为基础的或生物化学分析的主要缺点是扩增在生物系统（最初在生物化学测定法研究了特异性的损失）测试时，可能会影响非特定目标的假阳性命中率的机会。 ¹⁰虽然阴性和阳性之间命中一个完善的分界点可以最大限度地减少误报的数量我n中的初步筛选，使用了生理学相关的系统模拟天然细胞环境如完整细胞，完整的组织或整个动物仍然测定设计钟摆的核心。因此，表型筛选使铅发现与对于没有标识的药物靶标疾病期望生物/表型效应，而无需化合物的活性或作用模式的先验知识。 ¹¹

在本文中研究涉及基于两个重要部件的优化和可再现的表型筛选的开发和测试:市售小鼠模型和化学化合物的聚集亚家族。对于动物模型，测定法依赖于在其中绿色荧光蛋白 （GFP）的表达是由第驱动用来自小鼠品系（Nur77 ^GFP）带有含一个盒的细菌人工染色体衍生的淋巴细胞ËNur77子。 ¹²这种刺激的标志是基于这样的事实，Nur77是立即早期基因上调下列T细胞受体（TCR）或B细胞受体（BCR）刺激。 ¹²对于筛选方法本身，使用的方法，以帮助避免琐碎类似物的筛选，同时最小化，以评估一个大化学文库（> 10 ⁵的化合物）所需的时间。这样做，通过使用虚拟筛选工具药物化学家选择的化学化合物的数据库利用来识别使用已知活性种子的结构作为参考拓扑类似的化合物。这个方法允许我们筛选较136000化学实体的整体库4398的化合物。

方案

所有动物方案都被蒙特利尔大学的动物管理委员会批准。小鼠通过CO ₂的渐进吸入安乐死，直到没有生命体征观察颈椎脱位。该程序是由经过认证的人员进行，以确保动物以人道的方式实施安乐死，并根据加拿大议会关于动物保护的建议。

1.脾细胞培养基和流式细胞仪缓冲液的制备

1. 执行70％的乙醇，生物清洗引擎盖下的所有步骤。
2. 取出70毫升预热罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640 1X培养基（市售，并在过滤500毫升体积的无菌瓶提供），置于无菌管。除去的介质将在后面的协议被使用。
3. 补充剩余的430毫升的RPMI 1640 1X用50ml灭活的小牛血清（FBS），5毫升青霉素/链霉素，5毫升HEPES，将5ml非必需氨基酸，5毫升丙酮酸钠，和0.05毫升的过滤（1M）2-巯基乙醇。
   注:使用水浴在37ºC设置，以避免热量惊爆细胞预温脾网上平台。这是很重要的，以避免细胞凋亡的诱导。
4. 为了制备流式细胞缓冲液，加入2毫升胎牛血清的98毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS），并保持冷藏直到使用（三级优选在天）。

2.从一代^GFP Nur77鼠标脾脾脏细胞悬浮

1. 一个septically隔离从6-8周大的雌性Nur77 ^GFP小鼠脾脏。
   1. 为了实现这一目标，在无菌罩工作。浸泡在70％乙醇的牺牲鼠标的皮毛，剪刀和镊子。
   2. 莱在其右侧的鼠标，切左上腹部象限皮肤和肌肉。检查切口面积明显定位脾然后切出来。保留脾脏在冰上直至准备脾介质以进行下一步骤。
2. 放置脾（多个）在含有5ml预热脾细胞培养基的10cm ²的细胞培养物的培养皿。
3. 醪使用无菌注射器柱塞直到溶液是浑浊的脾脏。脾胶原基质应保持该过程的结束。
4. 以下在脾细胞中的广泛糖化，收集细胞悬浮液，并使之通过放置在一个50毫升管过滤出任何碎屑或血块70微米的细胞滤网。
5. 离心在500×g离心5分钟。丢弃上清液后，再悬浮在2-3毫升细胞沉淀在内部产生的或商业的红细胞溶解缓冲液中。继移液（2-3倍），让悬挂休息20-30秒。
6. 加入5毫升的PBS或选择合适的缓冲液，然后离心细胞悬浮液在500×5分钟g。
7. 除去上清液（应该是红色，因为它包含裂解红Blood细胞）并重新悬浮在2毫升脾细胞中的细胞沉淀。
8. 使用血细胞计数器，计数用锥虫蓝染色的细胞的数目存活和死亡（坏死）细胞之间进行区分。

