心血管手术（如搭桥手术、血管成形术或支架植入术）后发生的再狭窄是一个严重影响手术长期效果的重要问题。理想的治疗方法应在抑制血管平滑肌细胞（VSMC）增殖的同时，促进内皮层的再生。本文介绍了一种可在体内同时评估VSMC增殖和内皮功能的模型。
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本文内容
摘要
摘要
动脉重建（无论是血管成形术还是旁路手术）均涉及医源性损伤，导致内皮破坏和血管平滑肌细胞（VSMC）增殖。常用的小鼠模型通常研究颈动脉和股动脉等小血管。本文描述了一种可在大血管中同时评估VSMC增殖和内皮屏障功能的体内系统。我们研究了C57BL/6小鼠肾下主动脉对损伤的反应。使用棉签尖端从左肾静脉至主动脉分叉处对主动脉进行30次贯穿全层的挤压损伤，每次持续5秒。通过常规组织学方法评估形态学变化。主动脉壁厚度从管腔表面测量至外膜。采用EdU掺入法，并结合DAPI和α-肌动蛋白复染，以显示VSMC增殖。通过Western Blot分析检测已知调节内膜增生形成的ERK1/2的激活情况。通过B细胞、T细胞和巨噬细胞的免疫组织化学染色评估炎症的影响。En face内皮切片通过扫描电子显微镜（SEM）观察。内皮屏障功能通过伊文思蓝染色进行测定。贯穿全层损伤导致主动脉壁增厚。该损伤诱导VSMC增殖，以损伤后第3天最为显著，并伴随ERK1/2的早期激活及p27kip1表达下降。损伤未引起血管壁内B细胞、T细胞或巨噬细胞浸润增加。损伤导致部分内皮细胞剥脱及细胞间连接丧失。损伤引起内皮屏障功能显著下降，但在7天后恢复至基线水平。小鼠贯穿全层钝性主动脉损伤模型为在大血管中同时研究VSMC增殖和内皮屏障功能提供了一个高效的系统。
引言
再狭窄 在心血管手术（如旁路手术、血管成形术或支架植入术）后，再狭窄是一个严重影响这些手术长期疗效的重要问题。所有血运重建手术均受到再狭窄的困扰。目前预防再狭窄的策略（如药物洗脱支架和药物涂层球囊）会同时抑制血管平滑肌细胞（VSMC）和内皮细胞（EC）的增殖。因此，这些干预措施虽然可防止由VSMC介导的再狭窄，但同时也阻碍了内皮层的再生。若缺乏完整的内皮层，患者必须长期使用强效抗血小板药物，以降低原位血栓形成的风险，但随之而来的出血并发症风险亦随之增加。理想的治疗方法应在抑制VSMC增殖的同时促进内皮再生。因此，有必要同时研究VSMC增殖和内皮屏障功能n 体内.
目前已有多种小鼠再狭窄模型1，包括颈动脉结扎和股动脉导丝损伤模型2。主动脉模型则包括支架植入3、球囊损伤4以及主动脉异体移植5。然而，现有所有模型均存在局限性。颈动脉结扎主要产生血流介导的新生内膜病变，但缺乏内皮损伤。此外，颈动脉和股动脉的细胞层数远少于人类血管，限制了其临床转化价值。小鼠主动脉直径约为1.3 mm，是唯一在尺寸上接近临床相关（冠状动脉）人类动脉的血管（3）。
尽管小鼠主动脉疾病模型具有一定的转化潜力，但现有模型存在局限性。这些模型需要高超的显微外科技术以及血管成形术球囊、支架等专用设备。本文中，我们介绍一种新颖且可重复的技术，可同时诱导血管平滑肌细胞增殖并破坏内皮屏障功能。
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方案
伦理声明：动物操作方案已获马里兰大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（方案编号 0416009），并依照国际实验动物评估和认证委员会（AAALAC-International）的标准进行。
1. 手术步骤
- 麻醉技术
- 使用蒸汽灭菌法在121 °C下对所有用于存活手术的器械灭菌30分钟。
- 诱导麻醉 通过 一个充有100% O₂的诱导舱2 和2.5%异氟烷输送 通过 精密蒸发器。诱导后，停止异氟烷，用O冲洗舱室2使用1.5-2%异氟烷维持麻醉 通过 口罩和1 L/min氧气2 通过吸入。
- 将诱导室和面罩均连接至活性炭废气吸附装置，以保护操作人员。通过检测对有害刺激（如脚趾夹捏）无反应来确认麻醉深度是否充分。
- 创建一个手术区域，包括一个带有等温垫的手术托盘，用于在手术期间提供保温支持。另需准备一个等温垫，用于动物在恢复笼中的保温支持。
- 动物准备
- 在10至12周龄的雄性C57BL/6小鼠上进行以下实验。
- 使用脱毛剂或装有40号刀头的电动剪毛器，去除动物从胸骨至腹股沟区域的腹部腹侧表面的毛发。
- 若使用脱毛剂，将该化合物涂抹于手术区域2-3分钟，然后用棉球擦除。我们使用市售的氢氧化钙与氢氧化钠混合化合物。
- 用70%酒精对肩部区域进行消毒，使用25号或更细的针头皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）。该处理可为动物提供术后镇痛。
- 将动物转移至手术区域，并置于仰卧位。
- 使用洁净的棉签或棉纱布蘸取8-12%聚维酮碘溶液擦拭手术区域进行消毒，随后用70%乙醇重复冲洗皮肤两次。
- 在双眼内放置眼用润滑剂，以减少角膜干燥的发生。用无菌手术巾覆盖手术区域。
- 手术技术
- 使用手术刀在剑突下方紧邻处开始，向骨盆方向延伸，做一长度约为2-2.5 cm的腹部正中切口。
- 游离小肠和十二指肠，并向右侧牵拉。将一条无菌棉纱布条用无菌生理盐水浸湿后卷起，用于填塞内脏以改善术野暴露。
- 将小肠移至腹腔右侧后，暴露腹膜后区域，并显露从左肾静脉至腹主动脉分叉处的腹主动脉。图1).
