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方法文章

表面人诺如病毒检测的拭子采样方法

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DOI：

10.3791/55205

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2017年2月6日

 ,  , 
1Division of Viral Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

本文内容

摘要

开发并评估了一种基于大泡沫材料的采样方法，用于检测和定量环境硬质表面上的诺如病毒。

摘要

诺如病毒是全球范围内流行性和散发性胃肠炎的主要病因。由于大多数感染是通过人与人之间的直接接触传播，或通过环境表面或食物间接传播，因此在诺如病毒暴发期间，被污染的物体表面和无生命表面是病毒传播的重要媒介。

我们开发并评估了一种使用宏孔泡沫拭子从硬质表面检测和分型人诺如病毒的方案。与纤维头拭子或防静电擦拭布相比，宏孔泡沫拭子可从面积达700 cm2的马桶座圈表面回收病毒（回收率范围为1.2–33.6%）。该方案包括从拭子中提取病毒以及利用离心柱进一步浓缩病毒RNA的步骤。总计217份从诺如病毒胃肠炎暴发的邮轮和长期护理机构表面采集的拭子样本中，有127份（58.5%）经RT-qPCR检测呈GII型诺如病毒阳性。其中29份（22.8%）成功完成了基因分型。综上所述，采用我们所开发的方案检测环境表面的诺如病毒，有助于在暴发期间评估环境污染程度，并在无法获得临床样本时实现病毒检测；同时也有助于监测环境干预措施的有效性。

引言

全球范围内，人诺如病毒是流行性和散发性急性胃肠炎的主要病因1,2,3。该病毒具有极强的传染性，可通过人与人之间的直接接触传播，也可通过接触受污染的食物、水或环境表面间接传播。诺如病毒可长期排出体外，且已有文献证实其在环境表面可长期存活1,2,3。在排病毒高峰期，每克粪便可释放数十亿个病毒颗粒，而呕吐物中所含的病毒颗粒数量也足以引起感染4,5,6,7,8,9,10。此外，病毒可在无生命表面与人类皮肤之间轻易转移2,11,12。因此，对环境污染状况的监测有助于疫情调查，并可评估清理和消毒措施的有效性。

已有多种环境采样方案被用于检测轮状病毒、大肠杆菌噬菌体MS2、猫杯状病毒（FCV）和细菌噬菌体P2213,14,15,16。然而，这些研究中描述的验证条件，包括快速干燥（ <1小时）和较小的表面面积（25 × 100 cm2），可能无法充分代表实际现场环境。此外，环境表面预期的污染水平较低，因此需要能够检测极少量病毒颗粒的检测方案。

我们开发了一种基于大孔泡沫的环境表面采样方法，用于诺如病毒的检测与分型。该方法已在多次诺如病毒暴发事件中得到验证。本方案包括：1）如何从环境表面采集拭子样本；2）在样本采集及运送至实验室过程中，如何最大限度地保持样本完整性；3）实验室中对诺如病毒进行检测与分型的方法。

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方案

1. 现场拭子采样

  1. 戴上一副干净的手套。
  2. 使用卷尺或直尺测量采样区域的尺寸，切勿触碰表面。尽量准确估算面积，并填写报告表（补充表1）。
  3. 检查拭子采样 kit 是否有泄漏，并对样本运输袋和拭子采样 kit 进行标记。
  4. 按以下方式在采样区域移动拭子：水平方向擦拭一次，垂直方向擦拭一次，对角线方向擦拭一次。采样表面面积不得超过 700 cm2。
  5. 将每根拭子放入试管中，并牢固拧紧管盖。

2. 拭子的储存与运输至实验室

  1. 将拭子在 4 °C 下保存，最长可保存 48 小时。如需更长时间保存，请将拭子置于 -20 °C（或 -70 °C）保存。
  2. 将试管置于 0-4 °C 环境中即使用冰袋并在运输过程中置于保温容器内，于采集后24-48小时内送至实验室。

3. 病毒浓缩、病毒RNA提取与纯化

注意：除非另有说明，所有离心步骤均使用台式离心机，在室温下以 5,000 × g 离心 5 分钟。使用通用核酸提取缓冲液（UNEX 缓冲液）时需格外小心。请佩戴护目镜或面罩。

  1. 为每个样本标记一个15 mL离心管和一个RNA Midi柱。每次实验均需包含一个阴性提取对照。
  2. 为准备10根拭子的裂解液，将25 mL UNEX缓冲液与25 mL PBST（含0.02% Tween-80的pH 7.2 PBS）混合。
  3. 向50 mL裂解液中加入50 µL的大肠杆菌噬菌体MS2悬液（106 PFU/µL）。
  4. 将一根拭子放入15 mL离心管中，加入5 mL裂解液，混匀并在室温下孵育10分钟。
  5. 向每根离心管中加入5 mL 100%乙醇，涡旋振荡10秒。
  6. 小心地从15 mL离心管中取出拭子（管内含有UNEX缓冲液），轻轻挤压拭子管壁以去除多余液体，然后弃去拭子。剩余液体体积应为9–10 mL之间。