3.从脾细胞悬浮细胞的T细胞分离

1. 离心细胞悬浮液5分钟，在500×g下。重新悬浮于无血清的RPMI培养基中的细胞（来自步骤1.3 50ml）中，得到10×10 ^6个细胞/ mL的细胞浓度。
2. 转移细胞以5毫升聚苯乙烯管中并搁置脾细胞的纯度评估/比较的100微升等分试样在纯化步骤结束。
3. 正常大鼠血清添加至50μL/ mL的细胞悬浮液，接着为T细胞的分离抗体混合物（50μL/ mL）中。
4. 混合细胞悬液，让它休息10分钟。这个步骤可以使抗体的鸡尾酒来约束所有不需要的细胞。
5. 添加链霉快速球（磁铁集成电路珠）为2.5分钟，然后用无血清培养基使体积至2.5毫升。
6. 放置管在3分钟的细胞隔离磁铁。
7. 握住磁铁和一个移动浇注出来的溶液转移T细胞悬液注入了新的聚苯乙烯管。
   注:将分离的悬浮液含有纯化的T细胞。所有不想要的细胞被保持在结合到磁性链霉珠的管的一侧。
8. 使用计数台盼蓝和血球分离的T细胞。
   注:在这一步骤中分离的T细胞的纯度可通过前，后通过流式细胞仪的T细胞分离分析的CD3 ⁺事件的百分比进行验证（可选）。 ¹³
   1. 简要地说，离心在500xg1毫升脾细胞悬浮液。弃上清，悬浮于流式细胞仪缓冲液将细胞以1×10 ^6个细胞/ mL的浓度。
   2. 添加荧光标记的抗谅解备忘录100:以1:1的浓度ËCD3抗体。孵育在4℃下30分钟。洗一次离心机在通过流式细胞分析流式细胞缓冲（400μL）重新被挂起。

4.从脾细胞悬浮细胞B细胞分离

1. 遵循相同的协议，作为T细胞（步骤3.1-3.8），但使用的是B细胞分离试剂盒说明。对于纯度评价，使用CD19抗体，而不是CD3抗体。 ¹³
   1. 对于纯度评估（选配），使用CD19抗体，而不是CD3抗体。离心机1毫升，在500×g下脾细胞悬浮液。弃上清，悬浮于流式细胞仪缓冲液将细胞以1×10 ^6个细胞/ ml的浓度。
   2. 添加荧光标记的抗小鼠CD19抗体以1:1的浓度:100，并在4℃下孵育30分钟。洗一次，离心并在流式细胞仪缓冲液（400微升）FO重新悬浮通过流式细胞仪分析ř。

5. T细胞活化和GFP表达的诱导

1. 种子的T细胞，在悬浮液中，成圆底96孔板以2.5×10 ^5个细胞的浓度/孔。
2. 添加重组白细胞介素（IL）-7在2毫微克/毫升和CD3 / CD28磁珠（25微升/ 10 ^6个细胞）。保持T细胞未用珠，作为购买的量度代表非激活的T细胞的阴性对照的一部分。
3. 12小时后，通过在每个轻轻吹打细胞悬液以及上下打破任何珠 - 细胞复合/聚集体收获从96孔板的T细胞。收集从所有孔中成5毫升聚苯乙烯管中的悬浮液中。
4. 放置装有用于T细胞或B细胞的纯化先前使用的相同的细胞分离磁铁内的悬浮液的管子，并允许它休息5分钟。
5. 转移T细胞悬液INT握住磁铁和一招涌出来解决OA新的聚苯乙烯管。
6. 离心细胞，在500×g离心5分钟。重悬在新鲜脾细胞培养基中的细胞以获得2×10 ⁶个细胞/ mL的浓度。
7. 评估与非活化的T细胞相比通过在12到24小时后刺激流式细胞仪（可选为质量控制）GFP表达强度。 ¹²
   注:绿色荧光是内在的Nur77 ^GFP的T细胞，并于TCR的成功激活就体现出来了。 ¹²
8. 用于通过显微镜活力和活化（可选）的评估，染色活化的细胞用Hoechst 30分钟分析前以0.2微克/ ml的浓度。添加细胞悬浮液的适当体积的盖滑动或一个平底黑色双面384孔板的孔中，并在荧光显微镜下检查，以评估活细胞。死皮细胞不会保留核武器染色。 ¹⁴