- 使用无菌棉签，施加30次连续的碾压，每次持续5秒。
- 取出包装物，使内脏恢复至自然位置。
- 用4-0可吸收单丝缝线（聚对二氧环己酮）连续缝合筋膜。皮肤用6-0不可吸收单丝缝线（尼龙）连续缝合。
- 恢复与术后护理
- 手术后，将动物置于铺有清洁垫料的恢复笼中，并放置于等温垫上继续提供体温支持，直至动物能够正常行走。在动物未表现出能够维持胸卧位之前，不得将其单独留下。
- 术后每小时监测动物一次，持续4小时。待动物行走恢复正常后，将其送回指定的饲养室。在完全恢复之前，该动物不得与其他动物同笼饲养。
- 术后前72小时内每日观察动物两次，此后每周至少观察三次。观察内容包括每周称重三次。
- 术后前72小时内，每天两次皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）。
2. 组织获取
- 安乐死方法
- 在预定时间点对动物实施安乐死。
- 使用精密挥发罐通过诱导舱输送100% O2和2.5%异氟烷以诱导麻醉。
- 为研究内皮完整性，向动物注射伊文思蓝染料。
注：伊文思蓝是一种带负电荷的偶氮染料，与白蛋白具有高亲和力，仅在内皮不完整时才能对血管进行染色6。 - 对于内皮完整性研究，在实施安乐死时，以生理压力向动物灌注5 mL 0.3%伊文思蓝染料，随后以生理压力灌注5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）持续5分钟。灌注过程中动物需维持在手术麻醉深度。
- 为研究内皮完整性，向动物注射伊文思蓝染料。
- 达到深度麻醉后，行胸骨切开术打开胸腔。在右心房制造切口以允许血液流出，并用21 G针头穿刺左心室，注入磷酸盐缓冲液（PBS），直至右心房流出液变澄清。
- 用PBS灌注后，通过腹正中切口进入腹腔。
- 再次将小肠移至腹腔右侧，暴露肾下腹主动脉，锐性分离主动脉周围组织，并从左肾静脉至腹主动脉分叉处完整切除主动脉。
- 将切除的主动脉保存于4%多聚甲醛溶液中，直至进行组织处理。
- 对于内皮完整性研究，将主动脉纵向切开，并用大头针固定于石蜡板上，充分暴露管腔内表面6。通过伊文思蓝染色程度对内皮完整性进行定性评估6。
- 对于其他组织学检测，根据所采用的组织学方法要求，将主动脉横向切片并包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中7。
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结果
将包埋于OCT中的主动脉进行横切，切片后采用苏木精-伊红染色，再用Verhoeff-Van Gieson（VVG）染色复染，以识别内弹力板和外弹力板7。与仅接受假手术处理（仅行剖腹术和小肠游离）的动物相比，挤压伤导致主动脉壁增厚。通过测量从外膜至管腔的距离评估管壁厚度，损伤后第3天管壁最厚（42.2 ± 1.7 µm vs. 22.1 ± 1.1 µm，仅剖腹术组）（图2A-B）。损伤还导致细胞形态更趋圆形，管腔表面轮廓不规则（图2C）。
损伤主动脉的管壁增厚至少部分由中膜血管平滑肌细胞增殖增加所介导。为了证实管壁增厚是由细胞增殖增加所致，而非细胞肥大，我们采用了EdU增殖检测。在此检测中，于小鼠安乐死前24小时经静脉给予胸腺嘧啶类似物5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）。EdU在DNA合成过程中被整合入DNA。通过点击化学反应（使用绿色...
