Method Article

细胞周期变化的可视化和核测定心肌出生后

DOI:

10.3791/55204

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February 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

In This Article

Summary

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为了区分心肌细胞中的细胞分裂和细胞周期变化，我们提出了使用两种转基因小鼠系的方案：Myh6-H2B-mCh 转基因小鼠，用于明确鉴定心肌细胞核，以及 CAG-eGFP-anillin 小鼠，用于区分细胞分裂和细胞周期变化。

Abstract

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心肌细胞容易受到细胞周期变化的影响，例如内重复（连续轮次的 DNA 合成，没有核肌运动和胞质分裂）和无细胞动力学有丝分裂（核细胞运动但没有胞质分裂）。这种非典型细胞周期变化导致多倍体和多核细胞，而不是细胞分裂。因此，要确定心脏周转和再生，正确识别心肌细胞核、每个细胞的细胞核数量及其细胞周期状态至关重要。对于使用核标志物来识别细胞周期活性尤其如此，例如胸苷类似物 Ki-67、PCNA 或 pHH3。在这里，我们提出了识别心肌细胞及其细胞核以及确定其细胞周期活性的方法。我们使用两种已发表的转基因系统：Myh6-H2B-mCh 转基因小鼠系，用于明确鉴定心肌细胞核，以及 CAG-eGFP-anillin 小鼠系，用于区分细胞分裂和细胞周期变异。这两个系统结合在一起，简化了心脏再生和可塑性的研究。

Introduction

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心肌细胞核和细胞周期状态的正确识别是对心肌的营业额和再生的决心至关重要。这是一种使用核标记物，如pHH3，Ki-67的，或胸苷类似物，用于识别细胞周期活动的情况尤其如此。如成年哺乳动物的心肌细胞的增殖能力是非常小的图1中 ，核阳性心肌细胞核的增殖标志物可以使在一个增殖试验的结果的一个关键差的误识别。此外，心肌细胞很容易在细胞周期的变化，如核内复制和acytokinetic有丝分裂，这导致多倍体和多核细胞，而不是在细胞分裂。为此，对常见的细胞周期标记物的抗体染色的解释不是在所有情况下定论。

在这里，我们提出了直forwa方法小鼠心肌细胞的RD承认和其核的明确的身份标识在产后和成年阶段的本土分离出的细胞和厚厚的组织切片的nuclearity。为此目的，与MYH6启动子（MYH6-H2B-MCH）的控制下，由人类组蛋白H2B和mCherry融合蛋白的特异性心肌表达的转基因小鼠品系使用2。杂交育种用的转基因增殖指示剂鼠标线这个鼠标线，其中一个的eGFP-anillin融合蛋白的表达是与CMV增强无处不鸡肌动蛋白启动子的控制下（CAG-EGFP-anillin），允许测定的细胞周期状态。支架蛋白anillin在细胞周期特异性表达的活性细胞3，和在细胞周期中其差的亚细胞定位允许活跟踪细胞周期进程用高分辨率的M-相EF"> 4，因此，双....

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Protocol

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该协议涉及动物的所有程序均符合波恩大学的道德标准，并从2010年指令欧洲议会/ 63 / EU的用于科学目的的动物保护准则的规定。

1. 在产后心肌细胞周期活动的体外可视化

  1. 产后心肌细胞分离
    1. 实验前准备工作
      1. 制备培养基（IMDM，1％青霉素/链霉素，1％非必需氨基酸，0.1％β巯基乙醇）;介质1:加FCS至2％;介质2:添加FCS至20％。
      2. 涂层的96孔培养皿（半生长面积:15 平方毫米）用在PBS中的溶液0.1％明胶。
    2. 心脏解剖
      1. 制备培养皿用15mL PBS中，并将其存储在冰上。通过把它们放在干燥的玻璃珠灭菌消毒2镊子和小剪刀。
      2. 断头牺牲新生转基因小鼠（CAG-EGFP-anillin / MYH6-H2B-MCH）。打开胸腔，解剖心脏出来，如Ehler 等人。 ，2013（J显示精通;（79）:50154 DOI:10.3791 / 50154），并转移到冰冷的PBS。移动到下一个鼠标。
      3. 如果使用非纯合子繁殖对，确定与荧光显微镜转基因心。放入PBS的心在荧光显微镜下。检查EGFP-anillin表达式（例:488纳米; EM:509纳米），H2B-MCH表达（例:587纳米; EM:610纳米）用适当的过滤器设置。

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Results

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为了分析的siRNAs / miRNA的体外产后心肌细胞，双转基因MYH6-H2B-MCH / CAG-EGFP-anillin小鼠心肌细胞的细胞周期活动的影响被隔绝在3日龄（P3）和与转细胞周期活动诱导miR199 5，P27的siRNA，和siRNA Fzr1。相比于阴性对照（ 图1A），miR199-（ 图1B）和siRNA p27-（ 图1C）的照片转染心肌细胞表现出细胞周期活性的诱导。在EGFP-anillin小鼠模型中，针对Fzr1的siRNA可用作转染对照，作为Fzr1的抑制导致的eGFP-anillin融合蛋白在转染细胞的细胞核中积累和Fzr1的损失导致的APC的抑制Fzr1。 Fzr1是后期促进复合物的E3连接酶的辅因子，其中用于龙眼靶向anillinOMAL降解。 图1D示出的siRNA Fzr1转染心肌细胞转染后3天，指示〜45％.......