6. B细胞活化和GFP表达的诱导

1. 使用T-25培养烧瓶中，将重悬的分离的B细胞以1×10 ^6个细胞/ mL。
2. 添加10微升/毫升的抗小鼠IgG / IgM抗体（H + L）和重组CD40L在200纳克/毫升的浓度。保持B细胞未处理，作为以后测量的阴性对照的一部分（代表非活化的B细胞）。
3. 评估与非活化的B细胞相比在12或24小时后的刺激通过流式细胞术GFP表达强度。
   注:绿色荧光是内在的Nur77 ^GFP B细胞和经BCR的成功激活就体现出来了。 ¹²
4. 用于通过显微镜活力和活化（可选）的评估，染色活化的细胞用Hoechst 30分钟分析前以0.2微克/毫升的浓度。添加足够量的细胞悬浮液以盖滑动或一个平底黑色双面384孔板的孔中，并检查在荧光显微镜下以评估活细胞。死皮细胞不会保留核染色。 ¹⁴

小分子7.高通量筛选

1. 以2×10 ^6个细胞/ mL的激活的T细胞或B细胞的（磁珠或抗体/ CD40L）或非活化基制备细胞悬浮液。
2. 板75000细胞/孔在384孔板（40微升的体积）。使用平底黑色双面384孔板或用于通过使用赫斯特染色荧光显微镜（HTS之前可选质量控制步骤）活性和激活的评估在显微镜盖玻片（参照步骤5.8和6.4的详细信息）。 ¹⁴
3. 手动或使用自动化系统，加选择（溶于0.5％DMSO）中的药物到每个孔中。
4. 的载体（DMSO）添加到正（激活）和负（非ACTI氧基团）对照孔。调整DMSO浓度为最多0.5％。
5. 孵育所述板在37ºC24小时（或培养选择的时间）和5％ _的 CO _2。
6. 对筛选的当天，淡化的Hoechst 33342染色溶液（1:3333;对于如在384孔板中添加10μL的向细胞以产生总体积为50μl）。通过加入Hoechst的解决方案，以实现0.2微克/ mL的浓度染色的GFP分析前30分钟。
7. 轻轻吸取细胞上下以获得每一个均匀分布良好。
   注意:此步骤是在使用自动系统作为细胞倾向于在井一侧积累，相反的流动方向分配所述药物（步骤7.3）的情况下，非常重要的。
8. 旋板在45 XG在室温下3分钟。
9. 离开板，以其余为在室温下15分钟。
10. 执行板（S）读数，使用自动化共焦含量高SCRE效果图创作（HCS）系统。 ¹⁵ 加载板到机器。在40X或更高的放大倍率设定的目标。使用相机＃4赫斯特（紫外线灯）和GFP相机＃1（激光488）。设置机器读取每孔6-10场。调整机器在488纳米（阅读GFP）和紫外线（读赫斯特）做每场两个连续的读数。在40X或更高的放大倍率设定的目标。
    注:该系统是不需要任何调整计算机化的显微镜。焦距，入射光的强度和暴露时间是由机器自动所有的配置。

结果

高温超导实验的设计

设计此荧光分析时有两个重要的因素考虑在内。首先，我们需要复制在其中的T或B细胞激活将代表一个疾病（ 例如移植物抗宿主病）的生理状态。第二，应该使用灵敏和定量的方法来进行细胞活化的评估。荧光是时下高温超导读数的主要选择之一，因为它符合这些需求。 ^10，16 作为可以得到以下Nur77 ^GFP一个健壮的GFP读出在体外 或体内衍生T细胞或B细胞的刺激^，12我们的测定法利用此战略作为第i的工作模型非活化和活化的细胞之间进行区分免疫调节化合物的dentification。

