为了区分心肌细胞的细胞分裂与细胞周期变化，我们提供了使用两种转基因小鼠品系的实验方案：Myh6-H2B-mCh 转基因小鼠，用于明确鉴定心肌细胞的细胞核；以及 CAG-eGFP-anillin 转基因小鼠，用于区分细胞分裂与细胞周期的变化。
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本文内容
摘要
摘要
心肌细胞容易出现细胞周期的变异，例如内复制（在没有核分裂和胞质分裂的情况下持续进行DNA合成）和无胞质分裂的有丝分裂（发生核分裂但不发生胞质分裂）。这类非典型的细胞周期变异导致形成多倍体和多核细胞，而非产生新的细胞。因此，为了准确评估心脏细胞的更新与再生能力，正确识别心肌细胞的细胞核、每个细胞的核数量及其细胞周期状态至关重要。这一点在使用核标记物（如胸苷类似物、Ki-67、PCNA 或 pHH3）来判断细胞周期活性时尤为关键。本文介绍了识别心肌细胞及其核特征，并确定其细胞周期活性的方法。我们采用两种已发表的转基因系统：Myh6-H2B-mCh 转基因小鼠品系，用于明确鉴定心肌细胞的细胞核；CAG-eGFP-anillin 转基因小鼠品系，用于区分真正的细胞分裂与细胞周期变异。将这两种系统结合使用，可显著促进对心脏再生与可塑性的研究。
引言
准确鉴定心肌细胞核及其细胞周期状态，对于确定心肌组织的更新与再生具有至关重要的意义。这一点在使用核标记物（如pHH3、Ki-67或胸苷类似物）来识别细胞周期活性时尤为关键。由于成年哺乳动物心肌细胞的增殖能力极低1，若错误地将非心肌细胞核识别为表达增殖标志物的心肌细胞核，可能会对增殖检测的结果产生重大影响。此外，心肌细胞容易出现细胞周期的异常变化，例如内复制（endoreduplication）和无胞质分裂的有丝分裂（acytokinetic mitosis），这些过程导致细胞形成多倍体或多核状态，而非真正的细胞分裂。因此，在某些情况下，对常见细胞周期标志物抗体染色结果的解读并不具有确定性。
在此，我们介绍一种通过明确识别细胞核来直接鉴定出生后及成年阶段小鼠心肌细胞及其核性的方法，适用于原代分离的心肌细胞和厚组织切片。为此，我们使用了一种转基因小鼠品系，该品系在 Myh6 启动子驱动下特异性地在心肌细胞中表达人组蛋白 H2B 与 mCherry 的融合蛋白（Myh6-H2B-mCh）2将该小鼠品系与一种转基因增殖指示小鼠品系进行杂交，后者在普遍性鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子（CAG-eGFP-anillin）驱动下表达eGFP-anillin融合蛋白，从而可用于确定细胞周期状态。支架蛋白anillin特异性表达于细胞周期活跃的细胞中3
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方案
本方案中所有涉及动物的实验程序均符合波恩大学的伦理标准，并遵守欧洲议会关于用于科学目的动物保护的2010/63/EU指令指南。
1. 体外 出生后心肌细胞周期活性的可视化
- 出生后心肌细胞分离
- 实验前准备
- 配制培养基（IMDM，1% 青霉素/链霉素，1% 非必需氨基酸，0.1% β-巯基乙醇）；培养基1：加入FCS至终浓度2%；培养基2：加入FCS至终浓度20%。
- 用含0.1%明胶的PBS溶液包被96孔培养板（半生长面积：15 mm2）。
- 心脏解剖
- 准备一个含有15 mL PBS的培养皿并置于冰上。将两把镊子和小剪刀放入干式玻璃珠灭菌器中进行灭菌。
- 通过断头法处死新生转基因小鼠（CAG-eGFP-anillin/Myh6-H2B-mCh）。打开胸腔，取出心脏（方法见Ehler et al., 2013, J Vis Exp.; (79):50154. doi:10.3791/50154），并将心脏转移至预冷的PBS中。继续处理下一只小鼠。
- 若使用非纯合子交配对，需使用荧光显微镜鉴定转基因心脏。将心脏置于PBS中并在荧光显微镜下观察，使用适当的滤光片组检测eGFP-anillin表达（激发波长：4....
- 实验前准备
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结果
为了分析siRNA/miRNA对出生后心肌细胞周期活性的影响 体外，于出生后第3天（P3）分离双转基因Myh6-H2B-mCh/CAG-eGFP-anillin小鼠的心肌细胞，并转染可诱导细胞周期活性的miR1995、siRNA p27 和 siRNA Fzr1。与阴性对照相比（图1A），miR199- 的图片（图1B) 和 siRNA p27- (图1C) 转染的心肌细胞表现出细胞周期活性的激活。在eGFP-anillin小鼠模型中，可使用针对Fzr1的siRNA作为转染对照，因为抑制Fzr1会导致转染细胞核内eGFP-anillin融合蛋白的积累，而Fzr1的缺失会抑制APC活性Fzr1Fzr1 是后期促进复合物 E3 连接酶的辅助因子，可靶向 anillin 进行蛋白酶体降解。 图1D 显示转染siRNA Fzr1后3天的心肌细胞共聚焦显微镜整体.......
