一种基于荧光的淋巴细胞检测方法，适用于小分子高通量筛选

摘要

本研究介绍了一种基于荧光的新方法，该方法使用来自转基因小鼠的淋巴细胞。该方法适用于对具有抑制或促进淋巴细胞活化能力的小分子进行高通量筛选（HTS）。

摘要

高通量筛选（HTS）目前是鉴定能够调节生化反应或细胞过程的化学实体的主要手段。随着生物技术的进步以及小分子在转化医学中的巨大潜力，药物发现领域已发展出多种创新方法，这也解释了近年来对HTS应用兴趣的重新兴起。在药物筛选研究中，肿瘤学领域目前最为活跃，但在识别靶向移植相关并发症或自身免疫性疾病的新型免疫调节化合物方面，尚未取得重大突破。本文介绍了一种新颖的 体外 基于荧光的鼠源性淋巴细胞检测法，可轻松适用于新型免疫调节化合物的鉴定。该检测方法采用转基因小鼠来源的T细胞或B细胞，其中Nur77启动子在T细胞或B细胞受体受到刺激后驱动GFP表达。由于GFP强度反映了靶细胞的激活状态/转录活性，本检测方法提供了一种研究特定化合物对细胞/生物学反应影响的新工具。例如，曾开展一项初筛实验，在未添加特异性刺激物的情况下，对4,398种化合物进行了检测。 "目标假设"，从而鉴定出160种具有免疫调节活性的潜在候选化合物。因此，该检测方法适用于在进一步研究之前，针对大型化合物库开展药物发现项目。 体外/体内 验证性研究。

引言

高通量筛选（HTS）是一种已被证实的策略，广泛用于发现新的治疗分子或将美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物重新定位至新的医学适应症。¹ 到目前为止，HTS 的成功可通过大量已发现的药物得以衡量。例如，用于治疗乳腺癌的酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼（lapatinib）、作为降血糖药物使用的二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂西格列汀（sitagliptin），以及用于治疗慢性髓性白血病的口服 Bcr-Abl 酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼（dasatinib），均为最初通过 HTS 发现的众多获批药物中的几个实例。² 尽管近年来制药行业在新化学实体的发现方面遭遇瓶颈，但通过增加具有调节性生物学/生物化学特性的临床前候选化合物数量，可提高药物发现的成功概率。因此，开发适用于表型筛选的新型 HTS 检测方法，有望为发现新的药物候选分子提供重要的药理学工具。^3,4,5,6 此外，由于近年来在技术上的重大变革，包括定制设计的灵活机器人系统、新型检测技术以及广泛的微型化，HTS 现在能够以更快的速度进行。^2,

方案

所有动物实验方案均经蒙特利尔大学动物护理委员会批准。小鼠通过逐渐吸入 CO₂ 实施安乐死，直至观察不到生命体征，随后进行颈椎脱位。该操作由经认证的人员执行，以确保动物的安乐死过程符合加拿大动物护理委员会的建议，且以人道方式进行。

1. 脾细胞培养基和流式细胞术缓冲液的制备

1. 所有步骤均须在经70%乙醇清洁的生物安全柜中进行。
2. 取出70 mL预热的RPMI 1640 1x培养基（商品化产品，以过滤灭菌的500 mL瓶装提供），置于无菌离心管中。该培养基将在后续实验步骤中使用。
3. 向剩余的430 mL RPMI 1640 1x培养基中添加50 mL灭活胎牛血清（FBS）、5 mL青霉素/链霉素、5 mL HEPES、5 mL非必需氨基酸、5 mL丙酮酸钠以及0.05 mL过滤除菌的（1 M）2-巯基乙醇。
   注意：使用37 ºC水浴预热脾细胞培养基，以避免对细胞造成热休克。此步骤至关重要，可防止细胞凋亡的诱导。
4. 配制流式细胞术缓冲液时，将2 mL FBS加入98 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，混匀后置于冰箱冷藏保存，建议在三天内使用完毕。

2. 从 Nur77^GFP 小鼠脾脏制备脾细胞悬液

1. 无菌条件下分离一只6-8周龄雌性Nur....