4. 中型柱法病毒核酸提取

  1. 小心将步骤 3.6 中的 4.5 mL UNEX/乙醇混合液转移至一个中量柱上，离心并弃去滤液。
  2. 将相同混合液的另外 4.5 mL 加入同一中量柱中，离心并弃去滤液。
  3. 第一次洗涤时，向中量柱中加入 3.5 mL 70% 乙醇，离心并弃去滤液。
  4. 第二次洗涤时，再向中量柱中加入 3.5 mL 70% 乙醇，离心并弃去滤液。
  5. 干燥离心步骤：对中量柱进行离心，以彻底去除残留的乙醇（乙醇残留可能对病毒 RNA 回收产生不利影响）。
  6. 将中量柱放入一个新的 15 mL 离心管中。向中量柱中加入 250 µl 洗脱缓冲液；静置 1 分钟后再进行离心，以获得最高的病毒 RNA 回收率。
  7. 将提取的核酸在 -70 °C 下保存，或立即进入步骤 5。

5. 使用RNA纯化与浓缩试剂盒浓缩病毒核酸

  1. 向上一步骤4.7中洗脱的250 µL RNA中加入500 µL RNA结合缓冲液，涡旋振荡10秒。
  2. 加入750 µL 100%乙醇，涡旋振荡10秒。
  3. 为每个样本标记一个离心柱。将750 µL样本加入离心柱中。
  4. 在12,000 x g离心力下离心离心柱1分钟，弃去穿流液。
  5. 将剩余的750 µL样本加入同一离心柱中，在12,000 x g离心力下离心1分钟。
  6. 预洗步骤：向每个离心柱中加入400 µL RNA Prep缓冲液，在12,000 x g离心力下离心1分钟，弃去穿流液。
  7. 第一次洗涤：向每个离心柱中加入800 µL RNA洗涤缓冲液，在12,000 x g离心力下离心1分钟，弃去穿流液。
  8. 第二次洗涤：向离心柱中加入400 µL RNA洗涤缓冲液，在12,000 x g离心力下离心1分钟，弃去穿流液。
  9. 干燥离心：将离心柱在12,000 x g离心力下离心2分钟，以彻底去除残留的洗涤缓冲液。
  10. 小心地将离心柱转移至一支洁净的1.5 mL微量离心管中。
  11. 向离心柱中加入25 µL洗脱缓冲液，室温孵育1分钟。此步骤可提高病毒RNA的回收率。
  12. 在10,000 x g离心力下离心1分钟，收集RNA。
  13. 可直接进入RT-qPCR步骤（步骤6），或将RNA在-70 °C保存。

6. 基因型组I和II诺如病毒及大肠噬菌体MS2的多重RT-qPCR检测（补充表2）

  1. 清洁工作台面、移液器和离心机时使用RNase去污染溶液，以减少可能的污染。
  2. 在冰上解冻RT-qPCR试剂。在冰上解冻RNA（在单独的区域/房间内进行）。
  3. 确定反应数量，并额外增加至少10%的反应数（例如 如果需要进行10个反应，则配制11个反应的预混液。
  4. 涡旋混合各母液组分（25x RT-qPCR 酶除外），持续 5 秒。用手指轻弹管壁，小心混匀酶液。
  5. 将主混合液组分短暂离心5秒。
  6. 根据试剂盒说明书配制用于诺如病毒GI和GII实时RT-PCR检测的主混合液，并在1.5 ml微量离心管中加入诺如病毒特异性寡核苷酸引物和探针（补充材料 表3).
  7. 用移液器上下吹打5-10次混匀主混合液（不建议使用涡旋振荡）。将22 µL主混合液分装至实时荧光定量PCR 96孔板的每个孔中。
  8. 涡旋混匀RNA样品5秒，并通过短暂（5秒）离心收集。
  9. 向RT-qPCR板中加入3 µL样本RNA以及GI和GII阳性对照（按照模板操作） 表2）。在无模板对照（NTC）孔中加入 3 µL 无核酸酶水。
  10. 用光学粘性膜密封实时检测板。
  11. 将实时检测板在1,300 × g条件下小心离心1分钟，以去除孔中可能存在的气泡或液滴。
  12. 设置实时荧光定量PCR仪，并设定以下扩增循环条件：（1）反转录步骤：45 °C 反应10 min；（2）Taq DNA聚合酶激活：95 °C 反应10 min；（3）45个循环：95 °C 变性15 s，60 °C 延伸60 s。