讨论

数读出的方法已被开发用于灵敏和可靠的HTS测定法的发展。这些措施包括色度，发光或荧光方法。虽然比色法是简单的设置，它们需要的化学品的多次加入，其可干扰或中断所测试的细胞。 ²³此外，它们不作为药理学作用是在特定端点评估允许生物应答的动态评估。此外，如果使用自动的HTS此方法可能需要昂贵的机器人手臂。这些因素使色度读奏与HTS的目标相容性较差，由于其繁琐的要求和低灵敏度。 ²³虽然发光已经被提出作为一种替代比色测定法，这些发光测试中的HTS应用通常仅限由于细胞裂解的要求。尽管其他非裂解的协议进行了脱开发出来的生物发光信号的强度可以由许多因素，如萤光素吸收，辅因子，pH值可用性和培养基或缓冲液的透明度受到阻碍，从而导致检测到的生物发光信号，并在细胞活性的实际变化之间的差异。 ²⁴因此，大多数测定依赖于荧光的方法。事实上，基于荧光的测定法是用小型，高荧光有机能够监视多种在细胞活化细胞过程的分子最初开发。总而言之，荧光测定法具有更高的灵敏度，并且可以HTS期间可以容易地适应用于表型测量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nur77GFP小鼠	Jackson 实验室	小鼠品系 016617	号在我们的动物设施中建立了内部菌落
96 孔-U 培养板，无菌	VWR International	10062-902	使用磁珠
70 µ 活化 T 细胞;m 细胞过滤器，无菌	康宁公司	352350	生成脾细胞细胞悬液
5 ml 聚苯乙烯圆底管，无菌	Corning Inc.	352058	生成脾细胞悬液
50 ml 聚丙烯锥形底管，无菌	VWR International	89039-656	脾细胞细胞悬液的产生
10 ml 无针注射器，无菌	Becton， Dickinson and Company	305482	捣碎脾
T-25 培养瓶	Greiner Bio-One	690 175	在活化过程中加入 B 细胞
5 ml 细胞培养皿，无菌	Greiner Bio-One	627 160	捣碎脾
青霉素 - 链霉素 （10,000 U/mL）	WISENT Inc.	450-200-EL	脾细胞培养基的成分
含碳酸氢钠和 L- 谷氨酰胺的 RPMI 1600	WISENT Inc.	350-002-CL	脾细胞培养基的成分
MEM 非必需氨基酸	WISENT Inc.	321-010-EL	脾细胞培养基的成分
HEPES 游离酸 1 M	WISENT Inc.	330-050-EL	脾细胞培养基的成分
丙酮酸钠溶液 （100mM）	WISENT Inc.	600-110-EL	脾细胞培养基的成分
胎牛血清 （FBS）	WISENT 公司	080-910	脾细胞培养基和流式细胞术缓冲液的成分
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	WISENT Inc.	311-010-CL	流式细胞术缓冲液的组分
2-巯基乙醇 （55 mM）Thermo	Fisher Scientific	21985-023	脾细胞培养基的组分
T 细胞分离试剂盒	Stemcell Technologies	19851	分离 T 细胞
B 细胞分离试剂盒	Stemcell Technologies	19854	分离 B 细胞
T 活化剂 CD3/CD28 超顺磁性珠子	Thermo Fisher Scientific	11452D	激活 T 细胞
细胞分离磁力架	Stemcell Technologies	18000	分离 T 细胞并去除磁珠
AffiniPure F（ab'）2 山羊抗小鼠 IgG + IgM （H+L） 片段		115-006-068	刺激 B 细胞
重组鼠 IL-7	Peprotech	217-17	在激活过程中支持 T 细胞存活
重组 CD40L	R&D Systems	8230-CL/CF	刺激 B 细胞
抗小鼠 CD3 抗体	BD Pharmingen	561799	用于流式细胞术的 T 细胞染色
抗小鼠 CD19 抗体	BD Pharmingen	553786	用于流式细胞术的 B 细胞染色
Biomek FXp	PerkinElmer Inc.	A31842	孵育 24 小时后重悬细胞：
Opera Phenix 高内涵筛选系统，	PerkinElmer， Inc.	HH14000000	分析 GFP/Hoechst 信号