结果

高通量筛选实验的设计

在设计本荧光检测方法时，考虑了两个重要因素。首先，我们需要模拟一种生理条件，在该条件下，T细胞或B细胞的活化代表一种疾病状态（例如 移植物抗宿主病）。其次，细胞活化程度的评估应采用灵敏且定量的方法。目前，荧光检测是高通量筛选读数的主要选择之一，因其符合上述需求。^10,16 由于在 Nur77 激活后可获得稳定的 GFP 信号读数^GFP来源的T细胞或B细胞刺激均 体外 或 体内,¹² 我们的检测利用该策略区分非活化与活化细胞，作为筛选免疫调节化合物的工作模型。

讨论

已有多种检测方法被用于开发灵敏且可靠的高通量筛选（HTS）检测技术，包括比色法、发光法和荧光法。尽管比色法操作简便，但需要多次添加化学试剂，这些试剂可能干扰或破坏待测细胞。²³ 此外，该方法无法对生物学反应进行动态评估，因为药理学效应仅在特定终点进行测定。此外，若采用自动化高通量筛选，则该方法可能需要昂贵的机械臂设备。这些因素导致比色法检测因操作繁琐且灵敏度较低，难以满足高通量筛选的目标。²³ 尽管发光法已被提出作为比色法的替代方案，但这类发光检测在高通量筛选中的应用通常受限于需要裂解细胞。即使已开发出其他非裂解方案，生物发光信号的强度仍可能受到多种因素的阻碍，例如荧光素的吸收、辅因子的可利用性、pH值以及培养基或缓冲液的透明度，从而导致检测到的生物发光信号与细胞实际活性变化之间出现偏差。²⁴ 因此，大多数检测依赖于荧光方法。事实上，基于荧光的检测最初是利用一些小分子、高荧光性的有机化合物开发的，这些化合物可在细胞激活后监测多种细胞过程。总之，荧光检测具有更高的灵敏度，并且可轻松适用于高通量筛选.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nur77GFP 小鼠	杰克逊实验室	小鼠品系编号 016617	本单位动物设施内自建繁殖种群
96 孔 U 型培养板，无菌	VWR International	10062-902	使用磁珠活化 T 细胞
70 µm 细胞筛，无菌	康宁公司	352350	制备脾细胞悬液
5 ml 聚苯乙烯圆底试管，无菌	康宁公司	352058	制备脾细胞悬液
50 ml 聚丙烯锥底离心管，无菌	VWR International	89039-656	制备脾细胞悬液
10 ml 无针头注射器，无菌	贝克顿·迪金森公司	305482	研磨脾脏
T-25 培养瓶	Greiner Bio-One	690 175	用于 B 细胞活化期间的培养
5 ml 细胞培养皿，无菌	Greiner Bio-One	627 160	研磨脾脏
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	WISENT 公司	450-200-EL	脾细胞培养基组分
RPMI 1600 含碳酸氢钠和 L-谷氨酰胺	WISENT 公司	350-002-CL	脾细胞培养基组分
MEM 非必需氨基酸	WISENT 公司	321-010-EL	脾细胞培养基组分
HEPES 游离酸 1 M	WISENT 公司	330-050-EL	脾细胞培养基组分
丙酮酸钠溶液（100 mM）	WISENT 公司	600-110-EL	脾细胞培养基组分
胎牛血清（FBS）	WISENT 公司	080-910	脾细胞培养基和流式细胞术缓冲液组分
磷酸盐缓冲液（PBS）	WISENT 公司	311-010-CL	流式细胞术缓冲液组分
2-巯基乙醇（55 mM）	赛默飞世尔科技	21985-023	脾细胞培养基组分
T 细胞分离试剂盒	Stemcell Technologies	19851	用于分离 T 细胞
B 细胞分离试剂盒	Stemcell Technologies	19854	用于分离 B 细胞
小鼠 T 细胞激活剂 CD3/CD28 超顺磁性磁珠	赛默飞世尔科技	11452D	用于活化 T 细胞
细胞分离磁铁	Stemcell Technologies	18000	用于分离 T 细胞并去除磁珠
AffiniPure F(ab')2 片段 山羊抗小鼠 IgG + IgM (H+L)	Jackson ImmunoResearch 实验室有限公司	115-006-068	用于刺激 B 细胞
重组小鼠 IL-7	Peprotech	217-17	支持 T 细胞在活化期间的存活
重组 CD40L	R&D Systems	8230-CL/CF	用于刺激 B 细胞
抗小鼠 CD3 抗体	BD Pharmingen	561799	用于流式细胞术中 T 细胞染色
抗小鼠 CD19 抗体	BD Pharmingen	553786	用于流式细胞术中 B 细胞染色
Biomek FXp	PerkinElmer 公司	A31842	用于 24 小时孵育后重悬细胞
Opera Phenix 高内涵筛选系统	PerkinElmer 公司	HH14000000	用于分析 GFP/Hoechst 信号