7. 擦拭样本中诺如病毒的定量

  1. 检查阳性和阴性对照的结果，以验证 RT-qPCR 结果（补充表3).
  2. 确定每条标准曲线是否符合补充材料中给出的可接受值 表 2 并使用公式1计算标准曲线的整体标准偏差。
    （公式 1）% 效率 = 100 × 10(平均 Ct 值 - 截距) / 斜率.
  3. 如果PCR仪的软件未计算每条标准曲线的斜率，则需手动确定斜率和R2使用统计软件通过回归分析计算数值例如 Excel、SPSS 或 SAS）。此外，根据公式 I 计算标准曲线的扩增效率百分比（% efficiency）
  4. 根据符合规定标准曲线，记录热循环仪软件计算的所有测试样本的RNA拷贝数 补充表4重新运行任何带有标准曲线的样本 t不符合标准或出现假阳性对照的结果。检查作为内参对照添加的大肠杆菌噬菌体MS2的Ct值，以监测PCR抑制情况。
  5. 通过将第7.2步计算得到的RNA拷贝数乘以总RNA洗脱液体积（25至50 µL）与用于RT-qPCR反应的RNA体积（3至5 µL）的比值，确定每个样本的RNA总拷贝数。或者，通过将RNA总拷贝数除以物体表面积（cm²），计算RNA密度。2) 进行分析。

8. 通过半巢式常规 PCR 扩增对实时 RT-PCR 阳性样本进行基因分型

  1. 为RT-PCR检测的每对引物制备第一轮主混合液（补充表 2 和 5）。
  2. 将5 µL诺如病毒阳性RNA加入20 µL主混合液中。
  3. 在以下条件下运行RT-PCR：(1) 42 °C下反转录30分钟；(2) 95 °C激活Taq DNA聚合酶15分钟；(3) 95 °C变性30秒、50 °C退火30秒、72 °C延伸60秒，共40个循环。40个循环后，在72 °C继续延伸10分钟。
  4. 为RT-PCR检测的每对引物制备第二轮主混合液（补充表 2 和 5）。
  5. 在每个反应管中加入23 µL主混合液和2 µL第一轮RT-PCR产物（理想情况下，第一轮产物应使用无RNase水稀释至1/10）。
  6. 重复步骤8.3。
  7. 用100 mL 1×Tris-乙酸盐-EDTA缓冲液（40 mM Tris，20 mM乙酸，1 mM EDTA，pH 8.3）配制2%琼脂糖凝胶。将混合物在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解，冷却至60–70 °C后，每100 mL凝胶加入10 µL核酸染料，混匀后倒入模具并插入梳子。让凝胶静置至少30分钟使其凝固。
  8. 将每份RT-PCR产物15 µL与3 µL 6×上样缓冲液混合。每样取15 µL上样，在100 V电压下电泳1小时。
  9. 从凝胶中切下适当大小的目标RT-PCR片段（GI型为330 bp，GII型为341 bp），使用商品化的凝胶回收试剂盒纯化RNA。纯化后的PCR产物可用于Sanger测序。

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结果

图1展示了拭子采样流程的流程图。该流程包括四个主要步骤：1）样本采集，2）样本储存与运输，3）病毒RNA的纯化与浓缩，以及4）反转录定量PCR检测与基因分型。

核酸提取流程图；诺如病毒检测和基因分型的逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）设置。
图1：环境表面样本中诺如病毒检测的最终方案流程图 请点击此处查看该图的放大版本。

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讨论

诺如病毒对人类的50%感染剂量介于18至10之间3 病毒颗粒20因此，即使表面存在低水平污染，也可能对公共卫生构成风险。本研究评估了拭子采样方案的多个方面，包括：1）不同拭子材料，2）运输过程中拭子的储存条件，3）病毒RNA浓度，以及4）使用大肠杆菌噬菌体MS2作为内部提取对照。

直到最近，仅对棉质、聚酯、尼龙和抗静电擦拭材料制成的拭子进行了性能评估，并建议用于现场检测13,14,15,21,22。其中，ISO 15216 检测方案推荐使用棉质拭子从食品制备表面和物体表面检测诺如病毒和甲型肝炎病毒23。然而，关于棉质拭子在实际现场条件下对大面积...

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披露

作者无利益冲突。本报告中的发现和结论仅代表作者观点，不一定代表美国疾病控制与预防中心的官方立场。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂盒的通用名称
<强>大泡沫拭子预润湿 EnviroMax 棉签套装 Puritan2588060PFUW
<强>RNA裂解缓冲液 CDC UNEX 缓冲液Microbiologics货号 MR0501
<强>RNA提取离心柱中型层析柱Omega Biotek货号 R6664-02
<强>RNA纯化离心柱Zymol RNA 纯化浓缩试剂盒 Zymo Research货号 R1016
<强>实时荧光定量RT-PCR试剂盒AgPath试剂盒 一步法RT-PCR试剂盒Life Technologies货号 4387391
<强>常规RT-PCR试剂盒Qiagen 一步法 RT-PCR 试剂盒Qiagen试剂盒货号 210212
<强>凝胶回收试剂盒Qiagen QIAquick 胶回收试剂盒Qiagen试剂盒货号 28704 或 28706
大肠杆菌噬菌体MS2ATCC货号 15597-B1
RNA截断转录本
实时荧光定量PCR平台应用生物系统公司Model ABI 7500
光学96孔反应板赛默飞世尔科技货号 4316813
MicroAmp 透明粘性膜 赛默飞世尔科技货号 4306311

参考文献

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