开发并评估了一种基于大泡沫材料的采样方法，用于检测和定量环境硬质表面上的诺如病毒。
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摘要
摘要
诺如病毒是全球范围内流行性和散发性胃肠炎的主要病因。由于大多数感染是通过人与人之间的直接接触传播，或通过环境表面或食物间接传播，因此在诺如病毒暴发期间，被污染的物体表面和无生命表面是病毒传播的重要媒介。
我们开发并评估了一种使用宏孔泡沫拭子从硬质表面检测和分型人诺如病毒的方案。与纤维头拭子或防静电擦拭布相比，宏孔泡沫拭子可从面积达700 cm2的马桶座圈表面回收病毒（回收率范围为1.2–33.6%）。该方案包括从拭子中提取病毒以及利用离心柱进一步浓缩病毒RNA的步骤。总计217份从诺如病毒胃肠炎暴发的邮轮和长期护理机构表面采集的拭子样本中，有127份（58.5%）经RT-qPCR检测呈GII型诺如病毒阳性。其中29份（22.8%）成功完成了基因分型。综上所述，采用我们所开发的方案检测环境表面的诺如病毒，有助于在暴发期间评估环境污染程度，并在无法获得临床样本时实现病毒检测；同时也有助于监测环境干预措施的有效性。
引言
全球范围内，人诺如病毒是流行性和散发性急性胃肠炎的主要病因1,2,3。该病毒具有极强的传染性，可通过人与人之间的直接接触传播，也可通过接触受污染的食物、水或环境表面间接传播。诺如病毒可长期排出体外，且已有文献证实其在环境表面可长期存活1,2,3。在排病毒高峰期，每克粪便可释放数十亿个病毒颗粒，而呕吐物中所含的病毒颗粒数量也足以引起感染4,5,6,7,8,9,10。此外，病毒可在无生命表面与人类皮肤之间轻易转移2,
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方案
1. 现场拭子采样
- 戴上一副干净的手套。
- 使用卷尺或直尺测量采样区域的尺寸，切勿触碰表面。尽量准确估算面积，并填写报告表（补充表1）。
- 检查拭子采样 kit 是否有泄漏，并对样本运输袋和拭子采样 kit 进行标记。
- 按以下方式在采样区域移动拭子：水平方向擦拭一次，垂直方向擦拭一次，对角线方向擦拭一次。采样表面面积不得超过 700 cm2。
- 将每根拭子放入试管中，并牢固拧紧管盖。
2. 拭子的储存与运输至实验室
- 将拭子在 4 °C 下保存，最长可保存 48 小时。如需更长时间保存，请将拭子置于 -20 °C（或 -70 °C）保存。
- 将试管置于 0-4 °C 环境中即使用冰袋并在运输过程中置于保温容器内，于采集后24-48小时内送至实验室。
3. 病毒浓缩、病毒RNA提取与纯化
注意：除非另有说明，所有离心步骤均使用台式离心机，在室温下以 5,000 × g 离心 5 分钟。使用通用核酸提取缓冲液（UNEX 缓冲液）时需格外小心。请佩戴护目镜或面罩。
- 为每个样本标记一个15 mL离心管和一个RNA ....
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结果
图1展示了拭子采样流程的流程图。该流程包括四个主要步骤：1）样本采集，2）样本储存与运输，3）病毒RNA的纯化与浓缩，以及4）反转录定量PCR检测与基因分型。
图1：环境表面样本中诺如病毒检测的最终方案流程图 请点击此处查看该图的放大版本。
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讨论
诺如病毒对人类的50%感染剂量介于18至10之间3 病毒颗粒20因此，即使表面存在低水平污染，也可能对公共卫生构成风险。本研究评估了拭子采样方案的多个方面，包括：1）不同拭子材料，2）运输过程中拭子的储存条件，3）病毒RNA浓度，以及4）使用大肠杆菌噬菌体MS2作为内部提取对照。
直到最近，仅对棉质、聚酯、尼龙和抗静电擦拭材料制成的拭子进行了性能评估，并建议用于现场检测13,14,15,21,22。其中，ISO 15216 检测方案推荐使用棉质拭子从食品制备表面和物体表面检测诺如病毒和甲型肝炎病毒23。然而，关于棉质拭子在实际现场条件下对大面积.......
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披露
作者无利益冲突。本报告中的发现和结论仅代表作者观点，不一定代表美国疾病控制与预防中心的官方立场。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂盒的通用名称 | |||
| <强>大泡沫拭子 | 预润湿 EnviroMax 棉签套装 | Puritan | 2588060PFUW |
| <强>RNA裂解缓冲液 | CDC UNEX 缓冲液 | Microbiologics | 货号 MR0501 |
| <强>RNA提取离心柱 | 中型层析柱 | Omega Biotek | 货号 R6664-02 |
| <强>RNA纯化离心柱 | Zymol RNA 纯化浓缩试剂盒 | Zymo Research | 货号 R1016 |
| <强>实时荧光定量RT-PCR试剂盒 | AgPath试剂盒 一步法RT-PCR试剂盒 | Life Technologies | 货号 4387391 |
| <强>常规RT-PCR试剂盒 | Qiagen 一步法 RT-PCR 试剂盒 | Qiagen试剂盒 | 货号 210212 |
| <强>凝胶回收试剂盒 | Qiagen QIAquick 胶回收试剂盒 | Qiagen试剂盒 | 货号 28704 或 28706 |
| 大肠杆菌噬菌体MS2 | ATCC | 货号 15597-B1 | |
| RNA截断转录本 | |||
| 实时荧光定量PCR平台 | 应用生物系统公司 | Model ABI 7500 | |
| 光学96孔反应板 | 赛默飞世尔科技 | 货号 4316813 | |
| MicroAmp 透明粘性膜 | 赛默飞世尔科技 | 货号 4306311 |
参考文献
- Isakbaeva, E. T., et al. Norovirus transmission on cruise ship. Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).
- Lopman, B. A., Gastañaduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinjé, P. Environmental transmission of norovirus gastroenteritis. Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).
- Malek, M., et al.
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重印与许可