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讨论
关于心肌细胞在损伤后及组织稳态过程中是否能够重新进入细胞周期并进行分裂，目前仍存在争议。有关心肌细胞基础更新率的数值报道范围介于1%1至80%7之间。此外，在心脏发生病变后，也有研究报道在损伤边缘区域出现了细胞周期活性的激活以及新生心肌细胞的生成，其比例在0.0083%8到25–40%7之间。这些差异部分可归因于用于识别心肌细胞核的实验方法不同，而这一过程在组织学切片上以及细胞分裂过程中极具挑战性9。由于心肌细胞容易出现细胞周期的异常变化，因此区分真正的细胞分裂与内复制（endoreduplication）和无胞质分裂的有丝分裂（acytokinetic mitosis）至关重要，后两者会导致多倍体和多核细胞的形成。为了准确识别细胞分裂事件，必须可视化细胞分裂的关键标志结构，例如收缩环和中间体（midbodies），同时需测定双核心肌细胞所占的比例。我们已建立了一系列技术，可用于详细分析心肌细胞的细胞.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
感谢 S. Grünberg（德国波恩）和 P. Freitag（德国波恩）提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 cm 培养皿 | Sarstedt | 821472 | |
| 100 µm细胞滤筛 | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 352360 | |
| 2,3-丁二酮单肟 (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| G20x1 ½ 注射套管，Sterican | 布劳恩，美尔松根 | 4657519 | |
| 20号针头 | Becton Dickinson GmbH | 301300 | |
| 24孔板 | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 353047 | |
| 2-甲基丁烷 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3927.1 | |
| 37% 甲醛溶液 | AppliChem GmbH | A0936,1000 | |
| 三通旋塞阀 | B. Braun Medical Inc. | 16494C | |
| 50 mL 注射器 | B. Braun Medical Inc. | 8728810F | |
| 70% 乙醇 | Otto Fischar GmbH | 27669 | |
| Alexa Fluor 标记的二抗 | 杰克逊免疫研究实验室 | 115-605-205 | |
| α-辅肌动蛋白 EA-53，小鼠 IgG | Sigma-Aldrich，施泰因海姆 | A7811 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| 细胞培养微孔板，96 孔，半面积 | Greiner bio-one | 675986 | |
| 胶原酶B | 罗氏 | 11088815001 | |
| 共聚焦显微镜 Eclipse Ti-E | 尼康 | ||
| 冷冻切片机 CM 3050S | Leica | ||
| 驴血清 | 杰克逊免疫研究公司，萨福克，英国 | 017-000-121 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| 胎牛血清 | PromoCell，海德堡 | ||
| 甲醛溶液（4%） | PanReac AppliChem | A3697 | |
| 猪皮明胶，A型 | Sigma-Aldrich，施泰因海姆 | G2500 | |
| 玻璃盖玻片 | VWR | 631-0146 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| 海德堡延伸管 | IMPROMEDIFORM GmbH | MF 1833 | |
| 肝素钠 | Ratiopharm | 5394.02.00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HistoBond 显微镜载玻片 | Marienfeld | 0810000 | |
| Hoechst 33342（1 mg/mL | Sigma Aldrich，多夫基兴 | B2261 | |
| 胰岛素注射器 | Becton Dickinson GmbH | 300334 | |
| 艾斯科夫’s 改良杜尔贝科’s Medium（IMDM） | Gibco/Life Technologies，达姆施塔特 | 21980-032 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| 层粘连蛋白 | 康宁 | 354221 | |
| 激光扫描显微镜Eclipse Ti | 尼康仪器，Dü杜塞尔多夫 | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies，达姆施塔特 | 13778075 | |
| 小鼠 IgG Cy5（驴源） | 杰克逊免疫研究实验室 | 715-175-151 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 微量离心管 | Sarstedt | 72690 | |
| 微型振荡器 | VWR | 12620-940 | |
| mirVana miRNA 模拟物，hsa-miR199a-3p | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4464066 | |
| 活检模具 | Sakura Finetek/ VWR | 4565 | |
| M-slide 8孔ibiTreat | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | 默克密理博 | 567530 | |
| 阴性对照（随机RNA） | Ambion/Thermo Fischer Scientific | AM4611 | |
| 新生小鼠心脏解离试剂盒 | 美天旎生物技术，贝尔吉施格拉德巴赫 | 130-098-373 | |
| NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64位 | 尼康仪器，Dü杜塞尔多夫 | ||
| 非必需氨基酸，NEAA | Gibco/Life Technologies，达姆施塔特 | 11140-035 | |
| Opti-MEM 低血清培养基 | Gibco | 51985-026 | |
| P21-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| P27-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco/Life Technologies，达姆施塔特 | 15140-122 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich，施泰因海姆 | 14190-094 | |
| 含 DABCO 的聚乙烯醇封片剂®抗荧光淬灭 | Sigma-Aldrich | 10981 | |
| RNase A | Qiagen | 1007885 | |
| RNaseZap | Invitrogen/Life Technologies，达姆施塔特 | AM9780 | |
| 样品容器 | Vitlab | 80731 | |
| 血清移液管 | 格雷纳 | 607180 | |
| 软件 NIS Elements | 尼康 | ||
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue-Tek O.C.T. 化合物 | Sakura Finetek/ VWR | 25608-930 | |
| ToPro3 碘化物 (642/661) | 分子探针/ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X | Fluka | 93418 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93418 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| 荧光素标记的麦胚凝集素（WGA） | Vector Laboratories | VEC-FL-1021-5 | |
| α-肌动蛋白交联蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich，施泰因海姆 | M3148 |
参考文献
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell ....
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