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Discussion

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有一个争论的心肌细胞是否能够重新进入细胞周期和损伤后和组织稳态期间分割。对于心肌细胞的基本成交值已被赋予在范围为1％1和80％的7之间。还心脏损伤后，细胞周期活性的诱导和新的心肌细胞的产生已经报道在边界区，具有值0.0083％8和25之间- 40％7。这些差异可部分通过不同的实验方法进行说明，以确定心肌细胞核，这一过程是在组织切片9和细胞分裂期间非常具有挑战性。作为心肌细胞很容易在细胞周期的变化，这是极其重要的，从核内复制和acytokinetic有丝分裂，这导致多倍体和多核细胞区分开正宗细胞分裂。对于细胞分裂的识别，有必要以可视化的细胞分裂的标志，如收缩环和midbodies，以及确定双核心肌细胞的百分比。我们开发的技术来分析在详细的心肌细胞周期活动，并确定在分离的细胞或在厚的部分其nuclearity的程度。

值得注意的是，EGFP-anil.......

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Disclosures

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提交人声明，他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgements

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我们感谢 S. Grünberg （德国波恩） 和 P. Freitag （德国波恩） 提供的技术援助。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm 培养皿Sarstedt 821472
100 µm 细胞过滤器Becton Dickinson GmbH/Falcon352360
2,3-丁二酮一肟 （BDM）Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½注射套管，StericanBraun，Melsungen4657519
20 号针头Becton Dickinson GmbH301300
24 孔板Becton Dickinson GmbH/Falcon353047
2-甲基丁烷Carl Roth GmbH + Co. KG3927.1
37% 甲醛溶液AppliChem GmbH A0936,1000
三通旋塞阀B. Braun Medical Inc.16494C
50 mL 注射器B. Braun Medical Inc.8728810F
70% 乙醇Otto Fischar GmbH27669
Alexa-Fluor 偶联二抗Jackson ImmunoResearch115-605-205
α-Aktinin EA-53，小鼠 IgGSigma-Aldrich，SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
细胞培养微孔板，96 孔，半面积Greiner bio-one675986
胶原酶 B罗氏11088815001
共聚焦显微镜 Eclipse Ti-E尼康
低温恒温器 CM 3050S徕卡
驴血清Jackson Immuno Research，萨福克，GB017-000-121
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水Sigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
胎牛血清PromoCell，海德堡
甲醛溶液 （4%）PanReac AppliChemA3697
来自猪皮的明胶，A 型Sigma-Aldrich，SteinheimG2500
玻璃盖玻片VWR631-0146
葡萄糖Sigma-AldrichG7021
海德堡延长管IMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
肝素-钠比例药5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
HistoBond 显微镜载玻片Marienfeld0810000
Hoechst 33342 （1 mg/mL）Sigma Aldrich， TaufkirchenB2261
胰岛素注射器Becton Dickinson GmbH300334
Iscove's ModifiedDulbecco's 培养基 （IMDM）Gibco/Life Technologies，达姆施塔特21980-032
KClSigma-AldrichP9333
层粘连蛋白康宁354221
激光扫描 Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments，Düsseldorf
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies，达姆施塔特13778075
小鼠 IgG Cy5（驴）Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
离心管Sarstedt72690
迷你摇床VWR12620-940
mirVana miRNA 模拟物，hsa-miR199a-3pAmbion/Thermo Fischer Scientific4464066
活检模具Sakura Finetek/ VWR4565
M 载玻片 8 孔 ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
阴性对照（加扰RNA）Ambion/Thermo Fischer ScientificAM4611
新生儿心脏解离试剂盒Miltenyi Biotech，Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments，Düsseldorf
非必需氨基酸，NEAAGibco/Life Technologies，达姆斯塔德11140-035
Opti-MEM，减血清培养基Gibco51985-026
P21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
青霉素/链霉素Gibco/Life Technologies，达姆施塔特15140-122
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）Sigma-Aldrich，Steinheim14190-094
聚乙烯醇封固剂，含 DABCO®、抗褪色Sigma-Aldrich10981
RNase AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen/Life Technologies，达姆施塔特AM9780
样品容器Vitlab80731
血清移液管Greiner607180
软件 NIS Elements康
蔗糖Sigma-AldrichS0389
Tissue-Tek OCT 化合物Sakura Finetek/ VWR25608-930
ToPro3 碘化物 （642/661）分子探针/ThermoFisher ScientificT3605
TrisSigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
胰蛋白酶Sigma-AldrichT1426
小麦胚芽凝集素 （WGA） 荧光素标记Vector LaboratoriesVEC-FL-1021-5
&α;-肌动蛋白抗体Sigma-AldrichA7811
β-巯基乙醇Sigma-Aldrich， SteinheimM3148
剂 微量 尼

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell ....

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