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讨论
我们表征了一种小鼠主动脉损伤模型的作用，该模型可导致中膜增生和内皮屏障功能障碍。沿主动脉内膜部分内皮细胞脱落，伴随细胞间接触丧失以及细胞突起增强。相应地，内皮屏障功能显著受损，从而激活了有丝分裂原敏感的信号通路，导致血管平滑肌细胞增殖和血管壁增厚。该模型的优点在于，相较于其他主动脉疾病模型，其技术上更易于学习和操作，并且能够同时评估损伤后的增殖反应和内皮功能。本方案中的关键步骤是实际的挤压损伤操作。挤压损伤程度的差异可能导致损伤程度不同，从而引起平滑肌细胞增殖量的差异。在我们实验室中，减少这种变异性的一步措施是由一名对处理方式或实验条件设盲的科研人员完成全部的挤压损伤操作。
该模型的一个局限性在于其对临床相关人类疾病过程的可推广性。尽管在此模型中，血管平滑肌细胞（VSMCs）表现出早期强烈的增殖反应，但它并未模拟再狭窄的晚期事件，即未形成新生内膜。炎症介质（如细胞因子）的减少可能调控了这一过程。该现象可能是由于内皮在部分损伤后迅速恢复所致。类似于先前报道的兔血管挤压损伤模型13，免疫细胞的浸润程度较轻。在本研究中，我们利用细胞因子谱分...
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披露
本工作由美国退伍军人事务部职业发展奖（1IK2BX001553-01）（TSM）和血管治愈基金会E. J. Wylie奖学金（TSM）资助。
致谢
我们感谢马里兰大学医学院电子显微镜核心设施的Hsia Ru-ching博士在扫描电子显微镜样品处理过程中提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 眼部润滑剂 | Dechra | 17033-211-38 | 药物制剂 |
| 异氟烷 | VetOne | 502017 | 药物制剂 |
| 卡洛芬 | Zoetis | 26357 | 药物制剂 |
| 精密蒸发器 | Summit Medical | 10675 | 手术用品 |
| 活性炭吸附装置 | Bickford Inc. | 80120 | 手术用品 |
| 等温垫 | Harvard Apparatus | 50-7053-R | 手术用品 |
| 无菌棉签 | Fisher Scientific | 23-400-124 | 手术用品 |
| 4-0 可吸收单丝缝线 | Ethicon, Inc | J310 | 手术用品 |
| 5-0 不可吸收单丝缝线 | Ethicon,Inc | 1666 | 手术用品 |
| 21 号 × 1 英寸针头 | BD Biosciences | 305165 | 手术用品 |
| 25 号 × 1 英寸 针头 | BD Biosciences | 305125 | 手术用品 |
| 干式灭菌器 | Cellpoint | 7770 | 手术用品 |
| 精细剪刀 | Fine Science Tools | 14058-09 | 手术器械 |
| 艾德森镊子 | Fine Science Tools | 11006-12 | 手术器械 |
| 杜蒙特 #5 精细镊子 | Fine Science Tools | 11254-20 | 手术器械 |
| 万纳斯弹簧剪刀，3 mm 刃口 | Fine Science Tools | 15000-00 | 手术器械 |
| 持针器 | Fine Science Tools | 91201-13 | 手术器械 |
| 手术刀柄 #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | 手术器械 |
| 手术刀片 #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | 手术器械 |
| PBS | Lonza | 17-516F | 组织处理试剂 |
| 伊文思蓝 | Sigma-Aldrich | E2129 | 组织处理试剂 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | 组织处理试剂 |
| 模型蜡 | Bego | 40001 | 组织处理试剂 |
| OCT 包埋剂 | Tissue-Tek Sakura | 4583 | 组织处理试剂 |
| 梅耶苏木精染液 | Sigma-Aldrich | MHS16 | 免疫组织化学分析试剂 |
| 醇溶性伊红 Y 染液 | Sigma-Aldrich | HT110316 | 免疫组织化学分析试剂 |
| 弹性蛋白染色试剂盒 | Sigma-Aldrich | HT25A | 免疫组织化学分析试剂 |
| Click-it Edu Alexa-488 成像试剂盒 | Invitrogen | C10337 | 免疫组织化学分析试剂 |
| 抗 Erk1/2 抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | 免疫组织化学分析试剂 |
| 抗磷酸化 Erk1/2 抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | 免疫组织化学分析试剂 |
| 抗 p27kip1 抗体 | Cell Signaling Technology | 3698 | 免疫组织化学分析试剂 |
| 三氯乙酸 | Sigma-Aldrich | T9159 | 免疫组织化学分析试剂 |
参考文献
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